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Medicine

Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

doi: 10.3791/54479 Published: September 5, 2016

Summary

Se presenta un procedimiento de refinado del cloruro férrico (FeCl3) modelos de trombosis inducidas en la carótida y la arteria mesentérica, así como la vena, que se caracteriza de manera eficiente mediante microscopía intravital para monitorear el tiempo de oclusiva formación de trombos.

Introduction

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La trombosis arterial (coágulos de sangre) es una complicación común de muchas enfermedades sistémicas asociadas con la inflamación crónica, incluyendo la aterosclerosis, la diabetes, la obesidad, el cáncer y los trastornos autoinmunes reumatológicas crónicas. Los trombos que se presentan en el tronco circulación arterial de la activación plaquetaria inadecuada, agregación y mecanismos procoagulantes posteriores, y están implicados en los ataques cardíacos, accidentes cerebrovasculares y la pérdida de la extremidad. La pared del vaso es un sistema complejo que incluye múltiples tipos de células y está influenciada por una multitud de factores extrínsecos como el estrés de cizallamiento, las células de la sangre, hormonas y citoquinas, así como la expresión de proteínas antioxidantes que circula en la pared del vaso. Experimentos in vitro no pueden replicar este entorno complejo y por lo tanto en estudios in vivo utilizando modelos animales son críticos para permitir una mejor comprensión de los mecanismos implicados en los trastornos trombóticos.

Los ratones han demostrado tener simmecanismos ILAR a los seres humanos en términos de la trombosis, aterosclerosis, inflamación y diabetes 1,2. Además, los ratones transgénicos y knockout pueden ser creados para probar la función de los productos génicos específicos en un complejo fisiológico o patológico ambiente. Tales estudios imitan la patología humana y pueden proporcionar información sobre el mecanismo importante relacionada con el descubrimiento de nuevas vías y terapias, así como proporcionar detalles importantes en la caracterización de los efectos de la droga sobre la trombosis.

Trombos arteriales patológicas se producen debido a la lesión endotelial capa o disfunción y la exposición de la corriente de la sangre a la matriz subendotelial 3,4. Varios modelos de trombosis se han desarrollado para inducir este daño endotelial tales como la lesión mecánica, lesión oxidativa a base de Bengala compuesto fotorreactivo Rose y lesiones láser 5. En este espectro, cloruro férrico (FeCl3) inducida por la lesión vascular es un modelo ampliamente utilizado de trombosis. Este reactivo cuandose aplica a la cara externa de los vasos induce daño oxidativo a las células vasculares 6-8, con pérdida de la protección de las células endoteliales a partir de plaquetas y componentes de la cascada de coagulación circulantes. El modelo de FeCl 3 es simple y sensible tanto a anticoagulante y anti-plaquetas medicamentos, y se ha realizado en arterias carótida y femoral, vena yugular, y mesentérica y arteriolas y vénulas cremastéricos en ratones, ratas, cobayas y conejos 6-15.

Un parámetro medible en este modelo es el tiempo transcurrido desde la lesión hasta completar la oclusión del vaso, medida como cese el flujo de sangre con un medidor de flujo Doppler o bajo la observación directa con 6,7,9 microscopía intravital. Una gama de tiempos entre 5 a 30 min se ha informado en diferentes estudios en ratones C57Bl6 7-10,16, lo que sugiere que FeCl 3 concentraciones, tipos de anestesia, las técnicas quirúrgicas, la edad del ratón, fondo genómico, método de medición de bLood flujo, y otras variables ambientales tienen efectos significativos en este modelo. Esta amplia variabilidad hace que sea difícil comparar los estudios de diferentes grupos de investigación y puede hacer la detección de diferencias sutiles difícil.

Con una visión para minimizar tales variabilidades y establecer un reproducible uniformemente en el sistema de modelo in vivo, hemos refinado el modelo de arteria carótida inducida por FeCl3 que hace que los datos altamente reproducibles con una variación mínima 6-10,16-19. En este trabajo se describen y compartir las habilidades y presenta varios ejemplos experimentales representativos que pueden beneficiarse de este modelo.

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Protocol

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Todos los procedimientos y manipulaciones de los animales han sido aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC) de la Clínica de Cleveland, en conformidad con la política de Estados Unidos Servicio de Salud Pública en el cuidado humano y Uso de Animales, y la Guía de los NIH para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio.

1. Preparación:

  1. Tinte fluorescente para el etiquetado de plaquetas
    1. Preparar la solución 6G rodamina, 0,5 mg / ml, en solución salina y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro.
  2. FeCl3 Solución
    1. Hacer una solución madre fresca de 30% FeCl 3 (anhidro, es igual a 1,85 M) en agua pura, y el filtro con 0,45 micras filtro. Preparar 5 ml fresco FeCl3 solución a la concentración deseada [por ejemplo, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) y 12,5% (0,771 M)] por diluir la solución al 30% de FeCl3 con i aguana 6 cm placa de cultivo de tejidos y mantener la tapa cerrada.
      NOTA: El uso de la placa de cultivo hace que sea más fácil para recoger el papel de filtro saturado con una solución de FeCl3 que a recogerlo en un recipiente estrecho, tal como un tubo de 1.5 ml. FeCl3 es extremadamente peligroso y que las precauciones, tales como el uso de guantes y bata de laboratorio, etc., equipo de protección personal, siempre se debe tomar.
  3. Papeles de filtro
    1. Cortar el papel de filtro de 1 mm x 2 mm de tamaño. Remojar suficientes piezas de papel de filtro de corte en la solución de FeCl3 en el mismo plato.
  4. Solución de clorhidrato de papaverina
    1. Preparar la solución de hidrocloruro de papaverina (25 mg / ml) en agua y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro.
  5. en gel de agarosa
    1. Preparar 2% en gel de agarosa en PBS o solución salina en la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, ~ 1 cm de espesor, y cut a semicírculo con ~ 3 cm de diámetro.

