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Medicine

Ferriques murin Thrombose modèles induits par Chlorure

doi: 10.3791/54479 Published: September 5, 2016

Summary

Nous rapportons une procédure raffinée du chlorure ferrique (FeCl 3) Les modèles de thrombose induites sur la carotide et l' artère mésentérique ainsi que la veine, caractérisé efficacement en utilisant la microscopie intravitale pour surveiller le temps de formation de thrombus occlusif.

Introduction

La thrombose artérielle (caillot de sang) est une complication fréquente de nombreuses maladies systémiques associées à une inflammation chronique, y compris l'athérosclérose, le diabète, l'obésité, le cancer et les troubles rhumatologiques auto-immunes chroniques. Thrombus qui se produisent dans la tige de la circulation artérielle de l'activation plaquettaire inappropriée, l'agrégation et les mécanismes coagulatory ultérieurs, et sont impliqués dans les crises cardiaques, accidents vasculaires cérébraux et la perte de l'extrémité. La paroi du récipient est un système complexe qui comprend plusieurs types de cellules et elle est influencée par une multitude de facteurs extérieurs , y compris la contrainte de cisaillement, les cellules sanguines circulantes, des hormones et des cytokines, ainsi que l' expression des protéines anti - oxydantes dans la paroi du vaisseau. Expériences in vitro ne peuvent pas se répliquer cet environnement complexe et donc des études in vivo sur des modèles animaux sont essentiels pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les troubles thrombotiques.

Les souris ont démontré que simmécanismes ilaires aux humains en termes de la thrombose, l' athérosclérose, l' inflammation et le diabète 1,2. En outre, les souris transgéniques et knock-out peuvent être créés pour tester la fonction des produits spécifiques du gène dans un complexe physiologique ou de l'environnement pathologique. De telles études imitent la pathologie humaine et peuvent fournir des informations mécaniste importantes liées à la découverte de nouvelles voies et de thérapies, ainsi que de fournir des détails importants pour caractériser les effets des médicaments sur la thrombose.

Thrombus artériels pathologiques sont dues à une lésion endothéliale de couche ou d'un dysfonctionnement et l' exposition du flux sanguin vers la matrice subendothelial 3,4. Différents modèles de thrombose ont été développés pour induire ces dommages endothéliaux tels que les lésions mécaniques, une lésion par oxydation à base de Bengale composé photoréactif Rose et 5 blessure au laser. Dans ce spectre, le chlorure ferrique (FeCl 3) induite par une lésion vasculaire est un modèle largement utilisé de la thrombose. Ce réactif lorsqueappliquée sur la face externe des vaisseaux induit des dommages oxydatifs des cellules vasculaires 6-8, avec une perte de protection des cellules endotheliales à partir de plaquettes et les composants de la cascade de coagulation en circulation. Le modèle FeCl3 est simple et sensible à la fois des médicaments anticoagulants et antiplaquettaires, et a été réalisée sur la carotide et des artères fémorales, les veines jugulaires et mésentériques et les arterioles crémaster et veinules chez les souris, les rats, les cobayes et les lapins 6-15.

Un paramètre mesurable dans ce modèle est le temps écoulé de la blessure à l' occlusion complète du vaisseau, mesurée comme la cessation de l' écoulement sanguin avec un débitmètre doppler ou sous observation directe avec la microscopie intravitale 6,7,9. Une plage de temps comprise entre 5 et 30 min a été rapporté dans plusieurs études chez des souris C57BL6 7-10,16, ce qui suggère que FeCl 3 concentrations, les types d'anesthésie, les techniques chirurgicales, l' âge de la souris, fond génomique, la méthode de mesure de bflux lood, et d'autres variables environnementales ont des effets significatifs dans ce modèle. Cette grande variabilité rend difficile de comparer les études de différents groupes de recherche et peut détecter des différences subtiles difficiles.

Une vision de minimiser ces variabilités et établir une manière uniforme et reproductible dans un système de modèle in vivo, nous avons affiné le modèle d'artère carotide FeCl 3 induite par le fait que les données hautement reproductibles avec une variation minimale 6-10,16-19. Dans cet article, nous décrivons et partageons les compétences et présentons plusieurs exemples expérimentaux représentatifs qui peuvent bénéficier de ce modèle.

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Protocol

Toutes les procédures et les manipulations des animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l' utilisation des comités (IACUC) de la Cleveland Clinic, conformément à la politique des États-Unis Service de santé publique sur les soins Humane et l' utilisation des animaux, et le NIH Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparatifs:

  1. Dye Fluorescent pour l' étiquetage des plaquettes
    1. Préparer une solution 6G rhodamine, 0,5 mg / ml dans une solution saline et de stériliser la solution avec filtre de 0,22 um.
  2. Une solution de FeCl3
    1. Faire une solution mère fraîche de 30% FeCl 3 (anhydres, est égal à 1,85 M) dans de l' eau pure, et le filtre avec 0,45 um filtre. Préparer 5 ml fraîche solution de FeCl3 à la concentration désirée [par exemple, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) et 12,5% (0,771 M)] de la dilution de la solution de FeCl3 avec de l' eau i 30%na 6 cm boîte de culture de tissus et de garder le couvercle fermé.
      REMARQUE: Utilisation de la boîte de culture, il est plus facile de ramasser le papier filtre saturé avec FeCl3 solution que de le ramasser à partir d' un récipient étroit, comme un tube de 1,5 ml. FeCl3 est extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et une blouse de laboratoire, etc., équipement de protection individuelle, doit toujours être pris.
  3. Papiers filtres
    1. Couper le papier filtre à 1 mm x 2 mm de taille. Faire tremper suffisamment de morceaux de papier filtre de coupe dans la solution de FeCl 3 dans le même plat.
  4. Papavérine Hydrochloride Solution
    1. Préparer une solution de chlorhydrate de papaverine (25 mg / ml) dans de l'eau et de stériliser la solution avec filtre de 0,22 um.
  5. Gel d' agarose
    1. Préparer un gel d'agarose à 2% dans du PBS ou une solution saline à 6 puits une plaque de culture tissulaire, ~ 1 cm d'épaisseur, et cut à demi-cercle avec cm de diamètre ~ 3.

