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Medicine

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

Published: September 05, 2016
doi:
10.3791/54479
, ,
1Department of Cellular and Molecular Medicine,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine,Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology,Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University

Summary

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

Abstract

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introduction

동맥 혈전증 (혈전)는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 비만, 암,자가 면역 만성 류마티스 질환을 포함한 만성 염증과 관련된 다양한 전신 질환의 일반적인 합병증이다. 부적절한 혈소판 활성화, 집계 이후 coagulatory 메커니즘에서 동맥 순환 줄기에 발생하며 혈전은 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 ​​손실에 연루되어있다. 혈관벽은 혈관벽에 혈액 세포, 호르몬 및 사이토킨뿐만 아니라 항산화 단백질의 발현을 순환하는 다수의 세포 유형을 포함하고, 전단 응력을 포함 외적 요인의 다수에 의해 영향 복잡한 시스템이다. 시험 관내 실험에서 복제 할 수없는 이 복잡한 환경 때문에 동물 모델을 이용한 생체 내 연구는 혈전 성 질환에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록하는 것이 중요하다.

마우스는 SIM이 밝혀졌다혈전증, 동맥 경화, 염증과 당뇨병 1,2의 관점에서 인간 ILAR 메커니즘. 또한, 유전자 녹아웃 마우스는 복잡한 생리 학적 또는 병리학 적 환경에서 특정 유전자 산물의 기능을 테스트하기 위해 생성 될 수있다. 이러한 연구는 인간의 병리를 모방하고 새로운 경로 및 치료법의 발견에 관한 중요한 기계론의 정보를 제공 할뿐만 아니라 혈전증에 약물 효과를 특징 짓는 중요한 정보를 제공 할 수있다.

병적 동맥 혈전은 피하 매트릭스 3,4에 층을 손상 또는 기능 장애와 혈류의 노출을 내피로 인해 발생합니다. 다양한 혈전증 모델 기계적 손상, 광 반응성 화합물 로즈 벵갈 계 산화 적 손상 및 레이저 손상이 5로 내피 세포의 손상을 유도하기 위해 개발되었다. 이 스펙트럼에서는, 철 클로라이드 (50ml을 3) 혈관 손상은 혈전증 널리 사용 유도 된 모델이다. 이 시약 때용기의 외 측면에인가 된 혈소판 및 응고 캐스케이드의 요소를 순환에서 내피 세포의 보호 상실, 혈관 세포 6-8에 산화 손상을 유발한다. 50ml을 모델은 간단하고 모두 항응고제 및 항 혈소판 약물에 민감하고, 쥐, 쥐, 기니피그와 토끼 6-15에서 경동맥과 대퇴 동맥, 경정맥 및 장간막과 cremasteric 세동맥과 세정맥에 수행되었습니다.

이 모델에서 하나의 측정 매개 변수는 도플러 유량계 또는 생체 내에 현미경 6,7,9 직접 관찰에서 혈류의 중단으로 측정 혈관 폐색을 완료 부상에서 경과 된 시간입니다. 5 ~ 30 분 사이의 시간의 범위를 제안 C57BL6 마우스 7-10,16 다른 연구에서보고 된 50ml을 그 농도 마취 수술 기법 마우스 연령, 게놈 배경 B의 측정 방법의 종류흐름들 (100d), 및 기타 환경 변수는이 모델에서 중요한 효과를 가지고있다. 이 넓은 다양성 어려운 다른 연구 그룹에서 연구를 비교하고 미묘한 차이의 검출이 어려워 질 수 있습니다.

이러한 변화 성을 최소화하고 생체 내 모델 시스템에서 균일하게 재현을 확립하는 시각과 함께, 우리는 최소의 변형 6-10,16-19 매우 재현성있는 데이터를 만든다 50ml을 유도 된 경동맥 모델을 정제했다. 본 논문에서는 설명하고 기술을 공유하고이 모델에서 혜택을 누릴 수있는 몇 가지 대표적인 실험 예를보고한다.

Protocol

모든 절차와 동물의 조작은 미국 공중 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 및에 따라 클리블랜드 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 실험 동물의 사용. 1. 준비 : 라벨 혈소판에 대한 형광 염료 식염수에, 로다 민 6G 솔루션, 0.5 ㎎ / ㎖를 준비하고 0.22 μm의…

Representative Results

경동맥의 동맥 혈전증 모델 C57BL6 배경으로 마우스에서 우리는 출발점으로 1 분 동안 혈관을 치료하기 위해 7.5 % 50ml을 사용하는 것이 좋습니다. 7.5 %의 치료 50ml을에서 부상 영역과 정상 혈관 벽의 경계는 쉽게 (참조 온라인 비디오 1) 현미경으로 식별, 내피 층이 크게 손상되었음을 시사한다. 혈전은 50ml을 처리 즉시 ?…

Discussion

50ml을 유도 된 모델은 혈소판 기능 및 혈전증 7,8,16,19,31-33의 유전자 변형에 대한 유용한 정보를 제공 할뿐만 아니라, 가장 널리 사용되는 혈전 모델의 하나이며, 또한 유용한 도구가 될 수있다 죽상 혈전증 질환 11,17,34-37의 치료 및 예방을위한 치료 화합물과 전략의 평가. 여기에서 우리는 우리의 수정이 모델의 개선을 표시하고 항응고제 (TPA) 및 항 혈소판 약물 (PAR4 항체)?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Surgical Scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/
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References

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Keywords: Ferric Chloride-induced ThrombosisMouse Carotid Artery ModelIntravital MicroscopyPlatelet ActivationThrombosisAnticoagulantAntiplatelet DrugsPathophysiology Of ThrombosisNovel DrugsTargeted NanomedicineFur RemovalSurgical IncisionJugular Vein DissectionRhodamine 6G Solution
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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).
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