2. FeCl 3 inducida por lesión arterial carotídea Modelo de trombosis

  1. Procedimientos quirúrgicos para el modelo de trombosis
    1. Utilice 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad (u otras cepas como sea necesario). Anestesiar los ratones con la mezcla de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. Confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie.
      NOTA: Esta cantidad de ketamina / xilazina es suficiente para mantener al animal en la anestesia estable y sin dolor (respuesta a los pies de apriete) durante al menos 1 hr.
    2. Retire la piel en el cuello y parte superior del pecho con una pequeña maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario. Aplicar el ungüento oftálmico de petróleo neutro en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
    3. Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice una cinta larga (~ 10 cm) para asegurar hinextremidades d e inferior del cuerpo, y dos piezas de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar las patas delanteras. Utilice una sutura 4-0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto del ratón (Figura 2).
    4. Coloque la placa con la cabeza del ratón sobre el usuario bajo una fuente de luz quirúrgica.
    5. Esterilizar la zona quirúrgica con algodón empapado en alcohol. Usa los micro-Adson fórceps para mantener la piel y utilizar unas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión (2 - 3 mm).
    6. Manteniendo la piel de la incisión con el fórceps y tijeras quirúrgicas insertar con las mordazas cerradas en la incisión. Empuje las tijeras por vía subcutánea hacia el manubrio o la barbilla, y luego abrir las tijeras para liberar la piel de la capa subcutánea.
    7. Cortar la piel con las tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la línea media del manubrio al nivel del hueso hioides (Figura 3A y 3B). Sin rodeos diseccionar la fascia delgada (línea punteada, en (Figura 3B y 3C; flechas azules).
      NOTA: El manubrio (flecha negro en la figura 3C) y la tráquea (T en la figura 3C) se verán después de este paso.
    8. Mantener el tejido blando y la piel que se observa a la derecha del manubrio con las pinzas Graefe, inserte la pinza debajo de la faja hacia la posición de 2 horas (amarillo línea de puntos en la figura 3C), abrir las mordazas de la pinza hemostática para liberar el vena yugular del tejido circundante.
    9. Cortar la fascia, el tejido blando y la piel hacia la posición dos (Figura 3C) con las tijeras quirúrgicas para exponer la vena yugular derecha (Figura 3D, flecha).
    10. Dibuje alrededor de 200 - 300 l solución 6G rodamina usando una jeringa de 1 ml con aguja de 22 G y entonces el cambioa 30 de la aguja G.
      NOTA: Esto protege la aguja 30 G del daño de su punta fina. Directamente arrastrar la solución de rodamina 6G con la aguja 30 G no dañará la punta; Sin embargo tocando la pared del recipiente accidental puede causar daños, lo que puede hacer la inyección difícil.
    11. Enjuague la aguja de 30 G por lentamente empujando a la solución 6G rodamina, asegurarse de que no queden burbujas de aire en la jeringa o la aguja. Mantenga 100 l rodamina 6G solución inyectable.
    12. Curva 2 - 3 mm punta de la aguja a un ángulo de 90 ° con el soporte de la aguja, lo que impedirá la inserción de la aguja es demasiado profunda para la vena yugular y hace que la inyección sea más fácil de controlar (Figura 3D).
    13. Se inyecta la solución de rodamina 6G en la vena yugular derecha a las plaquetas de la etiqueta. Para estabilizar la jeringa y mantener la aguja en posición, mantener la jeringa con una mano y la aguja con el fórceps Graefe con la otra mano durante el injection.After inyección, sujetar el sitio de la inyección con las pinzas Graefe para evitar el sangrado.
    14. Abrir las mordazas de la pinza hemostática e insertarse con las pinzas para sujetar Graefe la pared del vaso de la zona de la inyección, y luego ligar el sitio de la inyección con una sutura 6-0.
      NOTA: Como una alternativa de paso 2.1.15, aplicando presión a la zona de inyección con un dedo durante 2 minutos se detendrá el sangrado; Sin embargo, este método tiene un riesgo de causar sangrado si el coágulo en el sitio de inyección se retira accidentalmente más.
    15. Sin rodeos diseccionar el tejido blando y la fascia alrededor de la glándula submaxilar izquierda con la pinza y la pinza Graefe y tire de la glándula hacia la posición 7 horas (Figura 3E) para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo (flecha azul en la Figura 3E).
    16. Sin rodeos diseccionar la fascia (Figura 3E, línea punteada) entre el músculo esternocleidomastoideo izquierdo y el músculo omohioideo o la sternohyOID muscular (Figura 3E, flecha verde) situado a la izquierda del sitio de la tráquea con la pinza hemostática.
    17. Pasar una aguja con sutura de seda 6-0 (alrededor de 15 cm de longitud) en el medio del músculo esternocleidomastoideo (flecha azul en la Figura 3E), poner los dos extremos de la sutura en conjunto y tire de la sutura lateralmente hacia la posición de diez .
      NOTA: Este procedimiento debe realizarse con cuidado para evitar lesiones de la vena yugular izquierda, que se encuentra fuera del músculo esternocleidomastoideo.
    18. Sin rodeos separar el músculo esternohioideo delgada y / o músculo omohioideo para exponer la arteria carótida (CA) (Figura 3F flecha) después de alejarse del músculo esternocleidomastoideo. Cortar el músculo esternohioideo y / o músculo omohioideo según sea necesario. Utilice la pinza hemostática para separar el tejido blando de CA sin tocar la CA.
      NOTA: CA está acompañado por el nervio vago, la estructura se ve en blanco la Figura 3F).
    19. Use unas pinzas de punta para recoger la fascia lateral alrededor de la CA, evitando el nervio vago y CA. Use otros fórceps de punta fina para perforar un agujero en la fascia entre el CA y el nervio vago.