2. FeCl3 Induced carotidienne Arterial Injury Thrombose Modèle

  1. Interventions chirurgicales pour le modèle Thrombosis
    1. Utilisez 8 - souris C57BL6 12 semaines (ou d'autres souches que nécessaire). Anesthésier les souris avec le mélange de kétamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) par injection intrapéritonéale. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par orteil pincement.
      NOTE: Ce montant de la kétamine / xylazine est suffisante pour maintenir l'animal en anesthésie stable et sans douleur (réponse aux pieds pincement) pendant au moins 1 h.
    2. Retirez la fourrure sur le cou et la poitrine avec une petite tondeuse électrique animal. Crème dépilatoire est pas nécessaire. Appliquer neutre pommade oculaire de pétrole sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
    3. Fixer la souris dans la position couchée sur le couvercle de 15 cm de la plaque de culture de tissu. Utilisez une longue bande (~ 10 cm) pour fixer hinmembres d et le bas du corps, et deux morceaux de petite bande (2 cm x 0,5 cm) pour fixer les pattes antérieures. Utilisez un fil de suture 4-0 pour envelopper les incisives, du ruban adhésif les deux extrémités de la suture sur le couvercle pour maintenir le cou de la souris droite (Figure 2).
    4. Placer la plaque avec la tête de la souris vers l'opérateur sous une source de lumière chirurgicale.
    5. Stériliser le site chirurgical avec un tampon d'alcool. Utilisez les micro-Adson Forceps pour maintenir la peau et d'utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision (2 - 3 mm).
    6. Maintenir la peau de l'incision avec la pince et insérer des ciseaux chirurgicaux avec mâchoires fermées dans l'incision. Poussez les ciseaux sous-cutanée vers le manubrium ou le menton, puis ouvrir les ciseaux pour libérer la peau de la couche sous-cutanée.
    7. Couper la peau avec des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiane du manubrium au niveau de l' os hyoïde (figure 3A et 3B). Carrément disséquer le fascia mince (ligne pointillée, en (figure 3B et 3C; flèches bleues).
      NOTE: Le manubrium (flèche noire sur la figure 3C) et la trachée (T à la figure 3C) seront vus après cette étape.
    8. Tenir les tissus mous et la peau vu à droite de la manubrium avec la pince Graefe, insérez le hémostatique sous le fascia vers la position 2 heures (ligne jaune en pointillés sur la figure 3C), ouvrir les mâchoires de la pince hémostatique pour libérer le veine jugulaire du tissu environnant.
    9. Couper le fascia, des tissus mous et de la peau vers la position 2 heures (figure 3C) avec les ciseaux chirurgicaux pour exposer la veine jugulaire droite (Figure 3D, flèche).
    10. Dessinez environ 200 - solution 6G 300 ul de rhodamine en utilisant une seringue de 1 ml avec 22 aiguille G, puis le changementà 30 aiguille G.
      NOTE: Cela protège l'aiguille 30 G contre les dommages de sa pointe fine. dessin directement la solution rhodamine 6G avec l'aiguille 30 G ne sera pas endommager la pointe; toutefois toucher la paroi du récipient accidentellement causera des dommages, ce qui peut rendre difficile l'injection.
    11. Rincer l'aiguille de 30 G en poussant lentement la solution 6G rhodamine, assurez-vous pas de bulles d'air dans la seringue ou l'aiguille. Gardez 100 solution 6G ul de rhodamine pour injection.
    12. Bend 2 - 3 mm pointe de l'aiguille à un angle de 90 ° avec le porte-aiguille, qui permettra d' éviter d' insérer l'aiguille trop profond pour la veine jugulaire et rend l'injection plus facilement contrôlée (Figure 3D).
    13. Injecter la solution rhodamine 6G dans la veine jugulaire droite aux plaquettes de l'étiquette. Pour stabiliser la seringue et maintenir l'aiguille en position, tenez la seringue d'une main et l'aiguille avec la pince Graefe avec une autre main pendant le injection.Afinjection de ter, serrer le site d'injection avec la pince Graefe pour éviter les saignements.
    14. Ouvrir les mâchoires de la pince hémostatique et l'insérer sous les pinces Graefe pour serrer la paroi du vaisseau du site d'injection, puis ligaturer le site d'injection avec une suture 6-0.
      NOTE: Comme une alternative de l' étape 2.1.15, en appliquant une pression sur le site d'injection avec un doigt pendant 2 minutes va arrêter le saignement; Cependant, cette méthode présente un risque de causer des saignements si le caillot au niveau du site d'injection est retiré accidentellement plus loin.
    15. Carrément disséquer les tissus mous et fascia autour de la glande sous - maxillaire gauche avec le hémostatique et la pince Graefe et tirez la glande vers la position 7 heures (Figure 3E) pour exposer le muscle sterno gauche (flèche bleue dans la figure 3E).
    16. Carrément disséquer le fascia (Figure 3E, ligne pointillée) entre le muscle sterno gauche et le muscle omo - hyoïdien ou sternohymuscle oid (Figure 3E, flèche verte) situé sur le site gauche de la trachée avec le hémostatique.
    17. Passez une aiguille avec une suture de soie 6-0 (environ 15 cm de long) sous le milieu du muscle sterno (flèche bleue dans la figure 3E), mettre les deux extrémités de la suture ensemble et tirer la suture latéralement vers la position 10 heures .
      NOTE: Cette procédure doit être effectuée avec précaution pour éviter les blessures de la veine jugulaire gauche, qui est situé en dehors du muscle sterno.
    18. Carrément séparer le muscle sterno mince et / ou de muscle omo - hyoïdien pour exposer l'artère carotide (CA) (Figure 3F flèche) après avoir tiré loin du muscle sterno. Coupez le muscle sterno et / ou de muscle omo-hyoïdien que nécessaire. Utilisez le hémostatique pour séparer les tissus mous de CA sans toucher le CA.
      NOTE: CA est accompagné par le nerf vague, la structure blanche vu dans figure 3F).
    19. Utilisez une pince fine pointe pour ramasser le fascia latéral autour du CA, tout en évitant le nerf vague et CA. Utilisez une autre pince fine pointe pour percer un trou sur le fascia entre le CA et le nerf vague.
