Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

מי כלוריד-induced Ferric מודלים פקקת Murine

doi: 10.3791/54479 Published: September 5, 2016

Summary

אנו מדווחים הליך מעודן של כלוריד Ferric (FeCl 3) מודלים פקקת -induced על העורק הראשי ואת mesenteric וכן וריד, מאופיין באמצעות מיקרוסקופ intravital ביעילות לפקח הזמן Occlusive היווצרות thrombi.

Introduction

פקקת עורקים (קריש דם) היא סיבוך נפוץ של מחלות מערכתיות רבות הקשורות בדלקת כרונית, כולל טרשת עורקים, סוכרת, השמנת יתר, סרטן והפרעות rheumatologic אוטואימונית כרונית. Thrombi המתרחשת בגזע במחזור עורקים מהפעלת טסיות הולמת, צבירה ומנגנוני coagulatory הבאות שלה מעורבת התקף לב, שבץ ואובדן גפיים. בדפנות כלי הדם היא מערכת מורכבת הכוללת סוגי תאים מרובים ומושפע רב של גורמים חיצוניים כולל מאמץ הגזירה, תאי דם, הורמונים וציטוקינים, כמו גם ביטוי של חלבונים נוגדי חמצון בדפנות כלי הדם. ניסויים במבחנה לא יכול לשכפל בסביבה המורכבת הזו ולכן במחקרים vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים הם קריטיים כדי לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים הפרעות של פקקת.

עכברים הוכחו יש simמנגנוני ilar לבני אדם במונחים של פקקת, טרשת עורקים, דלקת 1,2 סוכרת. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ו בנוקאאוט ניתן ליצור לבדוק את הפונקציה של מוצרים גנים ספציפיים פיזיולוגי מורכב או הסביבה פתולוגיים. מחקרים כאלה לחקות הפתולוגיה האנושית עשויה לספק מידע מכניסטית חשובים הקשורים גילוי מסלולים וטיפולים חדשים, כמו גם לספק פרטים חשובים באפיון השפעות התרופה על פקקת.

Thrombi עורקי הפתולוגי להתרחש עקב אנדותל פציעה שכבה או תפקוד לקוי וחשיפה של זרם הדם המטריצה ​​subendothelial 3,4. מודלים פקקת שונים פותחו כדי לגרום נזק האנדותל זה כגון פגיעה מכנית, מתחם photoreactive פציעה חמצוני מבוססי בנגל רוז לייזר פציעה 5. ב הספקטרום הזה, כלוריד Ferric (FeCl 3) -induced לפגיעה בכלי דם היא מודל נפוץ של פקק. מגיב זה כאשרמוחל על היבט של כלי החיצוני גורם נזק חמצוני לתאים וסקולרית 6-8, עם הפסד של הגנה תא האנדותל מן במחזור טסיות ורכיבים של מפל הקרישה. המודל 3 FeCl הוא פשוט רגיש לשני תרופות נוגדות קרישה ואנטי-טסיות, והועלה על התרדמה ועורקים הירך, ורידי הצוואר, mesenteric ו arterioles cremasteric ו venules בעכברים, חולדות, שרקנים וארנבות 6-15.

אחת פרמטר מדיד במודל זה הוא הזמן שחלף מפציעה להשלים חסימה כלי, כפי שנמדד הפסקת זרימת הדם עם מד זרימת דופלר או בהשגחה ישירה עם 6,7,9 מיקרוסקופיה intravital. מגוון של פעמים בין 5 עד 30 דקות דווח במחקרים שונים C57BL6 עכברי 7-10,16, דבר המצביע על כך ריכוזי FeCl 3, סוגים של הרדמה, טכניקות כירורגיות, גיל עכבר, רקע גנטי, שיטת המדידה בזרימת lood, ומשתנים סביבתיים אחרים יש השפעה משמעותית במודל זה. השתנות רחבה זה עושה את זה קשה להשוות מחקרים מקבוצות מחקר שונות והוא רשאי להתקין זיהוי של הבדלים דקים קשה.

עם חזון כדי למזער variabilities כאלה ולהקים לשחזור אחיד במערכת מודל vivo, יש לנו מודל חלופי שהוצע עורק התרדמה -induced FeCl 3 שעושה את הנתונים לשחזור ביותר עם ​​וריאציה מינימלי 6-10,16-19. במאמר זה נתאר ולשתף את הכישורים ולדווח כמה דוגמאות ניסיוני נציג שיכול להפיק תועלת במודל זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים והמניפולציות של חיות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC) של קליבלנד קליניק בהתאם למדיניות השירות לבריאות ציבור ארצות הברית על הטיפול האנושי ושימוש בחיות, ואת מדריך NIH עבור הטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנות:

  1. צבע פלואורסצנטי עבור טסיות תיוג
    1. הכן פתרון 6G rhodamine, 0.5 מ"ג / מ"ל, ב מליחים לעקר את הפתרון עם 0.22 מיקרומטר הסינון.
  2. פתרון FeCl 3
    1. בצע פתרון מניות טרי של 30% FeCl 3 (נטול מים, שווה 1.85 M) במים טהורים, ולסנן עם 0.45 מיקרומטר סינון. כן 5 מיליליטר הטרי FeCl 3 פתרון בריכוז הרצוי [למשל, 2.5% (0.154 מ '), 5% (0.308 מ'), 7.5% (0.463 מ '), 10% (0.617 מ') ו -12.5% ​​(0.771 M)] על ידי דילול הפתרון 30% 3 FeCl עם i מיםנה מנה 6 ס"מ רקמת התרבות לשמור על מכסה סגור.
      הערה: שימוש מנת התרבות מקל להרים את נייר הסינון רווי פתרון FeCl 3 מ להרים אותו ממכל צר, כגון צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. FeCl3 מאוד מסוכן וכי אמצעי זהירות, כגון כפפות לובשות חלוק מעבדה וכו ', ציוד מגן אישי, תמיד צריכה להילקח.
  3. ניירות לסנן
    1. חותכים את נייר הסינון עד 1 מ"מ x 2 גודל מ"מ. משרים מספיק חתיכות של נייר לחתוך מסנן בפתרון 3 FeCl באותה צלחת.
  4. Papaverine Hydrochloride פתרון
    1. הכן פתרון hydrochloride papaverine (25 מ"ג / מ"ל) במים לעקר את הפתרון עם 0.22 מיקרומטר הסינון.
  5. agarose ג'ל
    1. הכן ג'ל agarose 2% ב PBS או תמיסת מלח בצלחת בתרבית רקמה 6-היטב, ~ 1 ס"מ עובי, ו גut אותו חצי עיגול עם ~ 3 ס"מ קוטר.