    20. Pasar el gancho a través del agujero y levante suavemente la CA, y luego colocar las pinzas de punta fina bajo la CA. Mover el gancho y fórceps en direcciones opuestas a lo largo del CA para despojar a los tejidos blandos de la adventicia. Libre de al menos 5 ~ mm de longitud de CA (Figura 3H, flecha azul) del tejido circundante.
    21. Para bloquear la fluorescencia de fondo, presione el extremo de un plástico negro agitador de café al piso, CrossCut el agitador de café en una pieza de 3 mm, y luego se corta longitudinalmente a lo largo de los bordes de plegado para obtener dos piezas de "T" de plástico de forma (Figura 3H, verde flecha).
    22. (Figura 3H, flecha verde). Inmediatamente aplique 2-3 gotas de solución salina para evitar el secado de la CA.
  2. En tiempo real de grabación de vídeo
    1. Transferir la tapa del ratón y la placa junto a la platina del microscopio y colocar en una posición apropiada bajo la lente de 10X agua. Llenar el espacio entre la lente de 10X y la CA con solución salina.
    2. Iniciar la aplicación de software de grabación de vídeo digital, y poner en marcha un nuevo archivo y el nombre que en consecuencia. Grabar imágenes de los vasos normales y anote el número de cuadro cuando se detiene la grabación de vídeo.
      NOTA: Consulte el software de grabación de vídeo en el equipo para la grabación. Utilizamos software de grabación de vídeo digital y las siguientes descripciones se basan en esta aplicación.
      NOTA: Desde tra mecánicauma puede dañar el endotelio y dar lugar a la formación de trombos 20, es necesario para confirmar que no hay una lesión quirúrgica en la pared del vaso antes de la lesión FeCl 3. También es necesario para confirmar que no hay tejido restante alrededor de la CA, que puede formar una barrera y atenuar el efecto de FeCl 3 lesión inducida. Anote el número de cuadro de los registros hará que sea fácil de analizar los vídeos según los tiempos transcurridos después.
    3. Mover el ratón con la tapa de la placa de la lente de 10X. Doblar una esquina de una toalla de papel para hacer una punta delgada y fina y utilizarlo para borrar cuidadosamente la solución salina alrededor del CA (evite tocar CA), así como en otros lugares en el campo quirúrgico. Esto es importante para evitar la dilución de la solución de FeCl 3 utilizado.
    4. Use unas pinzas de punta y recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de FeCl3 y colocarlo directamente en la CA y mantenerlo en el sitio durante 1 min.
      NOTA: To visualización de la ayuda de la información exacta del torrente sanguíneo y cosecha, coloque el papel de filtro cerca del extremo distal del expuestos CA (Figura 3I) y dejar un pequeño segmento en el sitio proximal (flecha verde en la figura 3I) para observar el flujo sanguíneo en la última hora fase (ver abajo).
    5. Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de "después de la lesión") y enjuague la CA con solución salina (al menos 2 ml).
    6. Ponga el ratón con la tapa de la placa posterior de la lente de 10X; observar el barco y empezar a grabar imágenes de vídeo. Anote el número de fotogramas de vídeo al final del primer minuto de grabación.
      NOTA: La formación de trombos se identifica por la acumulación de las plaquetas fluorescentes, que se observa en las imágenes de vídeo en tiempo real en la pantalla del ordenador o bajo microscopio. Grabar imágenes de vídeo inmediatamente después de poner el ratón de nuevo bajo el microscopio. Mantenga la grabación hasta el final de la primera minutos después de retirar la filtrar papel. Observar todo el barco desde el extremo distal de los sitios proximales para obtener información acerca de la lesión, y luego se centran en el área de interés (por lo general es el centro de la zona lesionada) para obtener más imágenes.
    7. Imágenes de vídeo de registro para 10 seg cada minuto para la primera 10 min (por ejemplo, 02:55-03:05) y después 10 seg cada dos minutos hasta el final del experimento. Escribir los números del bastidor cuando se detiene cada grabación.
      NOTA: Los puntos finales del modelo son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de> 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión. En este caso, el uso de 30 minutos para el análisis estadístico. Establecer el tiempo de exposición de la grabación de vídeo de hasta 10 ms al inicio, por lo que será fácil de observar el flujo sanguíneo a través de los trombos. Cuando los trombos se hacen grandes y la fluorescencia satura sensor de la cámara, se hace difícil para identificar el flujo de sangre a través de los trombos. Para resolver este problema, mueva la imagen center al sitio ileso proximal (Figura 3I, flecha verde) donde el flujo de sangre que aún se puede observar con claridad. También aumentan el tiempo de exposicion a 15 o 20 ms cuando se enfoca en el sitio de la ONU con lesión proximal, por lo que el flujo de sangre se puede observar con mayor claridad. Cuando el flujo sanguíneo cesará, numerosas células más grandes (leucocitos) empiezan a rodar por la pared del vaso en el sitio proximal del trombo. Flujo general se detiene en 2 - 3 min después de la aparición de las células grandes. Anote la hora Expose en la hoja de registro si se cambia. Por lo general toma alrededor de 30 minutos de la anestesia hasta el final del experimento, si se utilizaran los de tipo salvaje ratones normales C57BL6.
      PRECAUCIÓN NOTA: No utilice el coágulo de plaquetas agregadas blanco como el signo de la cesación del flujo sanguíneo, lo que no dará una información precisa y se ve afectada por el tiempo de exposición. El coágulo blanco cubrió la luz del vaso no significa que el flujo de sangre dejado (ver el video representativa 1).