    20. Passez le crochet à travers le trou et soulevez doucement le CA, puis placer la pince fine pointe sous la CA. Déplacer le crochet et pince dans des directions opposées le long de la CA pour dépouiller les tissus mous adventice. Gratuit au moins ~ 5 mm de longueur de CA (Figure 3H, flèche bleue) du tissu environnant.
    21. Pour bloquer la fluorescence de fond, appuyez sur la fin d'un plastique agitateur de café noir plat, recoupé l'agitateur de café dans une pièce de 3 mm, puis couper longitudinalement le long des arêtes de pliage pour obtenir deux morceaux de "U" en plastique (Figure 3H, vert flèche).
    22. (Figure 3H, flèche verte). Appliquer immédiatement 2-3 gouttes de solution saline pour éviter le dessèchement du CA.
  2. En temps réel Enregistrement vidéo
    1. Transférer le couvercle de la souris et de la plaque ensemble pour la platine du microscope et placer dans une position appropriée sous la lentille d'eau 10X. Remplir l'espace entre la lentille et l'AC 10X avec du sérum physiologique.
    2. Démarrez l'application de logiciel d'enregistrement vidéo numérique, et de lancer un nouveau fichier et nommez-le en conséquence. Enregistrez les images des vaisseaux normaux et notez le numéro de l'image lorsque l'enregistrement vidéo est arrêté.
      NOTE: Référence du logiciel d'enregistrement vidéo dans l'ordinateur pour l' enregistrement. Nous utilisons un logiciel d'enregistrement vidéo numérique et les descriptions suivantes sont basées sur cette application.
      NOTE: Depuis tra mécaniqueuma peut blesser l'endothélium et conduire à la formation de thrombus 20, il est nécessaire de confirmer qu'il n'y a pas de blessure chirurgicale à la paroi du vaisseau avant la blessure FeCl 3. Il est également nécessaire de confirmer qu'il n'y a pas de reste de tissu autour de l'autorité de certification, ce qui peut constituer une barrière et d' atténuer l'effet de la lésion induite par le FeCl 3. Notez le numéro de l'image des enregistrements, il sera facile d'analyser les vidéos selon le temps écoulé plus tard.
    3. Déplacez la souris avec couvercle de la plaque sur la lentille 10X. Pliez un coin d'une serviette en papier pour faire une pointe fine et fine et l'utiliser pour éponger soigneusement la solution saline dans le CA (évitez de toucher CA), ainsi que dans d'autres endroits dans le domaine chirurgical. Ceci est important pour éviter la dilution de la solution de FeCl 3 utilisé.
    4. Utilisez une pince fine pointe et ramasser un morceau de papier filtre saturé avec une solution de FeCl3 et le placer directement sur ​​le CA et le garder sur place pendant 1 min.
      NOTE: To la visualisation de l' aide de la circulation sanguine et de la récolte des données précises, placez le papier filtre à proximité de l'extrémité distale de l'exposé CA (Figure 3I) et laisser un court segment sur ​​le site proximal (flèche verte dans la figure 3I) pour observer le flux sanguin à la fin phase (voir ci-dessous).
    5. Retirez le papier filtre (ce point de temps est défini comme étant le début de "après la blessure") et rincer le CA avec une solution saline (au moins 2 ml).
    6. Placez la souris avec plaque couvercle vers l'objectif 10X; observer le navire et commencer à enregistrer des images vidéo. Notez le numéro de l'image vidéo à la fin de la première minute d'enregistrement.
      NOTE: La formation de thrombus est identifié par l' accumulation des plaquettes fluorescentes, qui est observée dans les images vidéo en temps réel sur l' écran d'ordinateur ou sous microscope. images vidéo d'enregistrement immédiatement après avoir mis la souris en arrière sous le microscope. Continuer l'enregistrement à la fin de la première minute après le retrait du fpapier ilter. Observer le navire entier de l'extrémité distale vers les sites proximaux pour obtenir des informations sur la blessure, puis se concentrer sur la zone d'intérêt (est habituellement le centre de la zone lésée) pour plus d'imagerie.
    7. Enregistrez des images vidéo pendant 10 secondes toutes les minutes pendant les 10 premières minutes (par exemple, 2:55-3:05), puis 10 secondes toutes les minutes jusqu'à la fin de l'expérience. Notez les numéros de châssis lorsque chaque enregistrement est arrêté.
      NOTE: Les points du modèle d'extrémité sont: 1) lorsque le flux sanguin a cessé de> 30 sec; ou 2) si l'occlusion ne se voit pas à 30 minutes après la lésion. Dans ce cas, utiliser 30 min pour l'analyse statistique. Set Temps d'exposition de l'enregistrement vidéo en 10 msec au début, de sorte qu'il sera facile d'observer le flux sanguin dans le thrombus. Lorsque les thrombus deviennent grandes et la fluorescence saturent le capteur de l'appareil photo, il devient difficile d'identifier le flux de sang sur thrombus. Pour résoudre ce problème, déplacez le CE d'imagerienter sur le site indemne de proximal (Figure 3I, flèche verte) où le flux sanguin peut encore être clairement observé. Nous augmentons aussi le temps Expose à 15 ou 20 msec lors de la focalisation sur le site non-blessé proximale, de sorte que le flux sanguin peut être observé plus clairement. Lorsque le flux sanguin cessera, de nombreuses cellules plus grandes (leucocytes) commencent à rouler sur la paroi du vaisseau sur le site proximal du thrombus. Écoulement arrête habituellement dans les 2 - 3 min après l'apparition de grandes cellules. Notez le temps Exposer sur la feuille d'enregistrement si elle est modifiée. Cela prend habituellement environ 30 minutes de l'anesthésie à la fin de l'expérience, si les souris C57BL6 de type sauvage normaux ont été utilisés.
      ATTENTION NOTE: Ne pas utiliser le blanc agrégé plaquettaire caillot comme le signe de la cessation du flux sanguin, ce qui ne donnera pas une donnée précise et elle est affectée par le temps d'exposition. Le caillot blanc couvert la lumière du vaisseau ne signifie pas que le flux sanguin cessé (voir la vidéo représentant 1).