2. FeCl 3 מושרת דגם פקק פגיעת ראש עורקים

  1. ניתוחים עבור הדגם פקק
    1. השתמש 8 - 12 שבועות עכברים C57BL6 (או זנים אחרים לפי הצורך). להרדים עכברים עם תערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) / xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה intraperitoneal. אשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן.
      הערה: סכום זה של קטמין / xylazine מספיק כדי לשמור על בעלי החיים בהרדמה יציבה ללא כאב (בתגובת בוהן הצובטת) לפחות 1 שעה.
    2. הסר פרווה על הצוואר והחזה העליון עם גוזז חשמלי חיה קטנה. קרם מקריח אינו הכרחי. החל משחת עין נפט ניטראלית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
    3. אבטח את העכבר במצב שכיבה על מכסה צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ. השתמש קלטת אחת ארוכה (~ 10 ס"מ) להבטחת היןגפי ד ואת גוף תחתון, ואת שתי חתיכות של נייר קטן (2 סנטימטרים X 0.5 סנטימטרים) להבטחת רגליים קדמיות. השתמש תפר 4-0 כדי לעטוף החותכות, קלט את שני קצוות של תפר את המכסה כדי לשמור על צוואר עכבר ישר (איור 2).
    4. מניחים צלחת עם הראש העכבר כלפי המפעיל תחת מקור אור כירורגית.
    5. לעקר את האתר כירורגית עם כרית אלכוהול. להשתמש במלקחיים מיקרו-Adson להחזיק את העור ולהשתמש מספריים כירורגיות לעשות חתך קטן (2 - 3 מ"מ).
    6. מתח את העור של החתך עם המלקחיים וכנס מספרי כירורגיות עם לסתות סגורות לתוך החתך. לדחוף את המספריים מתחת לעור כלפי manubrium או הסנטר, ולאחר מכן פתח את המספריים לשחרר את העור מפני השכבה התת עורית.
    7. חותכים את העור עם מספריים כירורגיות לעשות חתך קו האמצע מן manubrium לרמה של עצם הלשון (איור 3 א ו 3 ב). בבוטות לנתח את fascia הדקה (קו מקווקו, ב (איור 3 ב ו -3 ג; חיצים כחולים).
      הערה: manubrium (חץ שחור איור 3 ג) ואת קנה הנשימה (T באיור 3C) יראו לאחר שלב זה.
    8. החזק את הרקמות הרכות העור לראות בחלק הימני של manubrium עם המלקחיים גרפו, הכנס את hemostat תחת fascia כלפי בעמדת 2 שעה (קו מקווקו צהוב איור 3 ג), לפתוח את הלסתות של hemostat לשחרר את וריד הצוואר מן הרקמה שמסביב.
    9. חותכים את fascia, רקמות רכות העור כלפי בעמדה 2 השעה (איור 3 ג) עם מספריים כירורגיות כדי לחשוף את וריד הצוואר הימני (איור 3D, חץ).
    10. צייר על 200 - פתרון 300 μl rhodamine 6G באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 22 מחט G, ולאחר מכן שינויזה עד 30 מחט G.
      הערה: זה מגן המחט 30 G מנזק בין קצהו בסדר. ישירות ציור הפתרון 6G rhodamine עם מחט 30 G לא תגרום נזק קצה; עם זאת נוגע בקיר מיכל בטעות תגרום נזק, אשר עלול לגרום הזרקת קשה.
    11. שטוף את המחט 30 G על ידי לאט לדחוף את הפתרון 6G rhodamine, לוודא שאין בועות אוויר להישאר בתוך המזרק או המחט. הצב של 100 μl rhodamine פתרון 6G להזרקה.
    12. בנד 2 - 3 מ"מ קצה המחט לזווית של 90 מעלות עם בעל מחט, אשר ימנע החדרת המחט עמוק מדי אל וריד הצוואר והופך את הזריקה יותר לשלוט בקלות (איור 3D).
    13. להזריק את הפתרון 6G rhodamine לווריד תקין הצוואר כדי טסיות התווית. כדי לייצב את המזרק ולשמור על המחט בנקודה, להחזיק את המזרק ביד אחת ואת המחט עם המלקחיים גרפו עם יד אחרת במהלך injection.Afהזרקת ter, מהדקת את הזריקה עם המלקחיים גרפו כדי למנוע דימום.
    14. פתח את הלסתות של hemostat ולהכניס אותו תחת מלקחיים גרפה כדי לצבוט בדפנות כלי הדם של הזריקה, ולאחר מכן ולקשור את הזריקה עם תפר 6-0.
      הערה: כחלופה של צעד 2.1.15, הפעלת לחץ על הזריקה באצבע למשך 2 דקות יהיה לעצור את הדימום; יש עם זאת, שיטה זו סיכון בגרימת דימום נוסף אם הקריש באזור הזריקה מוסר בטעות.
    15. בבוטות לנתח את רקמות fascia הרכות סביב בלוטת submaxillary נותרת עם hemostat ו המלקחיים גרפו ולמשוך את הבלוטה כלפי ובמיקום 7 שעה (האיור 3E) כדי לחשוף את שרירי sternocleidomastoid שמאלה (חץ כחול באיור 3E).
    16. בבוטות לנתח את fascia (3E איור, קו מקווקו) בין שריר sternocleidomastoid שמאלה שריר omohyoid או sternohyשריר OID (3E איור, חץ ירוק) ממוקם לאתר השמאלי של קנה הנשימה עם hemostat.
    17. לעבור מחט עם תפר משי 6-0 (כ -15 ס"מ) תחת באמצע השריר sternocleidomastoid (חץ כחול 3E איור), לשים את שני הקצוות של תפר ביחד ומשוך תפר רוחבית לכיוון במיקום 10 השעה .
      הערה: הליך זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע פגיעה של וריד הצוואר השמאלי, הנמצא מחוץ שריר sternocleidomastoid.
    18. בבוטות להפריד את השריר sternohyoid דק ו / או שריר omohyoid לחשוף את העורק הראשי (CA) (חץ איור 3F) לאחר מסירה את השריר sternocleidomastoid. חותכים את השריר sternohyoid ו / או שריר omohyoid לפי הצורך. השתמש hemostat להפריד את הרקמות הרכות מ CA בלי לגעת CA.
