Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose
Summary
Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico (FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.
Abstract
Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.
Introduction
trombose arterial (coágulo de sangue) é uma complicação comum de muitas doenças sistêmicas associadas à inflamação crônica, incluindo a aterosclerose, diabetes, obesidade, câncer e doenças reumatológicas auto-imunes crônicas. Trombos que ocorrem no tronco circulação arterial a partir inadequado ativação plaquetária, agregação e mecanismos coagulante subsequentes e estão implicados em ataques cardíacos, derrames e perda de extremidade. A parede do vaso é um sistema complexo que inclui vários tipos de células e é influenciada por uma multitude de factores extrínsecos, incluindo tensão de corte, as células sanguíneas, hormonas e citocinas, bem como a expressão de proteínas antioxidantes que circula na parede do vaso. Experiências in vitro não pode replicar neste ambiente complexo e, por conseguinte, em estudos in vivo utilizando modelos animais são críticos para permitir uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em doenças trombóticas.
Os ratos têm mostrado ter SIMmecanismos lhantes aos seres humanos em termos de trombose, aterosclerose, inflamação e diabetes 1,2. Além disso, camundongos transgênicos e knockout podem ser criados para testar a função de produtos de genes específicos em uma fisiológica complexa ou ambiente patológico. Tais estudos imitar patologia humana e pode fornecer informações mecanicista importante relacionado à descoberta de novos caminhos e terapias, bem como fornecer detalhes importantes na caracterização de efeitos de drogas sobre a trombose.
Trombos arteriais patológicas ocorrer devido à lesão endotelial camada ou disfunção e a exposição do fluxo de sangue para a matriz subendotelial 3,4. Vários modelos de trombose foram desenvolvidos para induzir esse dano endotelial tais como dano mecânico, dano oxidativo baseado em Bengal composto fotorreativa Rose e ferimentos de laser 5. Neste espectro, cloreto férrico (FeCl3) induzida por lesão vascular é um modelo amplamente usado de trombose. Este reagente quandoaplicada ao aspecto exterior dos navios induz danos oxidativos para células vasculares 6-8, com a perda da protecção de células endoteliais a partir de plaquetas e componentes da cascata de coagulação circulantes. O modelo FeCl3 é simples e sensível para ambos os anticoagulantes e anti-plaquetas drogas, e foi realizada em artérias carótida e femoral, veias jugulares e mesentérica e arteríolas cremastérico e vênulas em ratinhos, ratos, cobaias e coelhos 6-15.
Um parâmetro mensurável neste modelo é o tempo decorrido de uma lesão para completar oclusão do vaso, medida como a cessação do fluxo sanguíneo com um medidor de fluxo de Doppler ou sob observação directa com 6,7,9 microscopia intravital. Uma gama de tempos de entre 5 a 30 min tem sido relatada em diferentes estudos em ratinhos C57BL6 7-10,16, sugerindo que as concentrações de FeCl 3, tipos de anestesia, técnicas cirúrgicas, idade rato, fundo genómico, método de medição bfluxo lood, e outras variáveis ambientais têm efeitos significativos neste modelo. Esta ampla variabilidade faz com que seja difícil comparar estudos de diferentes grupos de pesquisa e pode fazer a detecção de diferenças sutis difícil.
Com uma visão para minimizar tais variabilidades e estabelecer um uniforme reprodutível em sistema de modelo vivo, temos refinado o modelo de artéria carótida induzida por FeCl3 que faz com que os dados altamente reproduzíveis com o mínimo de variação 6-10,16-19. Neste artigo descrevemos e compartilhar as habilidades e relatar vários exemplos experimentais representativos que podem beneficiar a partir deste modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O FeCl3 induzida pelo modelo é um dos modelos mais amplamente utilizados de trombose, que não só pode fornecer informações valiosas sobre as modificações genéticas na função das plaquetas e trombose 7,8,16,19,31-33, mas também pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação de compostos terapêuticos e estratégias para o tratamento e prevenção das doenças aterotrombóticas 11,17,34-37. Aqui temos mostrado nossas modificações e aperfeiçoamentos do presente modelo e mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Surgical Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
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