3. FeCl3 Induced artère mésentérique / Thrombose veineuse Modèle

  1. Anesthetize 8 - souris C57BL6 12 semaine mentionné dans la section 2.1.1. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
  2. Injecter solution papavérine (total de 0,4 mg / souris) par voie intrapéritonéale pour inhiber l'intestin péristaltisme.
  3. Retirez la fourrure sur le cou et l'abdomen avec une tondeuse électrique animal. Crème dépilatoire est pas nécessaire.
  4. Fixer la souris dans la position couchée sur le couvercle de 15 cm de la plaque de culture de tissu. Utilisez quatre morceaux de petite bande (2 cm x 0,5 cm) pour sécuriser toutes les jambes. Utilisez un fil de suture 4 -0 à enrouler autour des incisives, du ruban adhésif les deux extrémités de la suture sur le couvercle pour maintenir le cou droit (figure 2).
  5. Suivre les procédures 2.1.4 -2.1.15 pour exposer la veine jugulaire pour l'injection de rhodamine 6G aux plaquettes de l'étiquette.
  6. Effectuer une incision médiane à travers la peau de xiphoid à bas de l' abdomen à l' aide des ciseaux chirurgicaux (figure 4A). Décrochez le péritoine du milieu (aussi appelé linea alba, la figure 4A, flèche) avec une pince Graefe, qui est claire et a pas de vaisseaux sanguins, lever environ 2 - 3 mm de haut, confirment pas l' intestin sous la ligne de coupe, et couper le péritoine ouvert longitudinalement avec les ciseaux fins (figure 4B).
  7. Re-fixer les souris à la position latérale droite. Placer le gel d'agarose demi-cercle près de l'abdomen, et extérioriser doucement les intestins et l' étaler sur le dessus du gel avec la pince Graefe (Figure 4C). Utilisez les deuxièmes branches pour l'expérience de la thrombose (figure 4C, flèche).
    REMARQUE: Utilisez la pince hémostatique ou une pince Micro-Adson pour aider à extérioriser les intestins. Évitez de blesser lel'intestin et le récipient.
  8. Placer 5-6 gouttes du sérum physiologique pour garder l'humidité de l'intestin et des vaisseaux. Transférer la souris avec le couvercle de la plaque ensemble pour la platine du microscope et placer en position appropriée sous la lentille sèche 10X.
    REMARQUE: Utilisez un objectif à sec parce que la membrane jéjuno - iléal ne peut pas tenir la solution saline. Assurez-vous de déposer une solution saline sur les tissus exposés pour les garder humides.
  9. Tamponnez la solution saline autour de l'artère mésentérique et la veine avant le traitement.
  10. Utilisez une pince fine pointe pour ramasser un morceau de papier filtre saturé avec 12,5% d'une solution de FeCl 3 et le placer directement sur ​​l'artère mésentérique et la veine pendant 1 min (Figure 4D). Retirez le papier du filtre (ce point de temps est défini comme étant le début de "après une blessure") et rincer l'artère mésentérique blessés et de la veine avec une solution saline (au moins 2 ml).
  11. Placez la souris avec plaque couvercle arrière sous la lentille sèche 10X; observer les navires et commencer à recimages vidéo ord comme mentionné dans 2.2).
    NOTE: Les points de cette expérience d'extrémité sont: 1) lorsque le flux sanguin a cessé de> 30 sec; ou 2) si l'occlusion ne se voit pas en 30 min après une blessure, et dans ce cas utiliser 30 min pour l'analyse statistique.
  12. A la fin de l'expérience, euthanasier les souris en utilisant une surdose de kétamine / xylazine (200/20 mg / kg), suivie par dislocation cervicale après pas de souffle et le cœur battant sont confirmées.