      הערה: CA מלווה העצב התועה, המבנה הלבן לראות באיור 3F).
    19. השתמש מלקחיים טיפ נאה להרים את fascia לרוחב ברחבי CA תוך הימנעות העצב התועה ו CA. שימוש נוסף מלקחיים טיפ נאה אגרוף חור על fascia בין CA לבין העצב התועה.
    20. להעביר את הקרס דרך החור בעדינות להרים את CA, ולאחר מכן למקם את מלקחי טיפ הנאים תחת CA. הזז את הקרס מלקחיים בכיוונים מנוגדים לאורך CA להתפשט רקמות רכות adventitial. ב חינם לפחות ~ 5 מ"מ אורך של CA (האיור 3H, חץ כחול) מן הרקמה שמסביב.
    21. כדי לחסום קרינת רקע, לחץ על הקצה של stirrer קפה פלסטיק שחור שטוח, Crosscut בוחש קפה לתוך חתיכת 3 מ"מ, ואז לחתוך longitudinally בשולי לקפל לקבל שתי חתיכות פלסטיק בצורה "U" (3H איור, ירוק חץ).
    22. (3H איור, החץ הירוק). מיד להחיל 2-3 טיפות של תמיסת מלח כדי למנוע ייבוש CA.
  2. הקלטת וידאו בזמן אמת
    1. מעביר את מכסה עכבר צלחת יחד על הבמה מיקרוסקופ ומכניס בעמדה מתאימה תחת עדשת מי 10X. למלא את החלל בין עדשת 10X ואת CA עם מי מלח.
    2. הפעל את יישום תוכנת הקלטת וידאו הדיגיטלי, והפעל קובץ חדש ותיתן להן שם מתאים. להקליט תמונות כלי נורמליות לרשום את מספר המסגרת כאשר הקלטת הווידאו הוא עצר.
      הערה: מוצרי תוכנת הקלטת וידאו במחשב להקלטה. אנו משתמשים בתוכנות הקלטת וידאו דיגיטליות התיאורים הבאים מבוססים על יישום זה.
      הערה: מאז tra מכניאומה יכולה לפגוע האנדותל ולהוביל היווצרות פקיק 20, יש צורך לאשר שאין פגיעה כירורגית כדי בדפנות כלי הדם לפני הפציעה 3 FeCl. כמו כן יש לאשר שאין הרקמה הנותרת ברחבי קליפורניה, העשויים ליצור מחסום ולעמעם את השפעת הפגיעה -induced 3 FeCl. רשום את מספר המסגרת של הרשומות יעשה את זה קל לנתח את הסרטונים בהתאם פעמים שחלפו מאוחר יותר.
    3. להזיז את העכבר עם מכסה צלחת מתוך עדשת 10X. מקפלים פינה של מגבת נייר כדי להפוך טיפ דק ועדין ולהשתמש בו כדי למחוק את מלח בזהירות סביב CA (להימנע מלגעת CA) וכן במקומות אחרים בתחום כירורגית. זה חשוב כדי למנוע דילול של הפתרון 3 FeCl בשימוש.
    4. השתמש מלקחי טיפ נאים להרים פיסת נייר סינון רוויה פתרון FeCl 3 ולמקם אותו ישירות על CA ולשמור אותו באתר 1 דקות.
      הערה: To להדמית סיוע של נתונים המדויקים הדם וקציר, הנח את הנייר המסנן קרובה לסוף הדיסטלי של חשופי CA (3I האיור) ולהשאיר קטע קצר באתר הפרוקסימלי (חץ ירוק 3I איור) על קיום זרימת דם מאוחר שלב (ראה להלן).
    5. הסר את הנייר מסנן (בנקודה זו בזמן מוגדר כתחילת "לאחר פציעה") ולשטוף את CA עם מי מלח (לפחות 2 מ"ל).
    6. שים את העכבר עם מכסה הצלחת בחזרה אל העדשה 10X; לבחון את הכלי ולהתחיל תמונות וידאו שיא. רשום לעצמך את המספר וידאו מסגרת בסוף כבר בדקה הראשונה של הקלטה.
      הערה: היווצרות פקיק מזוהה על ידי הצטברות של טסיות פלורסנט, אשר נצפו תמונות וידאו בזמן אמת על מסך המחשב או תחת מיקרוסקופ. תמונות הקלטת וידאו מיד לאחר לשים את העכבר בחזרה מתחת למיקרוסקופ. המשך להקליט עד הסוף בדקה הראשונה לאחר הסרת fנייר ilter. שים את הספינה כולה מן דיסטלי באתרי הפרוקסימלי לקבל מידע על הפציעה, ולאחר מכן להתמקד באזור של עניין (בדרך כלל הוא במרכז האזור הפגוע) הדמיה נוספת.
    7. תמונות וידאו שיא במשך 10 שניות כל דקה במשך 10 הדקות הראשונות (למשל, 2:55 כדי 3:05) ולאחר מכן 10 שניות כל שתי דקות עד סוף הניסוי. רשום את מספרי המסגרת כאשר כל הקלטה היא עצר.
      הערה: נקודות הקצה של המודל הן: 1) כאשר זרימת דם חדל עבור> 30 שניות; או 2) אם החסימה אינה נראית 30 דק 'לאחר פציעה. במקרה זה, להשתמש 30 דקות עבור ניתוח סטטיסטי. גדר זמן חשיפה של תיעוד וידאו כמו 10 msec בהתחלה, אז זה יהיה קל לשמור על זרימת הדם מעל thrombi. כאשר thrombi הפך לגדול ואת הקרינה מרווה את חיישן המצלמה, הוא הופך להיות קשה לזהות את זרימת הדם מעל thrombi. כדי לפתור בעיה זו, להזיז את ההדמיה center לאתר הפרוקסימלי ללא פגע (איור 3I, החץ הירוק) שבו זרימת הדם עדיין ניתן ציין בבירור. אנחנו גם להגדיל את Expose זמן כדי msec 15 או 20 כאשר ההתמקדות באתר בלתי נפצעו הפרוקסימלי, כך זרימת הדם ניתן לראות בצורה ברורה יותר. כאשר זרימת הדם תיפסק, רבים תאים גדולים (לויקוציטים) להתחיל לגלגל על ​​הקיר כלי באתר הפרוקסימלי של פקיק. תזרים בדרך כלל מפסיק בתוך 2 - 3 דקות לאחר הופעת התאים הגדולים. רשמו את Expose זמן שבגיליון ההקלטה אם הוא השתנה. זה בדרך כלל לוקח בערך 30 דקות מן ההרדמה עד סוף הניסוי, אם עכברי C57BL6 סוג הבר הרגילים שמשו.
      הערה זהירות: אל תשתמש קריש טסיות מצטבר לבן כסימן של הפסקת זרימת דם, אשר לא לתת נתונים מדויקים וזה מושפע זמן החשיפה. קריש הדם הלבן כיסה את לומן הכלי לא אומר זרימת דם חדל (ראה וידאו נציג 1).