3. FeCl3 inducida por la arteria mesentérica / Trombosis Venosa Modelo

  1. Anestesiar 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad como se mencionó en la sección 2.1.1. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
  2. Inyectar la solución papaverina (en total 0,4 mg / ratón) por vía intraperitoneal para inhibir el peristaltismo intestinal.
  3. Retire la piel en el cuello y el abdomen con una maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario.
  4. Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice cuatro trozos de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar todas las piernas. Utilice una sutura de 4 -0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto (Figura 2).
  5. Siga los procedimientos 2.1.4 -2.1.15 para exponer la vena yugular para la inyección de rodamina 6G a las plaquetas de la etiqueta.
  6. Realizar una incisión en la línea media a través de la piel de la xifoides hasta el abdomen inferior con las tijeras quirúrgicas (Figura 4A). Recoger el peritoneo medio (también llamada línea alba, la figura 4A, flecha) con una pinza Graefe, que es clara y no tiene vasos sanguíneos, levantar unos 2 - 3 mm de altura, confirmar ninguna de intestino bajo la línea de corte, y cortar el peritoneo abierto longitudinalmente con las tijeras finas (Figura 4B).
  7. Vuelva a asegurar los ratones a la posición lateral derecha. Colocar el gel de agarosa de medio círculo cerca del abdomen, y exteriorizar suavemente los intestinos y se extendió en la parte superior del gel con las pinzas Graefe (Figura 4C). Usa los segundos ramales para el experimento trombosis (Figura 4C, flecha).
    NOTA: Utilice la pinza o pinzas de micro-Adson para ayudar a exteriorizar los intestinos. Evitar herir laintestino y el recipiente.
  8. Coloque 5-6 gotas de solución salina para mantener la humedad del intestino y de los vasos. Transferir el ratón con la tapa de placa junto a la platina del microscopio y colocar en la posición adecuada debajo de la lente seca 10X.
    NOTA: Utilice un objetivo seco porque la membrana yeyunoileales no puede contener solución salina. Asegúrese de dejar caer una solución salina en los tejidos expuestos a mantenerlos húmedos.
  9. Secar la solución salina alrededor de la arteria mesentérica y vena antes del tratamiento.
  10. Use unas pinzas de punta para recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de 12,5% de FeCl3 y colocarlo directamente en la arteria mesentérica y vena durante 1 min (Figura 4D). Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de "después de la lesión") y enjuagar la arteria mesentérica heridos y la vena con solución salina (al menos 2 ml).
  11. Ponga el ratón con la tapa de la placa de nuevo bajo la lente seca 10X; observar los vasos y empezar a RECord imágenes de vídeo que se han mencionado en el punto 2.2).
    NOTA: Los puntos finales de este experimento son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de> 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión, y en este caso utilizar 30 min para el análisis estadístico.
  12. Al final del experimento, la eutanasia a los ratones utilizando una sobredosis de ketamina / xilazina (200/20 mg / Kg), seguido por dislocación cervical después sin respiración y los latidos del corazón se confirman.

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Representative Results

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La trombosis de la arteria carótida Modelo
En ratones C57BL6 con el fondo, se recomienda utilizar 7,5% FeCl3 para el tratamiento de la embarcación durante 1 min como punto de partida. Bajo tratamiento de 7,5% FeCl3, las fronteras de la zona lesionada y la pared vascular normal se identifican fácilmente bajo el microscopio (Ver video en línea 1), lo que sugiere que la capa endotelial fue dañado de manera significativa. El trombo formado inmediatamente después de FeCl3 tratamiento, y se observan en todos los ratones WT C57BL6 1 min después de la lesión. Los trombos formados inicialmente son inestables y partes de ellas son generalmente arrastrados por la corriente de la sangre, por lo que los trombos formados se hacen más pequeñas con un 2 - 3 min después de la lesión. Los trombos se inicia ampliar de 3 - 4 min después de retirar el papel de filtro y estos trombos se forman más tarde son estables y por lo general no son lavados. El tiempo de oclusiva media es de 11,3 ± 3,16 min en los ratones C57BL6 (n = 14) cuando 7,5% FeCl 3 se utiliza 6,7,19 (Figura 5A y video en línea 1). En los estudios anteriores se ha demostrado que tanto la disminución y aumento de FeCl 3 concentraciones disminuyen la diferencia entre una cepa de ratón anti-trombótico y los ratones WT 6; A partir de nuestra experiencia, el tratamiento de la arteria carótida con un 7,5% de FeCl3 durante 1 minuto es suficiente para satisfacer a todos nuestros propósitos. Además de la función de genes específicos probar el uso de ratones knockout 7,8,16,19,21, después de cuatro experimentos representativos que utilizan este modelo:

Perfusión intravenosa de tejido de tipo activador del plasminógeno mediada por Trombolisis
-Activador del plasminógeno tisular (tPA) es uno de los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento de la trombolisis en los Estados Unidos 22. Además, observamos la trombolisis mediada por tPA en el modelo de trombosis de la arteria carótida. trombosis erainició con un 7,5% de FeCl3 y se dejó formar durante 5 minutos antes de tPA (1 mg / kg de peso corporal) se perfundió a través de un catéter yugular (22GA). Como se muestra en la Figura 5B y de vídeo en línea 2, el trombo magnificado continuamente y ocupó aproximadamente el 50% de la luz 5 min después de la lesión. Los trombos continuó para agrandar después de tPA perfusión lo que sugiere que tPA no afecta a la activación y agregación de plaquetas. La trombolisis se inició aproximadamente 4 minutos después de la inyección de tPA. se encontró que el trombos formados a someterse a variaciones de tamaño en varias ocasiones durante el periodo de observación de 30 min y la oclusión del vaso no ocurrió en este caso. Estos datos demostraron claramente que tPA no puede inhibir completamente la formación de trombos de plaquetas mediada, incluso si se lleva a la trombólisis. Por lo tanto, nos imaginamos que los futuros experimentos que utilizan el modelo de trombosis arterial inducida por FeCl 3 se pueden utilizar para evaluar trombolítico y otros tratamientos complementarios que puede tener un prev prominenteefecto repre- en la formación de trombos.

La perfusión de PAR4 de anticuerpos a ratones inhibe la trombosis
Proteasa receptor activado 4 (PAR4) es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) en las plaquetas que se activa por escisión proteolítica de su exodominio N-terminal 23 y, posteriormente, conduce a pasos de activación de las plaquetas. El laboratorio Nieman ha generado una cabra policlonal PAR4 anticuerpo (CAN12) que se dirige a la agrupación aniónica de PAR4, y retrasa PAR4 escisión, lo que afecta un paso crítico para PAR4 mediada por la activación de plaquetas 24. Por la perfusión de 1 mg / Kg de este anticuerpo a los ratones C57BL6, se encontró que la inhibición de la escisión PAR4 prolongada significativamente los tiempos para la formación de trombos oclusivos en el FeCl 3 carótida inducida modelo de trombosis de la arteria 7,5% (Figura 5C y de vídeo en línea 3). Esto demuestra que el FeCl 3 inducida modelo de trombosis cun ser utilizados para evaluar los efectos de los agentes antiplaquetarios y caracterizar las posibles estrategias terapéuticas.

La focalización-trombos específica mediada por nanopartículas
coágulo de retirada rápida de restablecer el flujo de sangre es crucial en el tratamiento de enfermedades vasculares oclusivas incluyendo accidente cerebrovascular isquémico y el infarto de miocardio. El suministro sistémico de los fármacos trombolíticos, tales como tPA mostró anteriormente, puede lisar los trombos formados, pero no puede impedir por completo la activación de plaquetas y re-agregación / oclusión. Además, la entrega directa sistémica de estos agentes serina proteasa puede dar lugar a la acción indiscriminada fuera del objetivo, lo que lleva a los principales efectos secundarios que incluyen hemorragia. El laboratorio Sen Gupta ha diseñado vehículos de entrega sintético a base de nanopartículas de plaquetas de inspiración que pueden unirse a las plaquetas y proteínas activadas coágulos asociado bajo hemodinámica flujo de cizallamiento 25-27. lo tanto, examinar si estas nanopartículas puedense unen a los trombos que forman activamente en una arteria.

Como se ha mencionado en el experimento para tPA de perfusión, se insertó un catéter en la vena yugular y se conecta a una bomba de inyección para la inyección de nanopartículas a un caudal uniforme. En este experimento, no colorante de fluorescencia se inyectó en el ratón para etiquetar las plaquetas. En lugar de ello, las nanopartículas se marcaron con Rohdamine B; por lo tanto, fueron capaces de ser observado bajo microscopio intravital. La trombosis se inició con un 7,5% de FeCl3 tratamiento durante 1 min como se mencionó anteriormente. Dado que en los ratones WT, se encontró que una cantidad significativa de trombos para formar 5 min después de la lesión, se seleccionaron este punto de tiempo para la inyección de nanopartículas para detectar si las nanopartículas se unen eficientemente a los trombos que forman activamente. Como se muestra en la Figura 5D y video en línea 4, después de la inyección de nanopartículas fluorescentes, hemos sido capaces de identificar una forma de montañatrombo que consiguió quedar progresivamente por las partículas fluorescentes. Estos estudios demuestran la utilidad del modelo de trombosis inducida por FeCl 3 para evaluar la capacidad de orientación (y la eficacia terapéutica posterior) de los sistemas de administración de fármacos de partículas de coágulos de destino.