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Representative Results

Carotidienne Thrombose Modèle
Chez les souris avec C57BL6 fond, nous recommandons d' utiliser 7,5% FeCl 3 pour traiter la cuve pendant 1 min en tant que point de départ. Sous traitement de 7,5% FeCl 3, les frontières de la zone lésée et la paroi du vaisseau normal sont facilement identifiables au microscope (voir la vidéo en ligne 1), ce qui suggère que la couche endothéliale a été considérablement endommagé. Le thrombus formé immédiatement après FeCl3 traitement, et on observe dans tous les WT C57BL6 souris 1 min après une blessure. Les thrombus initialement formés sont instables et parties d'entre eux sont généralement emportés par le flux sanguin, de sorte que les thrombus formés deviennent plus petits à 2 - 3 min après une blessure. Thrombus commencer à agrandir 3-4 min après avoir retiré le papier filtre et ces thrombus plus tard formés sont stables et ne sont généralement pas emporté. Le temps moyen occlusif est de 11,3 ± 3,16 min chez les souris C57BL6 (n = 14) quand 7,5% de FeCl 3 est utilisé 6,7,19 (figure 5A et vidéo en ligne 1). Dans les études précédentes , nous avons démontré que la diminution et l' augmentation à la fois de FeCl 3 concentrations diminuent la différence entre une souche de souris anti-thrombotiques et des souris WT 6; D'après notre expérience, le traitement de l'artère carotide avec 7,5% FeCl 3 pendant 1 min est suffisante pour satisfaire tous nos besoins. En plus de tester la fonction des gènes spécifiques en utilisant des souris knock - out 7,8,16,19,21, après quatre expériences représentatives utilisant ce modèle:

Perfusion intraveineuse de type activateur tissulaire du plasminogène Mediated thrombolyse
L' activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) est l' un des médicaments approuvés par la FDA pour le traitement de la thrombolyse aux Etats-Unis 22. Nous avons observé ainsi la thrombolyse induite par le tPA dans le modèle de thrombose de l'artère carotide. thrombose étaitinitiée avec 7,5% de FeCl 3 et on le laisse se former pendant 5 min avant le tPA (1 mg / kg de poids corporel) a été perfusé par l' intermédiaire d' un cathéter de la veine jugulaire (22GA). Comme cela est représenté sur la figure 5B et la vidéo en ligne 2, le thrombus continuellement occupé grossie et environ 50% de la lumière 5 minutes après la lésion. Le thrombus a continué à agrandir après tPA perfusion suggérant que le tPA ne modifie pas l'activation et l'agrégation plaquettaire. Thrombolyse a commencé environ 4 minutes après l'injection tPA. Les thrombus formés sont révélés subir des variations de taille de manière répétée pendant la période d'observation de 30 minutes et aucune occlusion des vaisseaux produit dans ce cas. Ces données montrent clairement que le tPA peut pas empêcher complètement la formation de thrombus plaquettaire induite par, même si elle conduit à la thrombolyse. Par conséquent, nous envisageons que les expériences futures en utilisant le modèle induit par le FeCl 3 , de la thrombose artérielle peut être utilisé pour évaluer thrombolytique et d' autres thérapies d' appoint qui peut avoir un prev proéminenteffet sur la repré- formation de thrombus.

Perfusion de PAR4 anticorps à des souris Inhibe Thrombosis
Protease activated receptor 4 (PAR4) est un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) sur les plaquettes qui est activé par clivage protéolytique de son extrémité N-terminale exodomaine 23 et conduit à des étapes de l' activation plaquettaire par la suite. Le laboratoire Nieman a généré une chèvre polyclonaux PAR4 anticorps (CAN12) qui cible le cluster anionique de PAR4, et retarde PAR4 clivage, affectant ainsi une étape critique pour PAR4 médiée activation plaquettaire 24. Par perfusion de 1 mg / kg de cet anticorps à des souris C57BL6, nous avons trouvé que l' inhibition de PAR4 coupure prolongée de manière significative les temps de occlusive formation de thrombus dans le FeCl 3 carotide induite modèle de thrombose de l' artère de 7,5% (figure 5C et vidéo en ligne 3). Ceci démontre que le FeCl 3 induite par le modèle de thrombose cun être utilisé pour évaluer les effets des agents anti-plaquettaires et de caractériser des stratégies thérapeutiques potentielles.

Ciblage spécifique de thrombus Nanoparticules médiée
caillot retrait rapide pour rétablir le flux sanguin est crucial dans le traitement des maladies vasculaires occlusives, y compris accident vasculaire cérébral ischémique et l'infarctus du myocarde. la délivrance systémique de médicaments thrombolytiques tels que le tPA a montré ci-dessus, peuvent lyser le thrombus formé, mais ne peut pas empêcher complètement l'activation des plaquettes et réagrégation / occlusion. En outre, la livraison directe systémique de ces agents de serine protease peut conduire à une action aveugle hors cible, conduisant à des effets secondaires, y compris l'hémorragie. Le laboratoire Sen Gupta a conçu des véhicules de livraison synthétique à base de nanoparticules plaquettaires d'inspiration qui peuvent se lier à des plaquettes et des protéines activées caillot associées sous hémodynamique flux de cisaillement 25-27. Nous avons examiné donc de savoir si ces nanoparticules peuventse lier aux thrombus formant activement dans une artère.

Comme il est mentionné dans l'expérience tPA perfusion, un cathéter a été inséré dans la veine jugulaire et relié à une pompe d'injection pour l'injection de nanoparticules à un débit uniforme. Dans cette expérience, aucun colorant fluorescent a été injecté dans la souris pour marquer des plaquettes. Au lieu de cela, les nanoparticules ont été marquées avec Rohdamine B; par conséquent, ils ont pu être observées au microscope intravitale. La thrombose a été initiée avec 7,5% de FeCl3 traitement pendant 1 min comme mentionné précédemment. Etant donné que chez les souris WT, une quantité importante de thrombus n'a été trouvée pour former 5 minutes après la lésion, nous avons choisi ce point dans le temps pour l'injection de nanoparticules pour détecter si les nanoparticules se lient efficacement aux thrombus formant activement. Comme le montre la figure 5D et vidéo en ligne 4, après l' injection de nanoparticules fluorescentes, nous avons pu identifier une forme de montagnethrombus qui a obtenu progressivement recouverte par les particules fluorescentes. Ces études démontrent l'utilité du FeCl3 modèle de thrombose induite pour évaluer la capacité de ciblage (et l' efficacité thérapeutique ultérieur) des particules de systèmes d'administration de médicaments de la coagulation ciblé.