3. עורק FeCl 3 מושרה Mesenteric / דגם פקקת וריד

  1. להרדים 8 - 12 בן שבוע עכברים C57BL6 כאמור בסעיף 2.1.1. החל משח וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
  2. להזריק פתרון papaverine (0.4 מ"ג / עכבר סה"כ) intraperitoneally לעכב תנועת פריסטלטית מעיים.
  3. הסר פרווה על הצוואר והבטן עם גוזז חשמלי חיה. קרם מקריח אינו הכרחי.
  4. אבטח את העכבר במצב שכיבה על מכסה צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ. השתמש ארבעה חתיכות של נייר קטנות (2 ס"מ X 0.5 ס"מ) כדי לאבטח את כל הרגליים. השתמש תפר 4 -0 כדי לעטוף החותכות, קלט את שני קצוות של תפר את המכסה כדי לשמור על ישר הצוואר (איור 2).
  5. בצע את ההליכים 2.1.4 -2.1.15 לחשוף את וריד הצוואר להזרקה של rhodamine 6G כדי טסיות התווית.
  6. בצע חתך קו האמצע דרך העור מפני xiphoid כדי הבטן התחתונה באמצעות מספריים כירורגיות (איור 4 א). תרים את הצפק באמצע (המכונה גם Linea alba, איור 4 א, ​​חץ) עם מלקחיים גרפו, אשר ברורה ואין לו כלי דם, להרים על 2 - 3 מ"מ גבוה, לאשר לא מעי מתחת לקו החיתוך, וחותכי הצפק פתוח אורכית עם מספריים בסדר (איור 4B).
  7. לאבטח מחדש העכברים למצב לרוחב נכון. מניחים את הג'ל agarose חצי עיגול קרוב הבטן, ובעדינות exteriorize המעיים ופרש אותה על החלק העליון של הג'ל עם מלקחיים גרפה (איור 4C). השתמש הסניפים השניים לניסוי פקק (האיור 4C, חץ).
    הערה: השתמש hemostat או מיקרו-Adson מלקחיים כדי לעזור exteriorize המעיים. להימנע מפגיעהמעי ואת הכלי.
  8. מניח 5 - 6 טיפות מי מלח כדי לשמור על הלחות של מעי הכלי. מעביר את העכבר עם מכסת הצלחת יחד על הבמה מיקרוסקופ ומניח בעמדה מתאימה תחת העדשה 10X היבשה.
    הערה: השתמש עדשה יבשה בגלל קרום jejunoileal לא יכול להחזיק תמיסת מלח. ודא לרדת תמיסת מלח על הרקמות החשופות לשמור אותם לחים.
  9. כתם המלוח סביב עורק וריד mesenteric לפני הטיפול.
  10. השתמש מלקחיים טיפ נאה להרים פיסת נייר מסנן רווי 12.5% ​​פתרון FeCl 3 ולמקם אותו ישירות על העורק לווריד mesenteric דקות 1 (איור 4D). הסר את הנייר מסנן (בנקודה זו בזמן מוגדר כתחילת "לאחר פציעה") ולשטוף את העורק mesenteric נפצעו וריד עם מי מלח (לפחות 2 מ"ל).
  11. שים את העכבר עם מכסה הצלחת בחזרה תחת עדשת יבש 10X; לבחון את כלי ולהתחיל recתמונות וידאו ORD כאמור 2.2).
    הערה: נקודות הקצה של ניסוי זה הן: 1) כאשר זרימת דם חדל עבור> 30 שניות; או 2) אם החסימה אינה נראית 30 דק 'לאחר פציעה, וגם במקרה זה להשתמש 30 דקות עבור ניתוח סטטיסטי.
  12. בסוף הניסוי, להרדים את העכברים באמצעות מנת יתר קטמין / xylazine (200/20 מ"ג / ק"ג), ואחריו נקע בצוואר הרחם לאחר בלי מכות נשימה ולב יאושרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התרדמה עורקים פקקת דגם
בעכברים עם רקע C57BL6, אנו ממליצים להשתמש 7.5% FeCl 3 לטיפול הספינה דקות 1 כנקודת מוצא. תחת טיפול של 7.5% 3 FeCl, גבולות האזור הפצוע בדפנות כלי דם נורמליות מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ (מקוון ראו וידאו 1), דבר המצביע על כך את שכבת האנדותל נפגעה באופן משמעותי. Thrombi נוצר מיד עם הטיפול 3 FeCl, והם נצפו בכל דקות עכברים 1 WT C57BL6 לאחר פציעה. Thrombi יצרה בתחילה אינן יציבות וחלקים מהם בדרך כלל נשטפים על ידי זרם הדם, כך thrombi נוצר נעשים קטנים יותר ב 2 - 3 דקות לאחר פציעה. Thrombi להתחיל להגדלה מן 3 - 4 דקות לאחר הסרת נייר לסנן thrombi ומאוחר יותר הקים אלה יציבים בדרך כלל לא נשטף. שעת occlusive הממוצעת היא 11.3 ± 3.16 דקות בעכברי C57BL6 (n = 14) כאשר 7.5% F3 ECL משמש 6,7,19 (איור 5 א ו וידאו מקוון 1). במחקרים הקודמים שהראנו ששני ירידה ועלייה של ריכוזי FeCl 3 לצמצם את ההבדל בין זן העכבר אנטי טרומבוטיים ו WT עכברים 6; מניסיוננו, טיפול של עורק התרדמה עם 7.5% FeCl 3 דקות 1 די באלה כדי לקיים את כל לענייננו. בנוסף בדיקה תפקודית של גנים ספציפיים באמצעות עכברים בנוקאאוט 7,8,16,19,21, להלן ארבעה ניסויים נציג באמצעות מודל זה:

זלוף תוך ורידי של מתווכת Activator Plasminogen מסוג רקמת Thrombolysis
Activator plasminogen רקמות מסוג (tPA) היא אחת התרופות ה- FDA לטיפול thrombolysis בארצות הברית 22. אנחנו ובכך ציינו את thrombolysis בתיווך tPA במודל פקק בעורק התרדמה. פקקת היהיזם עם 7.5% FeCl 3 ורשות להקים למשך 5 דקות לפני tPA (1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) היה perfused דרך קטטר וריד הצוואר (22GA). כפי שניתן לראות בתרשים 5 ב ו וידאו מקוון 2, פקיק מוגדל רף כבוש כ -50% של לומן 5 דקות לאחר פציעה. Thrombi המשיך להגדיל לאחר זלוף tPA דבר המצביע על כך tPA אינו משפיע הפעלה טסיות צבירה. Thrombolysis התחיל בערך 4 דקות לאחר הזרקת tPA. Thrombi נוצר נמצאו לעבור גדלים שונים שוב ושוב במהלך תקופת מעקב 30 דקות ואין חסימת כלי שקרתה במקרה זה. נתונים אלה מראים בבירור כי tPA לא יכול לעכב טסיות בתיווך פקיק היווצרות לחלוטין, גם אם הוא מוביל thrombolysis. לכן, אנו צופים כי בניסויים עתידיים ניצול מודל FeCl 3 -induced פקק עורקים יכולים להיות מנוצלים כדי להעריך thrombolytic וטיפולים משלים אחרים שיכול להיות קודם בולטאפקט entative על היווצרות פקיק.

זלוף של PAR4 נוגדן לעכברים מעכב פקק
קולטן 4 מופעל פרוטאז (PAR4) הוא קולטן מצמידים חלבון G (GPCR) על טסיות אשר מופעל על ידי מחשוף פרוטאוליטים של exodomain N-terminal שלה 23 ובהמשך מוביל השלבים ההפעלה טסיות. מעבדת ניימן יצרה נוגדני PAR4 העז polyclonal (CAN12) שמכוון באשכול anionic של PAR4, ומעכב מחשוף PAR4, ובכך להשפיע צעד קריטי עבור הפעלת טסיות בתיווך PAR4 24. על ידי טפטוף של 1 מ"ג / קילו של נוגדן זה עכברי C57BL6, מצאו כי עיכוב של מחשוף PAR4 הממושך באופן משמעותי פעמים Occlusive היווצרות פקיק במודל פקק 7.5% FeCl 3 מושרה התרדמה עורק (איור 5 ג ומקוון וידאו 3). מכך ניתן להסיק כי FeCl 3 -induced ג מודל פקקלהיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעות של תרופות אנטי-טסיות ולאפיין אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

Nanoparticle בתיווך מיקוד thrombi ספציפי
קריש-הסרה מהירה להקים מחדש את זרימת הדם הוא קריטי בטיפול במחלות כלי הדם occlusive כולל שבץ איסכמי ואוטם שריר הלב. משלוח מערכתי של תרופות טרומבוליטיות, כגון tPA הראה לעיל, יכול lyse thrombi נוצר, אך לא יכול למנוע לחלוטין הפעלה טסיות מחדש צבירה / חסימה. בנוסף, משלוח ישיר מערכתי של סוכני פרוטאז סרין כזה יכול להוביל לפעולה מחוץ היעד ללא הבחנה, מה שמוביל השפעות משמעותיות לוואי כולל דימום. מעבדת סן גופטה מהונדסת בהשראת טסיות ננו-חלקיקים מבוססי אמצעי שיגור סינטטי שיכול להיקשר טסיות מופעלת הקשורים קריש וחלבונים תחת זרם גזירה המודינמי 25-27. וכך בדקנו אם חלקיקים אלה יכוליםלאגד את thrombi להרכיב באופן פעיל עורק.

כאמור בניסוי זלוף tPA, קטטר הוכנס לתוך וריד הצוואר ומחובר משאבת הזרקה להזרקה של ננו-חלקיקים בקצב זרימה אחידה. בניסוי זה, אין לצבוע קרינה הוזרק בעכבר כדי לתייג טסיות. במקום זאת, החלקיקים תויגו עם Rohdamine B; ולכן הם הצליחו להבחין תחת מיקרוסקופ intravital. קריש הדם החל עם 7.5% FeCl 3 טיפול דקות 1 כאמור. מאז בעכברים WT, כמות משמעותית של thrombi נמצאה להקים 5 דקות לאחר פציעה, בחרנו בנקודה זו בזמן להזרקה של חלקיקים כדי לזהות אם חלקיקים להיקשר ביעילות thrombi להרכיב באופן פעיל. כפי שניתן לראות בתרשים 5D ומקוון וידאו 4, לאחר ההזרקה של חלקיקי ניאון, הצלחנו לזהות הר בצורהפקיק אשר היה מתכסה בהדרגה על ידי חלקיקי הניאון. מחקרים אלה להדגים את התועלת של המודל פקק FeCl 3 -induced להעריך את יכולת המיקוד (ו יעילות טיפולית שלאחר מכן) של מערכות אספקת סמי קריש במיקוד חלקיקים.