El papel de los glóbulos rojos que no sean plaquetas en la formación de trombos.
Estudios recientes han sugerido que las células rojas de la sangre (glóbulos rojos) desempeñan un papel importante en el modelo de trombosis inducida por FeCl3 28 y son el primer componente de la sangre adherido a la pared del vaso lesionado 29,30. Para explorar este fenómeno, hemos denominado RBC con 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (Dil, 10 mM de concentración final). Los glóbulos rojos marcados con Dil se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en solución salina con 35% de hematocrito. La suspensión de RBC marcada con Dil (100 l por ratón) se inyectaned en los ratones trombocitopénicos que han sido irradiados letalmente 5 días antes del experimento 19. Estos ratones tienen trombocitopenia significativa reducción de plaquetas, lo que aumentará la probabilidad de RBC que permanece a la pared del vaso, si lo hacen. En contraste con los experimentos con plaquetas marcadas con fluorescencia (Figura 5), no se encontró acumulación obvio de células fluorescentes en la pared del vaso después de la lesión vascular (Figura 6A, en línea v ideo 5). Sin embargo, junto con la formación de los trombos ricos en plaquetas, glóbulos rojos comenzaron a acumularse en el trombo que ilustra la forma del coágulo (Figura 6A). La tinción de inmunofluorescencia de la arteria carótida lesionada demostró que las células principales adheridas a la pared del vaso son plaquetas (CD41 positivo, verde), mientras que los glóbulos rojos marcados con Dil están atrapados principalmente dentro de los trombos (Figura 6B y C). Estos estudios demuestran que laFeCl 3 modelo de trombosis inducida se puede utilizar en la obtención de visión mecanicista en los componentes celulares y moleculares y eventos espacio-temporales en la formación de trombos.

Modelo de trombosis mesentérica
Para el modelo de trombosis mesentérica, una alta concentración de FeCl 3 - Se recomienda (10 12,5%) como los vasos suelen estar rodeados de tejido graso, lo que puede dificultar la difusión FeCl 3 hacia la pared del vaso y por lo tanto impide que el vaso de FeCl 3 inducida 7 lesión. Este modelo es más adecuada para el estudio de trombosis venosa. Como se muestra en el vídeo en línea 6, trombo fue visto alrededor de ~ 15 segundos en la vena mesentérica después de la aplicación tópica del papel de filtro saturado con FeCl solución al 12,5% 3, pero la formación de trombos se retrasa de manera espectacular en la arteria mesentérica. El tiempo medio para la formación del trombo oclusivo es de ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) en m vena esenteric y alrededor de 23 ± 9,9 min (n = 10) en la arteria mesentérica cuando el 12,5% de FeCl3 se utiliza 7.

Figura 1
Figura 1. Herramientas de la cirugía. Se muestran las herramientas mínimas necesarias para la cirugía del ratón. Ver la lista de materiales para obtener información más detallada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La fijación del ratón para la cirugía. Asegure el ratón sobre la tapa 15 cm placa de cultivo para el modelo de trombosis de la arteria carótida o para la inyección de un colorante rodamina 6G para el modelo de trombosis mesentérica.obtener = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Modelo de trombosis de la arteria carótida. Procedimientos para exponer la vena yugular, la inyección de rodamina 6G fluorescente del tinte en el sistema sanguíneo y la exposición de la arteria carótida izquierda se muestran. En (A), la línea indica la incisión de manubrio al nivel del hueso hioides; en (B), las flechas azules indican las glándulas submaxilares y líneas de puntos amarillos representan la fascia entre las glándulas submaxilares; en (C), las flechas azules indican las glándulas submaxilares, negro flecha indica manubrio, y salpicado línea amarilla indica la posición de corte para exponer la vena yugular; en (D), la flecha azul indica la vena yugular; en (E), la flecha amarilla indica glándula submaxilar izquierda, flecha azul indicatES dejaron músculo esternocleidomastoideo, salpicado línea amarilla indica la fascia, y la flecha verde indica omohioideo o el músculo esternohioideo; en (F), la flecha azul indica la arteria carótida, las líneas de puntos amarillos muestran el músculo esternohioideo delgada y / o omohioideo; en (G), la flecha azul indica la arteria carótida y la flecha verde indica nervio vago; en (H), la flecha azul indica la arteria carótida y la flecha verde indica que el plástico "forma de U" agitador de café; y en (I), en la flecha azul indica el papel de filtro se encuentra con una solución de FeCl3, y la flecha verde indica la arteria carótida. T indica la tráquea. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
la Figura 4. arteria mesentérica y la trombosis venosa Modelo. La exposición de los vasos mesentéricos, así como FeCl3 tratamiento. En (A), la flecha azul indica la línea alba, el tejido fibroso blanco, sin buque; En (B), una incisión corta solo se muestra la línea alba; en (C), las flechas azules indican el segundo arco de las arterias mesentéricas y las venas; en (D), la flecha azul indica el papel de filtro se encuentra con una solución de FeCl3. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Los experimentos representativos que utilizan la arteria carótida Modelo de trombosis. (A). La formación de trombos en theC57Bl / 6 de ratón tratados con 70,5% de FeCl3. (B). TPA mediada efecto trombolítico. (C). La inyección de anticuerpo dirigido a un receptor de la trombina del ratón sobre PAR4 se demostró trombosis. (D). Trombo-dirigida de sitio-nanovehículos se unen específicamente a se demostró de forma activa la formación de trombos . Inj. P indica la inyección de partículas; y el Pico B indica el pico de bandas de partículas a los trombos. Todas las imágenes fueron tomadas en virtud de los mismos aumentos. Barra de escala = 300 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Papel de RBC en la formación de trombos. (A) ratones que recibieron Trombocitopénica perfusión de glóbulos rojos marcados con Dil fueron sometidos a la arteria de modelo y de imágenes trombosis carotídea después de 7,5% FeCl (B y C) Las arterias carótidas lesionadas fueron cosechadas, y se prepararon secciones congeladas. Las plaquetas se tiñeron con CD41 (verde) y los glóbulos rojos se muestra como rojo (Dil). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Los buques que se muestran en (B y C) eran de dos ratones diferentes. Las barras de escala = 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

video 1
Video 1: vídeo Representante del modelo de trombosis de arteria carótida en ratones de tipo salvaje (WT). (Haga clic aquí para descargar.) Este video muestra la formación de trombos representante en la arteria carótida de los ratones WT inducida por el papel de filtro situado en la aplicación tópicacon un 7,5% de solución de FeCl3. Las plaquetas se marcaron mediante la inyección intravenosa de rodamina 6G, y el vídeo fue tomada en el modo monocromo. La masa blanca es coagulada plaquetas.