Rôle des globules rouges autres que les plaquettes dans la formation de thrombus.
Des études récentes ont suggéré que les globules rouges (hématies) jouent un rôle important dans le FeCl 3 induite modèle de thrombose 28 et ils sont le premier composant du sang adhérent à la paroi du vaisseau blessé 29,30. Pour explorer ce phénomène, nous avons appelé hématies avec 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil, 10 pM concentration finale). Les globules rouges marqués au Dil ont été lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans du sérum physiologique avec 35% d'hématocrite. La suspension RBC Dil marqué (100 pi par souris) est injected dans les souris thrombocytopénie qui ont été mortellement irradiées 5 jours avant l'expérience 19. Ces souris thrombocytopénie ont significative des plaquettes, ce qui augmentera les chances de RBC Biding à la paroi du vaisseau, si elles ne diminue. Par contraste avec les expériences en utilisant des plaquettes marquées par fluorescence (figure 5), pas d' accumulation évidente de cellules fluorescentes a été trouvée sur la paroi vasculaire après une lésion vasculaire (figure 6A, ligne v idéo 5). Cependant, en même temps que la formation du thrombus riche en plaquettes, les globules rouges ont commencé à s'accumuler dans le thrombus qui illustre la forme du caillot (figure 6A). La coloration par immunofluorescence de l'artère carotide lésé a montré que les grandes cellules adhérant à la paroi du vaisseau sont des plaquettes (CD41 positif, vert), alors que les globules rouges marqués au Dil sont principalement piégés dans les thrombus (figure 6B et C). Ces études montrent que laFeCl3 modèle de thrombose induite peut être utilisé dans mécanistique obtenir un aperçu sur les composants cellulaires et moléculaires et les événements spatio-temporels dans la formation de thrombus.

Mésentérique Thrombose Modèle
Pour le modèle de thrombose mésentérique, une forte concentration de FeCl 3 (10 à 12,5%) , il est recommandé que les navires sont généralement entourées par les tissus adipeux, ce qui peut entraver le FeCl 3 diffusion vers la paroi du vaisseau et empêche ainsi récipient de FeCl3 induite par 7 blessure. Ce modèle est plus approprié pour l'étude de la thrombose veineuse. Comme on le voit dans la vidéo en ligne 6, le thrombus a été observée dans environ 15 secondes dans la veine mésentérique après application topique du papier filtre saturé avec 12,5% de solution de FeCl3, mais la formation de thrombus est considérablement retardée dans l'artère mésentérique. Le temps moyen pour la formation de thrombus occlusif est ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) m esenteric veine et d' environ 23 ± 9,9 min (n = 10) dans l' artère mésentérique quand 12,5% de FeCl 3 est utilisé 7.

Figure 1
Figure 1. Chirurgie Tools. Les outils nécessaires minimales pour la chirurgie de la souris sont affichées. Voir la liste des matériaux pour plus d' informations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Souris Fixation pour la chirurgie. Fixer la souris sur le 15 cm couvercle de boîte de culture pour le modèle de thrombose de l' artère carotide ou pour l'injection de rhodamine 6G colorant pour le modèle de thrombose mésentérique.obtenir = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. carotidienne Modèle Thrombosis. Procédures pour exposer la veine jugulaire, l' injection de rhodamine 6G Florescent colorant dans le système sanguin et l' exposition de l' artère carotide gauche sont représentés. Dans (A), la ligne indique l'incision du manubrium au niveau de l'os hyoïde; (B), les flèches bleues indiquent les glandes sous - maxillaires, et les lignes en pointillés jaunes représentent le fascia entre les glandes sous - maxillaires; en (C), les flèches bleues indiquent les glandes sous - maxillaires, flèche noire indique manubrium, et la ligne jaune en pointillés indique la position de couper pour exposer la veine jugulaire; (D), flèche bleue indique la veine jugulaire; (E), la flèche jaune indique glande sous - maxillaire gauche, bleu flèche indicates gauche muscle sterno, ligne jaune en pointillés indique fascia, et la flèche verte indique le muscle omo-hyoïdien ou le muscle sterno; en (F), flèche bleue indique l' artère carotide, les lignes en pointillés jaunes montrent le muscle sterno mince et / ou le muscle omo - hyoïdien; dans (G), la flèche bleue indique l' artère carotide et la flèche verte indique nerf vague; dans (H), la flèche bleue indique l' artère carotide et la flèche verte indique le plastique "U" agitateur de café; et (I), la flèche bleue indique le papier filtre situé avec une solution de FeCl3 et flèche verte indique l'artère carotide. T indique la trachée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Artère mésentérique et thrombose veineuse Modèle. L' exposition des vaisseaux mésentériques ainsi que FeCl 3 traitement est indiqué. Dans (A), la flèche bleue indique linea alba, le tissu fibreux blanc sans récipient; En (B), une incision coupé seule la linea alba a été montré; dans (C), les flèches bleues indiquent la deuxième arche des artères mésentériques et les veines; (D), la flèche bleue indique le papier filtre situé avec une solution de FeCl3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Des expériences représentatives utilisant l'artère carotidienne Thrombose modèle. (A). De formation de thrombus dans theC57Bl / 6 souris traitées avec 70,5% de FeCl 3. (B). TPA à médiation effet thrombolytique. (C). L' injection d'anticorps ciblant le récepteur de la thrombine de souris PAR4 sur la thrombose a été montrée. (D). Thrombus au site ciblé nanovéhicules se lient spécifiquement à activement thrombus former a été montré . Inj. P indique l'injection de particules; et Peak B indique pic des bandes de particules au thrombus. Toutes les images ont été prises en vertu même grossissement. Barre d' échelle = 300 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Rôle de RBC sur la formation de thrombus. (A) des souris thrombocytopénique qui ont reçu une perfusion de globules rouges Dil marqués ont été soumis à l'artère modèle et les images de la thrombose de la carotide après 7,5% FeCl (B & C) Les artères carotides blessées ont été récoltées, et des coupes congelées ont été préparées. Les plaquettes ont été colorées avec CD41 (vert) et les globules rouges ont été montrés comme rouge (DIL). Les noyaux ont été colorés avec DAPI. Les navires figurant dans (B et C) étaient de deux souris différentes. Barres d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1
Vidéo 1: Vidéo Représentant de l'artère modèle de thrombose de la carotide dans le type sauvage (WT) les souris. (Faites un clic droit pour télécharger.) Cette vidéo montre la formation de thrombus représentant dans l'artère carotide de souris WT induite par application topique papier filtre situéavec 7,5% de solution de FeCl3. Les plaquettes ont été marquées par injection intraveineuse de la rhodamine 6G et la vidéo a été prise en mode monochrome. La masse blanche est plaquettes coagulé.