תפקיד כדוריות הדם האדומות מלבד טסיות היווצרות פקיק.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תאי דם אדומים (RBCs) לשחק תפקיד חשוב במודל פקקת FeCl 3 המושרה 28 והם מהווים מרכיב הדם חסיד הראשון בדפנות כלי הדם נפגע 29,30. כדי לחקור תופעה זו, אנו שכותרתו RBCs עם 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ", 3'-Tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (דיל, 10 מיקרומטר הריכוז הסופי). את RBCs שכותרתו דיל נשטפו פעמיים עם PBS ו resuspended מלוחים עם המטוקריט 35%. השעית RBC דיל שכותרתו (100 μl לכל עכבר) הייתה להזריקed לתוך עכברי thrombocytopenic אשר כבר מוקרן קטלני 5 ימים לפני הניסוי 19. עכברי thrombocytopenic אלה יש משמעותי ירד טסיות, אשר תגדיל את הסיכוי של RBC ממתין אל קיר הכלי, אם הם עושים. בניגוד הניסויים באמצעות טסיות שכותרתו קרינה (איור 5), כך שלא היה הצטברות ברורה של תאי פלורסנט נמצאת על קיר הכלי לאחר פציעה של כלי דם (איור 6 א, IDEO נ באינטרנט 5). עם זאת, יחד עם ההיווצרות של thrombi טסיות עשירים, RBCs החל להצטבר פקיק הממחיש את הצורה של הקריש (איור 6 א). מכתים immunofluorescence של עורק התרדמה נפצע הראה כי התאים הגדולים דבקים בדפנות כלי הדם הם טסיות (CD41 חיובי, ירוק), ואילו RBCs שכותרתו דיל הוא בעיקר לכודים בתוך thrombi (איור 6 ב & C). מחקרים אלה הראו כיFeCl 3 מודל פקק -induced יכול להיות מנוצל להבנתם מכניסטית על רכיבים תאיים ומולקולריים ואירועים במרחב ובזמן ב היווצרות פקיק.

Mesenteric דגם פקק
עבור הדגם פקק mesenteric, ריכוז גבוה של FeCl 3 (10 - 12.5%) מומלץ כמו כלי בדרך כלל מוקפי רקמת שומן, אשר יכולה לעכב את דיפוזיה FeCl 3 לכיוון קיר הכלי ובכך מונע באונייה מנמל FeCl 3 -induced פציעה 7. מודל זה מתאים יותר במחקר פקקת ורידים. כפי שניתן לראות וידאו מקוון 6, פקיק נתפסה סביב ~ 15 שניות בוריד mesenteric לאחר החלת מקומי נייר הסינון רווי 12.5% ​​FeCl 3 פתרון, אבל היווצרות פקיק מתעכבת דרמטית בעורק mesenteric. ממוצע הזמן Occlusive היווצרות פקיק הוא ~ 17 ± 7.2 דקות (n = 11) ב מ וריד esenteric וכ -23 ± 9.9 דקות (n = 10) בעורק mesenteric כאשר 12.5% ​​3 FeCl משמש 7.

איור 1
מכשור לכירורגיה באיור 1.. את כלי דרושים המינימאליים לניתוח עכבר מוצג. ראה רשימת חומרים לקבלת מידע מפורט יותר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. קיבוע עכבר לכירורגיה. אבטח את העכבר על מכסה צלחת תרבות 15 ס"מ עבור דגם פקקת בעורק התרדמה או הזרקה של צבע 6G rhodamine עבור דגם פקקת mesenteric.לקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ראש עורק פקקו דגם. ונהלים לחשוף את וריד הצוואר, הזרקת rhodamine 6G פלורסנט לצבוע לתוך מערכת הדם והחשיפה של עורק התרדמה עזב מוצגים. ב (א), בקו מציין חתך מ manubrium לרמה של עצם הלשון; ב (ב), החצים הכחולים מצביעים בלוטות submaxillary, ואת הקווים המקווקווים צהוב לייצג את fascia בין בלוטות submaxillary; ב (ג), החצים הכחולים מצביעים בלוטות submaxillary, חץ שחור מצביע manubrium, וקו צהוב מקווקו מציין את המיקום לחתוך לחשוף את וריד הצוואר; ב (ד), החץ הכחול מצביע על וריד הצוואר; ב (E), החץ הצהוב מצביע על בלוטת submaxillary שמאל, indicat החץ הכחולes עזב שריר sternocleidomastoid, הקו הצהוב המקווקו מציין fascia, ואת החץ הירוק מציין את השריר omohyoid או מתחת לשריר sternohyoid; ב (F), חץ כחול מצביע על עורק ראשי, הקווים מהקווקווים הצהובים להראות שריר sternohyoid הדק ו / או מתחת לשריר omohyoid; ב (G), החץ הכחול מצביע על העורק הראשי ואת החץ הירוק מצביע על העצב התועה; ב (ע), החץ הכחול מצביע על עורק ראשי ואת החץ הירוק מצביע על הפלסטיק "צורת U" בוחש קפה; וב (I), החץ הכחול מצביע על נייר הסינון ממוקם עם FeCl 3 פתרון, חץ ירוק מציין את העורק הראשי. T מייצגת קנה נשימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. העורקים Mesenteric ו פקקת וריד דגם. חשיפה של כלי mesenteric וכן טיפול FeCl 3 מוצג. ב (א), החץ הכחול מצביע Linea alba, רקמת הסיבית הלבנה ללא כלי; ב (ב), חתכו לחתוך לבד אלבה Linea הוצג; ב (ג), החצים הכחולים מציינים את הקשת השנייה של עורקי mesenteric וורידים; ב (ד), החץ הכחול מצביע על נייר הסינון ממוקם עם פתרון 3 FeCl. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
ניסויי נציגי איור 5. באמצעות עורק התרדמה פקק דגם. (א). היווצרות פקיק עכבר theC57Bl / 6 שטופלו 7.5% FeCl 3. (B). TPA בתיווך השפעה thrombolytic. (C). הזרקה של נוגדן מיקוד תרומבין העכבר קולטן PAR4 על פקקת הוצגה. (ד).-פקיק בהכוונה לאתר nanovehicles להיקשר באופן ספציפי thrombi להרכיב פעיל הוצגה . Inj. P מציינת הזרקת חלקיקים; ו Peak B מציין banding השיא של חלקיקים אל thrombi. כל התמונות צולמו תחת קורת הגדלה. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
תפקיד איור 6. של RBC על פקיק גיבוש. (א) עכברים thrombocytopenic שקיבלו זלוף של RBCs דיל שכותרתו היו נתונים למודל פקקת התרדמה עורק ותמונות לאחר 7.5% FeCl (B & C) עורקי הראש נפגע נבצרו, וחתכים קפוא הוכנו. טסיות הוכתמו CD41 (ירוק) ו RBCs הוצגו כאדום (דיל). גרעינים הוכתמו DAPI. כלי שמוצג (B ו- C) היו משני עכברים שונים. ברי סולם = 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