video 2
Video 2: activador tisular del plasminógeno (tPA) mediada por efecto trombolítico detectado por el modelo de trombosis de la arteria carótida. (Haga clic aquí para descargar.) El etiquetado de plaquetas y formación de trombos se iniciaron como se menciona en el video 1 y tPA se inyectaron por vía intravenosa 5 minutos después de 7,5% FeCl3 lesión.

video 3
Video 3: fármaco antiplaquetario, na mely anti-proteasa activada receptor 4 (PAR4) de anticuerpos, el efecto anti-trombótico detectada por el modelo de trombosis de arteria carótida mediada. (Haga clic aquí para descargar.) En este experimento, los ratones recibieron anticuerpos PAR4 y rodamina 6G inyección de 10 minutos antes de la formación de trombos se inició mediante la aplicación tópica de papel de filtro situado con un 7,5% de FeCl3.

vídeo 4
Video 4: focalización-trombos específica de nanopartículas mediada. (Haga clic aquí para descargar.) En este experimento, la formación de trombos arteria carótida se inició con un 7,5% de FeCl3 sin plaquetas etiquetado. Nanopartículas se marcó con Rodamina B y por vía intravenosa inyectada en el ratón 5 min después de la lesión.

Video 5 "src =" / files / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Vídeo 5: unión de las células rojas de la sangre detectadas por el modelo de trombosis de la arteria carótida. (Haga clic aquí para descargar.) Los glóbulos rojos (eritrocitos) se marcaron con 1,1-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (Dil, 10 mM de concentración final) y 100 l de la los glóbulos rojos marcados con Dil (35% de hematocrito) se inyectaron en los ratones trombocitopénicos. No etiquetado de plaquetas se realizó en este experimento. Trombo se inició como se mencionó anteriormente with7.5% FeCl 3.

Video 6
Video 6: Vídeo Representante de la arteria y la vena mesentérica modelo de trombosis en los ratones WT. (Haga click para descargar.) Las plaquetas se marcaron mediante la inyección intravenosa de rodamina 6G, y el trombo se inició después de la aplicación tópica de una pieza de papel de filtro con una solución de 12,5% FeCl3 durante 1 min. El recipiente se observó bajo 10X seco.

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El FeCl3 inducida modelo es uno de los modelos de trombosis más ampliamente usados, que no sólo pueden proporcionar información valiosa acerca de las modificaciones genéticas sobre la función plaquetaria y trombosis 7,8,16,19,31-33, pero también puede ser una herramienta valiosa para la evaluación de compuestos terapéuticos y estrategias para el tratamiento y prevención de enfermedades aterotrombóticos 11,17,34-37. Aquí hemos demostrado que nuestros modificaciones y refinamientos de este modelo y mostró evidencia adicional de la utilidad de esta técnica, que es lo suficientemente sensible para determinar los efectos del anticoagulante (tPA) y antiagregantes plaquetarios (anticuerpos PAR4). Además del estudio mecanicista de la trombosis, el modelo también se puede utilizar para estudiar, la administración de fármacos trombos orientada basada en las nanotecnologías. También se puede utilizar para la detección de la formación de la pared del vaso especies reactivas de oxígeno (ROS) por inyección de fluorescente indicador ROS 21.

Meticulosotécnicas son necesarias para llevar a cabo estos modelos. El operador debe tener suficientes habilidades quirúrgicas, así como un profundo conocimiento de la biología de las células vasculares y la sangre. Varios puntos clave de la carótida inducida modelo de trombosis de la arteria FeCl3 son 6: (1) exponer suficiente longitud de la arteria carótida (~ 5 mm) para permitir la aplicación del papel de filtro y dejar un espacio para observar el flujo sanguíneo bajo microscopía intravital en la fase tardía ; (2) despojar claramente el adventicio de tejido blando alrededor de la arteria carótida para permitir que el papel de filtro para ponerse en contacto con la pared del vaso directamente y producir una lesión, incluso; (3) confirmar ninguna lesión mecánica a la pared del vaso y no la formación de trombos antes de la aplicación de FeCl 3 saturada con papel de filtro; (4) la base de la arteria carótida con una pieza de "U" en forma de plástico negro para separar la arteria del tejido circundante, para bloquear la fluorescencia de fondo, y para evitar FeCl 3 difusión. Por estas estrategias, hemos generado altamentedatos reproducibles con el tipo salvaje ratones C57BL / 6, y de esta cepa de ratón 7,5% FeCl3 tiempo trombosis inducida es de 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. La inyección en la vena yugular de la rodamina 6G para etiquetar células circulantes puede ser un reto. Como alternativa, una inyección en vena de cola puede llevar a cabo antes de fijar el puntero del ratón sobre la tapa placa de 15 cm. En comparación con el modelo de arteria carótida, el modelo de la arteria y la vena mesentérica es más fácil y menos quirúrgicamente intensivo. Sin embargo, como se mencionó en la sección de resultados, debido a la cobertura de los buques por el tejido adiposo, el modelo de trombosis mesentérica es mejor para el estudio de la trombosis venosa, pero requiere un tamaño de muestra más grande para minimizar el error entre diferentes ratones.

La limitación de este modelo es que el mecanismo no está claro y todavía controvertido. Inicialmente, se creía que el mecanismo de este modelo a ser la de FeCl 3 generada denudación inducida por ROS de las células endoteliales, y subsequently llevado a la exposición de los componentes de la sangre al subendotelio protrombótico, para hacer que la adhesión de plaquetas, agregación y formación de trombos 6,11. Por reconstitución de plaquetas pre-tratados con anticuerpo GPVI a los ratones trombocitopénicos, hemos demostrado que el modelo de FeCl 3 depende de GPVI de plaquetas, y el bloqueo de GPVI de plaquetas inhibido drásticamente FeCl 3 inducida por la formación de trombos 19. Este resultado está en línea con los informes anteriores 38 y sugiere que el modelo de FeCl3 puede ser más propensos a imitar la fisiopatología de la ruptura de la placa aterosclerótica humana trombosis 6 mediada. Sin embargo, varios estudios recientes han propuesto nuevos mecanismos que incluyen la adhesión de las células rojas de la sangre a la pared del vaso, así como efecto fisicoquímico de FeCl 3 agregación inducida de las proteínas del plasma y los glóbulos 29,30. Estas nuevas percepciones sugieren que los mecanismos potenciales de este modelo pueden ser más complejos.

Por la perfusión de los glóbulos rojos marcados con Dil en los ratones con trombocitopenia y luego inducir FeCl3 -Accionados lesión en la arteria carótida con un 7,5% de FeCl3, se encontró que las células principales que se adhieren a las paredes de los vasos lesionados son plaquetas (Figura 6 y video en línea 5 ). No hemos encontrado adhesión RBCs obvia, y la acumulación de glóbulos rojos en los trombos parecía más probable que sea resultado de la captura. Nuestros resultados coinciden con los conceptos de la hemostasia primaria y secundaria 39. La diferencia de nuestra observación a partir de los informes anteriores puede ser de hipoxia y el cambio hemodinámico como en el estudio realizado por Barr et al 30, en donde se prepararon los FeCl3 arterias carótidas lesionadas de examen de microscopía electrónica de barrido en los ratones que tenían el ventrículo izquierdo anteriormente expuesto sin asistencia de un VENTILACIÓN mecánica. concentración de oxígeno en la sangre y la hemodinámica se reducirá drásticamente a medida que tanto pulmonar yla función cardíaca se verá afectada inmediatamente después de abrir el pecho, sin ventilación mecánica. Privación de oxígeno ha sido asociado con la activación de la vía procoagulante y trombosis 40 y también puede mejorar la adhesión de RBC. Otra publicación reciente ha demostrado que el tratamiento de la arteria carótida con una muy alta concentración de FeCl 3 (20%) durante 5 o 10 min conduce a una concentración en estado estacionario de FeCl 3 a ~ 50 mM en el lumen del vaso lesionado 29 . De este modo, infundidas directamente 50 mM FeCl3 en varios componentes de la sangre y examinaron el efecto de FeCl3 sobre la agregación ex vivo, lo que les llevó a proponer un nuevo mecanismo, de 2 fases para la acción de FeCl3 en la formación de trombos 29. Aunque es bastante interesante, los resultados de este estudio deben interpretarse con precaución, ya que no representa el modelo de FeCl3 de uso común. En contraste con la alta concentración de FeCl 3 (20%, 1 M como se indica en el documento) y el tratamiento de largo (5 o 10 min), nuestros estudios anteriores, así como Barr et al. han demostrado que 10% FeCl 3 tratamiento para 1 min es suficiente para inducir la formación de un trombo oclusivo rápida en la arteria carótida dentro de 7 min 6,30. Además, en la mayoría de los experimentos utilizando el modelo de FeCl 3, una baja concentración adicional de FeCl 3 (5-7,5%) se utiliza.

Otra limitación de este modelo es que debido a la lesión oxidativa grave al endotelio, así como denudación endotelial post-FeCl 3 tratamiento, este modelo puede no ser una herramienta adecuada para estudiar la trombosis asociada inflamación endotelial. Sin embargo, mediante el uso de estas técnicas para preparar la arteria carótida en combinación con la perfusión de los leucocitos marcados con fluorescencia, podemos probar la adhesión y rodamiento de los leucocitos en el endotelio inflamatoria 41.

en Summary, hemos refinado y estandarizado el modelo de lesión vascular inducida por FeCl 3 para producir una lesión altamente reproducible en la arteria carótida y cuantificar vez cese el flujo de sangre con precisión mediante microscopía intravital. Este modelo es suficiente y sensible para probar la anticoagulantes y antiagregantes plaquetarios, y también es adecuado para los estudios de la nanomedicina trombos-dirigida. En combinación con el trasplante de médula ósea, la infusión de plaquetas en los ratones con trombocitopenia o inyección intravascular directa de fármacos candidatos, hemos demostrado que esta es una herramienta conveniente, simple y sensible para estudiar la trombosis in vivo 7-10,16,19,42,43 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro
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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).More

Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

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