Vidéo 2
Vidéo 2: activateur tissulaire du plasminogène (tPA) à médiation par effet thrombolytique détectée par le modèle de thrombose de l' artère carotide. (Faites un clic droit pour télécharger.) L' étiquetage des plaquettes et la formation de thrombus ont été initiés comme mentionné dans la vidéo 1 et tPA ont été injectés par voie intraveineuse 5 minutes après 7,5% FeCl 3 blessures.

Vidéo 3
Vidéo 3: médicaments antiplaquettaires, na antiprotéase activated receptor 4 (PAR4) antibody mement, à médiation par un effet anti-thrombotique détectée par le modèle de thrombose de l'artère carotide. (Faites un clic droit pour télécharger.) Dans cette expérience, les souris ont reçu l' anticorps PAR4 et rhodamine 6G injection 10 min avant la formation de thrombus a été initié par l' application topique de papier filtre situé à 7,5% FeCl 3.

Vidéo 4
Vidéo 4: ciblage spécifique-thrombus Nanoparticules médiation. (Faites un clic droit pour télécharger.) Dans cette expérience, la formation de thrombus de l' artère carotide a été initiée avec 7,5% FeCl 3 sans étiquetage des plaquettes. Nanoparticules a été marqué avec la rhodamine B et injecté par voie intraveineuse dans la souris 5 min après une blessure.

Vidéo 5 "src =" / files / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Vidéo 5: La liaison des globules rouges détectés par le modèle de thrombose de l' artère carotide. (Faites un clic droit pour télécharger.) Globules rouges (hématies) ont été marquées avec 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil, 10 pM concentration finale), et 100 pi de la globules rouges marqués au dil (35% hématocrite) ont été injectées dans les souris thrombocytopéniques. Aucun marquage des plaquettes a été effectuée dans cette expérience. Thrombus a été initié comme mentionné ci - dessus with7.5% FeCl 3.

Vidéo 6
Vidéo 6: Vidéos Représentant de l'artère et la veine modèle de thrombose mésentérique sur des souris WT. (Droit-click pour télécharger). Les plaquettes ont été marquées par injection intraveineuse de la rhodamine 6G et le thrombus a été initiée après l' application topique d' un morceau de papier filtre avec 12,5% de FeCl3 solution pendant 1 min. Le navire a été observé sous 10X lentille sèche.

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Discussion

Le FeCl 3 induite par le modèle est l' un des modèles de thrombose les plus largement utilisés, qui peut non seulement fournir des informations précieuses sur les modifications génétiques sur la fonction plaquettaire et la thrombose 7,8,16,19,31-33, mais peut aussi être un outil précieux pour l' évaluation des composés thérapeutiques et des stratégies pour le traitement et la prévention des maladies athérothrombotiques 11,17,34-37. Ici, nous avons montré nos modifications et améliorations de ce modèle et a montré des preuves supplémentaires de l'utilité de cette technique, qui est suffisamment sensible pour déterminer les effets des anticoagulants (tPA) et les médicaments anti-plaquettaires (anticorps PAR4). En plus de l'étude mécaniste de la thrombose, le modèle peut également être utilisé pour étudier la base des nanotechnologies, l'administration de médicaments thrombus ciblée. Il peut également être utilisé pour la détection de la paroi de la cuve des espèces réactives de l' oxygène (ROS) la formation par injection d'indicateur fluorescent ROS 21.

Méticuleuxtechniques sont nécessaires pour effectuer ces modèles. L'opérateur doit avoir des compétences chirurgicales suffisantes ainsi qu'une profonde compréhension de la biologie des cellules vasculaires et de sang. Plusieurs points clés de la carotide induite modèle FeCl 3 thrombose de l' artère sont 6: (1) exposer suffisamment de longueur de l' artère carotide (~ 5 mm) pour permettre l' application du papier filtre et laisser un espace pour observer le flux sanguin en microscopie intravitale à phase tardive ; (2) dépouiller clairement les tissus mous adventice autour de l'artère carotide pour permettre le papier filtre à contacter directement la paroi du vaisseau et de produire une blessure même; (3) confirmer l' absence de dommage mécanique sur la paroi du vaisseau et aucune formation de thrombus avant l' application du FeCl3 du papier filtre saturée; (4) sous - tendent l'artère carotide avec un morceau de "U" en plastique noir pour séparer l'artère du tissu environnant, afin de bloquer la fluorescence de fond, et pour empêcher la diffusion de FeCl 3. Par ces stratégies, nous avons généré trèsdes données reproductibles avec le type sauvage C57BL / 6, et dans cette souche de souris 7,5% FeCl 3 induite par le temps de la thrombose est de 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. L'injection de la veine jugulaire de rhodamine 6G pour marquer les cellules en circulation peut être difficile. En variante, une injection dans la veine caudale peut être effectuée avant de fixer la souris sur le couvercle de la plaque de 15 cm. Si l'on compare au modèle de l'artère carotide, le modèle d'artère et de la veine mésentérique est plus facile et moins intense par voie chirurgicale. Cependant, comme mentionné dans la section Résultat, en raison de la couverture des navires par le tissu adipeux, le modèle de thrombose mésentérique est mieux pour étudier la thrombose veineuse, mais nécessite un plus grand échantillon pour minimiser l'erreur entre les souris différentes.