וידאו 1
וידאו 1: וידאו נציג של המודל פקק תרדמה עורק סוג בר (WT) עכברים. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) וידאו זה מראה את היווצרות פקיק נציג בעורק התרדמה של עכברי WT המושרה על ידי נייר פילטר יישום מקומי הממוקמתעם 7.5% FeCl 3 פתרון. טסיות תויגו על ידי הזרקה תוך ורידית של rhodamine 6G, וידאו צולם במצב מונוכרום. המסה הלבנה היא טסיות קורש.

וידאו 2
וידאו 2: activator plasminogen רקמות (tPA) אפקט thrombolytic בתיווך זוהה על ידי מודל פקקת התרדמה עורק. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) תיוג טסיות והיווצרות פקיק ננקטו כאמור וידאו 1, ו tPA הוזרק לווריד 5 דקות לאחר 7.5% FeCl 3 פציעה.

וידאו 3
וידאו 3: תרופה אנטי טסיות, נה mely מופעל נגד פרוטאז קולטן 4 (PAR4) נוגדן, בתיווך השפעה אנטי טרומבוטיים זוהה על ידי מודל פקקת בעורק התרדמה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) בניסוי זה, עכברים קיבלו נוגדנים PAR4 ו דקות הזרקת 10 rhodamine 6G לפני היווצרות פקיק יזמו החלת מקומי נייר הסינון ממוקם עם 7.5% 3 FeCl.

וידאו 4
וידאו 4: Nanoparticle בתיווך המיקוד thrombi ספציפי. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) בניסוי זה, היווצרות פקיק עורק התרדמה יזמה עם 7.5% 3 FeCl ללא טסיות תיוג. Nanoparticle סומן עם Rhodamine B ו- לווריד מוזרק עכבר 5 דקות לאחר פציעה.

וידאו 5 "src =" / files / ftp_upload / 54,479 / 54479video5.jpg "/>
וידאו 5: כריכה של כדוריות הדם האדומות זוהו על ידי המודל פקק בעורק התרדמה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) תאי דם אדומים (RBCs) תויגו עם 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ", 3'-Tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (דיל, 10 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו -100 μl של דיל שכותרתו RBCs (המטוקריט 35%) הוזרקו לעכברים thrombocytopenic. אין תיוג טסיות בוצע בניסוי הזה. פקיק יזם כאמור with7.5% FeCl 3.

וידאו 6
וידאו 6: וידאו נציג של המודל פקקת בווריד ובעורק mesenteric על עכברים WT. (Right-CLIck להוריד.) טסיות תויגו על ידי הזרקה תוך ורידית של rhodamine 6G, ואת פקיק יזם מקומי לאחר החלת חתיכה אחת של נייר פילטר עם 12.5% ​​FeCl 3 פתרון דקות 1. הספינה נצפתה תחת 10X עדשה יבשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל FeCl 3 -induced הוא אחד הדגמים פקקו בשימוש הנרחב ביותר, אשר לא יכול רק לספק מידע רב ערך על שינויים גנטיים על תפקוד טסיות ופקק 7,8,16,19,31-33, אבל גם יכול להיות כלי רב ערך להערכת תרכובות אסטרטגיות טיפוליות לטיפול ומניעה של מחלות atherothrombotic 11,17,34-37. כאן אנו הראינו השינויים שלנו חידודים של מודל זה והראינו ראיות נוספות של השירות של טכניקה זו, אשר היא רגיש מספיק כדי לקבוע את ההשפעות של קרישה (tPA) ותרופות אנטי-טסיות (נוגדן PAR4). בנוסף המחקר מכניסטית של פקקת, המודל יכול גם להיות מנוצל ללימוד מבוסס ננוטכנולוגיה, שיגור תרופות-thrombi. זה יכול לשמש גם למטרות זיהוי של מיני חמצן מגיבים בדפנות כלי דם (ROS) היווצרות בזריקה של מחוון ניאון ROS 21.

קַפְּדָנִיטכניקות הדרושים לביצוע המודלים האלה. המפעיל צריך מיומנויות כירורגיות מספיק וכן הבנה עמוקה של ביולוגיה של התא וסקולרית ודם. במספר נקודות חשובות של המודל פקק FeCl 3 מושרה תרדמה העורק הן 6: (1) לחשוף מספיק אורך עורק תרדמה (~ 5 מ"מ) כדי לאפשר יישום של נייר הסינון ולהשאיר מרחב להתבונן זרימת דם תחת מיקרוסקופ intravital בשלב מאוחר ; (2) ברור להפשיט את הרקמות הרכות adventitial סביב עורק התרדמה לאפשר נייר סינון לפנות בדפנות כלי הדם ישירות ולהפיק פציעה אפילו; (3) לאשר שום פגיעה מכנית כדי בדפנות כלי הדם ואין היווצרות פקיק לפני יישום FeCl 3 נייר פילטר -saturated; (4) בבסיס עורק התרדמה בחתיכה "U" בצורת פלסטיק שחור להפריד העורק מן הרקמה שמסביב, לחסום קרינת רקע, ולמנוע FeCl 3 דיפוזיה. על ידי האסטרטגיות האלה, יצרנו ביותרנתונים לשחזור עם סוג בר C57Bl / 6 עכברים, וב זן העכבר הפעם 7.5% FeCl 3 המושרה פקקת היא 11.3 ± 3.16 דקות (n = 14) 6,7,19. זריקת וריד הצוואר של rhodamine 6G לתייג תאי עשוי להיות מאתגר. כחלופה, זריקה לוריד זנב יכולה להתבצע לפני הבטחת העכבר על מכסת צלחת 15 סנטימטר. בהשוואה למודל העורק הראשי, המודל עורק וריד mesenteric קל יותר ופחות בניתוח אינטנסיבי. עם זאת, כאמור בסעיף התוצאה, בשל הסיקור של הכלי על ידי רקמת שומן, המודל פקק mesenteric עדיף ללימוד פקק ורידים אבל דורש גודל מדגם גדול יותר כדי למזער את השגיאה בין עכברים שונים.

