JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Ferrik klorit indüklenen fare tromboz modellerinde

Published: September 05, 2016
doi:
10.3791/54479
, ,
1Department of Cellular and Molecular Medicine,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine,Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology,Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University

Summary

Biz trombüsler oluşumunu tıkayıcı zaman izlemek için intravital mikroskopi kullanılarak etkin bir şekilde karakterize bir rafine demir klorür (FeCl3) karotis ve mezenterik arter üzerinde indüklenen trombozu modelleri prosedürü yanı sıra damar, rapor.

Abstract

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introduction

Arter trombozu (kan pıhtısı) ateroskleroz, diyabet, obezite, kanser ve kronik otoimmün romatolojik bozukluklar gibi kronik inflamasyon ile ilişkili birçok sistemik hastalığın sık görülen bir komplikasyondur. uygunsuz trombosit aktivasyonu, agregasyonu ve sonraki coagulatory mekanizmalarından arteriyel dolaşım kök meydana ve trombüs kalp krizi, felç ve ekstremite kaybına neden oluyor. Damar duvarı damar duvarındaki kan hücreleri, hormonlar ve sitokinler yanı sıra antioksidan proteinlerin ifadesini dolaşan, birden fazla hücre tiplerini içerir ve kayma gerilmesi dahil dışsal faktörlerin çok sayıda etkilenir karmaşık bir sistemdir. In vitro deneyler çoğaltma yapamaz Bu kompleks bir ortam ve bu nedenle, hayvan modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, trombotik hastalıklarda yer alan mekanizmaların daha iyi anlaşılması izin vermek için çok önemlidir.

Fareler sim sahip olduğu gösterilmiştirtromboz, ateroskleroz, enflamasyon ve diyabet 1,2 açısından insanlara Ilar mekanizmaları. Ayrıca, transjenik ve knockout farelerde kompleks fizyolojik veya patolojik bir ortamda belirli bir gen ürünlerinin işlevi test etmek için oluşturulabilir. Bu tür çalışmalar, insan patoloji taklit ve yeni yollar ve tedavilerin, keşif ile ilgili önemli mekanistik bilgi vermek yanı sıra tromboz uyuşturucu etkileri karakterize önemli ayrıntıları sağlayabilir.

Patolojik arteriyel trombüs subendotelyal matrise 3,4 katman yaralanma veya disfonksiyon ve kan akışının pozlama endotel nedeniyle oluşur. Çeşitli tromboz modelleri, mekanik yaralanma, photoreactive bileşik Rose Bengal tabanlı oksidatif hasarı ve lazer yaralanması 5 olarak bu endotel hasarına neden geliştirilmiştir. Bu spektrumda, Demir klorür (FeCl3) vasküler yaralanma tromboz yaygın olarak kullanılan modeldir indüklenen. Bu reaktif olduğundadamarların dış alana uygulanabilir trombositleri ve pıhtılaşma kademeli dizisinin parçalarına dolaşımdaki endotel hücre koruma kaybı, vasküler hücreler 6-8 oksidatif hasarı neden olur. FeCl3 modeli basit ve hem antikoagülan ve anti-trombosit ilaçlara duyarlı olduğunu ve fareler, sıçan, kobay ve tavşan 6-15 yılında karotis ve femoral arterler, şahdamarından ve mezenterik ve kremasterik arteriyollerde ve venüllerden üzerinde yapılmıştır.

Bu modelde biri ölçülebilir bir parametre Doppler debimetre ile veya Intravital mikroskopi 6,7,9 doğrudan gözlem altında kan akımının kesilmesi olarak ölçülen damar tıkanıklığı, tamamlamak için yaralanma geçen süredir. 5 ila 30 dakika arasında zaman bir dizi işaret, C57BL6 farelerine 7-10,16 farklı çalışmalarında rapor edildiği FeCl3 konsantrasyonları, anestezi cerrahi teknikler, fare yaş, genomik arka, b, ölçüm yönteminin türleriLood akışı ve diğer çevresel değişkenler, bu modelde anlamlı bir etkiye sahiptir. Bu geniş değişkenlik zor farklı araştırma gruplarından çalışmaları karşılaştırmak ve ince farklılıkların tespiti zor hale getirebilir yapar.

Böyle bir değişkenliğe en aza indirmek ve in vivo model sisteminde bir homojen tekrarlanabilir kurmak için bir vizyon ile, minimal değişiklik 6-10,16-19 ile son derece tekrarlanabilir veri yapar FeCl3 indüklenen karotid arter modeli rafine. Bu yazıda tarif ve becerilerini paylaşmak ve bu model yararlanabilir birkaç temsilci deneysel rapor örnekleri.

Protocol

Tüm prosedürler ve hayvanların manipülasyonlar Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi İnsani Bakım Politika ve Hayvanların Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ve uygun Cleveland Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuar Hayvanlarının kullanımı. 1. Hazırlıklar: Etiketleme plateletler için floresan boya tuzlu su içinde, rodamin 6G çözeltisi, 0.5 mg /…

Representative Results

Karotis Arter Trombozu Modeli C57BL6 kökenli farelerde, biz bir başlangıç ​​noktası olarak 1 dakika boyunca gemi tedavisi için% 7.5 FeCl 3 kullanmanızı öneririz. % 7.5 tedavisi FeCl3 altında, yaralı alanı ve normal damar duvarında sınırları kolayca (Bkz online video 1) mikroskop altında tespit edilir, endotel tabakası önemli ölçüde hasar gördü düşündürmektedir. Trombüs FeCl3 tedavi …

Discussion

FeCl3 indüklediği modeli trombosit fonksiyonu ve tromboz 7,8,16,19,31-33 genetik değişiklikler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir sadece en yaygın olarak kullanılan tromboz modellerinde biridir, ama aynı zamanda değerli bir araç olabilir aterotrombotik hastalıkların 11,17,34-37 tedavisi ve önlenmesi için terapötik bileşikler ve stratejiler değerlendirilmesi için. Burada biz modifikasyonları ve bu modelin iyileştirmeler gösterildiği antikoagülan (tPA), anti-tr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Surgical Scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J., et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K., Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Tags

Keywords: Ferric Chloride-induced ThrombosisMouse Carotid Artery ModelIntravital MicroscopyPlatelet ActivationThrombosisAnticoagulantAntiplatelet DrugsPathophysiology Of ThrombosisNovel DrugsTargeted NanomedicineFur RemovalSurgical IncisionJugular Vein DissectionRhodamine 6G Solution
check_url/54479?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image