La limitation de ce modèle est que le mécanisme est pas claire et encore controversée. Dans un premier temps , le mécanisme de ce modèle a été considéré comme celui de FeCl3 généré ERO induite par dénudation de cellules endothéliales et subsequently conduit à l' exposition des composants sanguins au sous - endothélium thrombotique, pour rendre l' adhérence plaquettaire, l' agrégation et la formation de thrombus 6,11. Par reconstitution des plaquettes prétraitées avec un anticorps GPVI aux souris thrombocytopéniques, nous avons démontré que le modèle FeCl3 dépend de la GPVI plaquettaire, et le blocage de la GPVI plaquettaire considérablement inhibé la formation induite par FeCl3 19 thrombus. Cette constatation est conforme aux précédents rapports 38 et suggère que le modèle FeCl 3 peuvent être plus susceptibles d'imiter la physiopathologie de la rupture de plaque athérosclérotique humaine médiée thromboses 6. Cependant, plusieurs études récentes ont proposé de nouveaux mécanismes , y compris l' adhérence des globules rouges sur la paroi du récipient ainsi que l' effet physico - chimique de FeCl 3 agrégation induite par des protéines plasmatiques et les cellules sanguines 29,30. Ces nouvelles perspectives suggèrent les mécanismes potentiels de ce modèle peuvent être plus complexes.

Par perfusion des hématies Dil marqués dans les souris thrombocytopénie et induisant FeCl 3 -triggered lésion de l'artère carotide avec 7,5% FeCl 3, nous avons constaté que les grandes cellules qui adhèrent aux parois des vaisseaux blessés sont des plaquettes (Figure 6 et vidéo en ligne 5 ). Nous ne trouvons évidente adhérence des hématies, et l'accumulation de globules rouges dans le thrombus semblait le plus susceptible d'être le résultat de piégeage. Nos résultats correspondent aux concepts de l' hémostase primaire et secondaire 39. La différence de notre observation des rapports antérieurs peut provenir de l' hypoxie et les changements hémodynamiques comme dans l'étude de Barr et al 30, où les FeCl 3 artères carotides blessées pour examen au microscope électronique à balayage ont été préparées dans des souris qui avaient le ventricule gauche précédemment exposé sans l'aide d'une ventillation mécanique. la concentration et l'hémodynamique de l'oxygène du sang seront considérablement diminué à la fois pulmonaire etla fonction cardiaque sera affectée immédiatement après la poitrine est ouverte sans ventilation mécanique. La privation d'oxygène a longtemps été associée à déclenchement de la voie procoagulante et la thrombose 40 et peut également améliorer l' adhérence RBC. Une autre publication récente a montré que le traitement de l'artère carotide avec une très forte concentration de FeCl 3 (20%) pendant 5 ou 10 min conduit à une concentration stable de FeCl 3 à ~ 50 mM dans la lumière du vaisseau blessé 29 . Ils ont ainsi directement infusé 50 mM FeCl 3 dans divers composants sanguins et ont examiné l'effet de FeCl 3 sur l' agrégation ex vivo, ce qui les a conduit à proposer un nouveau mécanisme, 2 phases pour l'action de FeCl 3 dans la formation de thrombus 29. Bien que tout à fait intéressant, les résultats de cette étude doivent être interprétés avec prudence , car il ne représente pas le modèle FeCl3 couramment utilisé. Contrairement à la forte concentration de FeCl 3 (20%, 1 M comme il est indiqué dans le document) et un long traitement (5 ou 10 min), de nos études antérieures, ainsi que Barr et al. ont montré que 10% de FeCl3 traitement pendant 1 minute est suffisant pour induire une rapide formation de thrombus dans occlusive de l'artère carotide à l'intérieur de 7 min 6,30. En outre, dans la plupart des expériences en utilisant le modèle FeCl3, une autre faible concentration de FeCl 3 (5 à 7,5%) est utilisée.

Une autre limite de ce modèle est que , en raison de la blessure oxydative sévère à l'endothélium ainsi que endothéliale dénudation post-traitement FeCl 3, ce modèle peut - être pas un outil adéquat pour étudier la thrombose associée de l' inflammation endothéliale. Toutefois, en utilisant ces techniques pour préparer l'artère carotide en combinaison avec une perfusion de leucocytes marqués par fluorescence, on peut tester l'adhérence et le roulement des leucocytes sur l'endothélium inflammatoire 41.

Dans summary, nous avons affiné et standardisé le modèle induit par FeCl 3 lésion vasculaire pour produire une blessure hautement reproductible sur l'artère carotide et quantifier le flux sanguin temps de cessation avec précision par microscopie intravitale. Ce modèle est suffisant et sensible pour tester l'anticoagulant et antiplaquettaires, et est également approprié pour des études de nanomedicine de thrombus ciblée. En combinaison avec la transplantation de moelle osseuse, la perfusion de plaquettes dans les souris thrombocytopénie ou une injection intravasculaire directe de médicaments candidats, nous avons démontré que cela est un outil pratique, simple et sensible pour étudier la thrombose in vivo 7-10,16,19,42,43 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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Ferriques murin Thrombose modèles induits par Chlorure
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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).More

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