המגבלה של מודל זה היא כי המנגנון אינו ברור עדיין שנוי במחלוקת. בתחילה, המנגנון של מודל זה היה ככל הנראה זה של FeCl 3 שנוצר denudation המושרה ROS של תאי אנדותל, ו subsequently הוביל לחשיפה של מרכיבי דם אל subendothelium prothrombotic, כדי להבהיר הידבקות טסיות, צבירת פקיק היווצרות 6,11. על ידי הכינון מחדש של טסיות טרום שטופלו נוגדן GPVI העכברים thrombocytopenic, שהראנו כי המודל 3 FeCl תלוי טסיות GPVI, ו GPVI טסיות חסימת עכבות דרמטי FeCl 3 המושרה thrombi היווצרות 19. ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 38 ומציע שהמודל FeCl 3 עשוי להיות סביר יותר לחקות את הפתופיזיולוגיה של קרע פלאק טרשת עורקי אדם בתיווך פקק 6. עם זאת, מספר מחקרים חדשים הציעו מנגנונים חדשים כוללים הדבקה של תאי דם אדומים בדפנות כלי הדם, כמו גם שפעת physiochemical של צבירת FeCl 3 מושרה של חלבוני פלזמה ותא דם 29,30. תובנות חדשות אלה מראים את המנגנונים האפשריים של מודל זה עשוי להיות מורכב יותר.

על ידי טפטוף של RBCs דיל שכותרתו לתוך עכברים thrombocytopenic ולאחר מכן גרימת FeCl 3 -triggered פגיעה בעורק התרדמה עם 7.5% FeCl 3, מצאנו כי התאים העיקריים דבקות דפנות כלי שאנשים פגועים טסיות (איור 6 ווידאו 5 באינטרנט ). לא מצאנו הידבקות RBCs ברור, ואת הצטברות של RBCs של thrombi נראה הסיכוי הטוב ביותר להיות תוצאה של השמנה. הממצאים שלנו תואמים את המושגים של 39 המוסטאסיס ראשוניים ומשניים. ההבדל ההתבוננות שלנו מהדו"חות הקודמים שיהיו מעת היפוקסיה ושינוי המודינמי כמו במחקר על ידי Barr ועמיתיו 30, שם עורקי הראש FeCl 3 פצועים לבדיקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק נערכו בעכברים כי היה החדר השמאלי חשוף בעבר ללא סיוע של אוורור מכאני. ריכוז ופרמטרים המודינמיים החמצן בדם תהיה ירידה דרמטית הן ריאתיתפקוד לב יושפע מייד לאחר החזה נפתח ללא אוורור מכאני. מחסור בחמצן מקושר מזה זמן רב עם המפעילה של מסלול procoagulant ופקק 40 וגם עשוי לשפר את הידבקות RBC. פרסום האחרון אחר הראה כי טיפול של עורק התרדמה עם ריכוז גבוה מאוד של FeCl 3 (20%) למשך 5 או 10 מוביל דק לריכוז מצב יציב של FeCl 3 ב ~ 50 מ"מ לומן של כלי השיט נפגע 29 . הם ובכך חדורים ישירות 50 מ"מימ FeCl 3 למרכיבי דם שונים ובדקו את השפעת FeCl 3 על צבירת vivo לשעבר, אשר הובילה אותם להציע מנגנון חדשני, 2 פאזיים הפעולה של FeCl 3 ב היווצרות פקיק 29. למרות די מעניין, התוצאות ממחקר זה צריך לפרש בזהירות כפי שהוא אינו מייצג את מודל 3 FeCl נפוץ. בניגוד הריכוז הגבוה של FECl 3 (20%, 1M כמצוין בעיתון) וטיפול ארוך (5 או 10 דקות), המחקרים הקודמים שלנו, כמו גם בר ואח. הטיפול הראו כי 10% 3 FeCl דקות 1 זה מספיק כדי לגרום להיווצרות קרישי דם occlusive מהירה בעורק התרדמה תוך 7 דקות 6,30. בנוסף, ברוב של ניסויים תוך שימוש במודל 3 FeCl, ריכוז נמוך יותר של FeCl 3 (5 - 7.5%) משמש.

מגבלה נוספת של מודל זה היא כי בשל הפגיעה חמצוני חמור האנדותל וכן denudation אנדותל שלאחר FeCl 3 טיפול, מודל זה עשוי להיות לא כלי ראוי ללמוד פקקת הקשורים דלקת האנדותל. עם זאת, על ידי שימוש בטכניקות אלה כדי להכין את העורק הראשי בשילוב עם טפטוף של לויקוציטים שכותרתו fluorescently, אנו יכולים לבדוק את ההידבקות המתגלגלת של לויקוציטים על האנדותל הדלקתי 41.

בשנת Summהאר"י, יש לנו מזוקק טופל המודל לפגיעה בכלי הדם FeCl 3 -induced לייצר פגיעה לשחזור ביותר על העורק הראשי ואת לכמת זמן הפסקת זרימת הדם באופן מדויק על ידי מיקרוסקופיה intravital. מודל זה הוא מספיק רגיש כדי לבדוק את הקרישה ותרופות אנטי טסיות, והוא מתאים גם מחקרים של ננו-רפואה במיקוד thrombi. בשילוב עם השתלת מח עצם, עירוי טסיות לתוך עכברי thrombocytopenic או ההזרקה תוך-ישירה של תרופות מועמדות, אנו הוכחנו כי זה הוא כלי נוח, פשוט רגיש ללמוד פקקו in vivo 7-10,16,19,42,43 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
מי כלוריד-induced Ferric מודלים פקקת Murine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter