Summary
유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.
Abstract
유전자 결실은 유전자 기능 분석에 중요한 역할을한다. 타겟 방식으로 유전자를 방해하는 가장 효율적인 방법 중 하나는 상동 재조합을 통해 선택 마커 전체 유전자의 교체이다. 상동 재조합 동안 DNA의 교환은 유사도가 높은 순서 사이에 발생한다. 따라서, 표적 유전자를 플 랭킹 선형 게놈 서열은 특히 원하는 통합 사이트에 선별 마커를 지시하는데 사용될 수있다. 삭제 구조의 무딘 끝은 세포의 DNA 복구 시스템을 활성화하여 상동 재조합을 통해 또는 비 - 상동 - 최종 가입하여 어느 구조의 통합을 촉진한다. 효율적인 상동 재조합 유기체에서, 성공적인 유전자 결실의 비율은 50 % 이상이 전략에 유용한 유전자 파쇄 시스템하게 도달 할 수있다. Ustilago가 maydis 검댕 곰팡이는 효율적인 상동 recombinat을 나타내는 진핵 모델 미생물이다이온. 그 약 6,900 유전자 가운데 많은 기능 삭제 돌연변이의 도움으로 특징되었고, 유전자의 필수 기능에 유전자 교체 시도 포인트의 실패를 반복했다. 형광 마커 또는 예측 도메인의 돌연변이 태그에 의해 유전자 기능의 후속 특성은 상동 재조합을 통해 DNA 교환에 의존합니다. 여기, 우리는 미국이 제시 가장 간단한 예를 들어, 유전자 결실을 이용하여 상세히 maydis 변형 생성 전략.
Introduction
Ustilago maydis는 수십 년 1, 2에 대해 광범위하게 연구 된 식물 병원성 모델 균류이다. 그것은 두 모폴로지, 효모와 같은 비 병원성 단계와 사상, 전염성 형태 3에 존재합니다. 이러한 상동 재조합 DNA 복구 메커니즘으로서 보편적 인 획기적인 발견이 균 4 효모 유사 성장 단계에서 이루어졌다. 또한, 감염에 대한 중요한 감염 필라멘트 및 독성 요인에 대한 형태 학적 스위치 5,6를 잘 특징이다. 이 검댕 곰팡이의 생물학 및 독성에 대한 증가하는 분자 지식은 훌륭한 게놈 주석 (10)와 사용 역 유전학의 용이성, 예를 들면, 우리 연구소에서 잘 조직 된 플라스미드 컬렉션 (HTTP가 지원하는 간단한 유전자 교체 전략 7-9에 의존 : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). 옥수수의 표준화, 신속한 감염 분석eedlings는 병원성의 상세한 연구 (11) 요인을 감안.
미국의 게놈 maydis는 약 6,900 유전자 (10)를 포함한다. 그 기능을 연구하기 위해, 그들은 인해 효율적인 상동 재조합 시스템에 개별적으로 또는 조합으로 삭제 될 수있다. 완벽 상동 끝을 포함 약 1킬로바이트의 측면 영역은 50 % 이상 상동 재조합의 속도에 적합하지만, 비 동종 끝 이미 250 bp의이 구조물 (9)의 올바른 통합을 어느 정도 할 수 있습니다. 현재, 다섯 가지 저항 카세트, 하이 그로 마이신, carboxin, nourseothricin, G418 및 phleomycin에 대한 저항을 매개 hygR, cbxR, natR, G418R, 및 phleoR는 형질 전환 7,9에 대한 선택 사용된다. 또한, 하이 그로 마이신 내성 이종 FLP 재조합 효소 (12)의 일시적인 발현에 의해 제거 될 수있는 재활용 카세트 (FRT-hygR)로 개발되어왔다. 이 저항 카세트하여 이론 무제한 유전자 변형에 제거 할 수 있습니다. Phleomycin 새로운 카세트와 재활용 hygR 카세트 특히 phleoR의 사용이 감소되도록 13 돌연변이이다. 콰 드러 돌연변이 따라서 다른 네 카세트를 사용하여 생성 될 수 있으나, 배의 변이체를 들어, FRT-hygR 시스템 (14)을 추천한다.
이 일반적인 유전자 결실 전략은 성공적 Sporisorium의 reilianum 15, 미국 등의 다른 검댕 곰팡이로 전송 된 hordei (16), 또는 U. 라 esculenta 17 때문에 효율적인 상동 재조합 시스템 아직 유전자 어려운 유기체에서 상기 애플리케이션에 대한 가능성을 제공한다. 관련된 유전자의 결실에 의해 예시 된 바와 같이 또한, 상동 재조합이 결여 생물 유전 공학을 개선하기 위해 수정 될 수 비 동성 엉D-가입 뉴로 crassa의 18, 19에.
여기에서 우리는 미국에 대한 게시 된 유전자 삭제 전략을 설명 후보자의 신속하고 정확한 검증에 초점을 맞춘 실험 자세히 7,9를 maydis. 예를 들어, 우리는 진균 chitinases를 사용하여 단일 돌연변이의 발생뿐 아니라 다수의 삭제 20,21 종자 도시한다. 그들은 강성 세포벽 키틴에 작용하기 때문에 Chitinases은 흥미로운 예이다. 세포벽 리모델링이 세포 분열시 형태 변화 필요, 사상 성장과 포자 형성에 전환합니다. 따라서, 결실 돌연변이 체의 수명주기 동안 표현형을 기대할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
삭제를 구축 1. 생성
- 각각 1킬로바이트 상류 측면 (UF)과 하류 측면 (DF) 각각 평활 절삭 제한 부위에 의해 측면 적절한 저항성 카세트를 포함하는 결실 구조체 (도 1)를 포함하는 플라스미드를 생성한다.
참고 : 모든 복제 전략을 우리는 플라스미드 9 골든 게이트 복제를 권장합니다 (복제에 대한 참조 22 참조)를 사용할 수 있습니다. - 삭제 (9)를 구성하여 삭제 1 μg의 DNA를 얻었다 무딘 커터를 이용하여 플라스미드 구축 절제. 효소를 제거하고 상용 시약을 사용하여 22 예를 들어, 버퍼 및 제조업체의 지침을 따르지 삭제 구조를 정화.
주 : 벡터 백본 변환 혼합물에 남아있을 수 있습니다.
원형질체 2. 준비
참고 : 전자의 모든 시간 동안 멸균 상태 유지xperiment. 세포벽은 세포막에 분자의 접근을 제한하는 강한 보호 층이다. 삭제 구조체를 포함하는 DNA의 흡수를 허용하기 위해, 상기 칸막이 벽은 protoplasting 반응에서 효소 분해 셀 벽에 의해 제거 될 필요가있다. 원형질체 제조에서 중요한 단계는 매질 1) 삼투압 안정화하고 2) 원형질체에 기계적 응력을 회피.
- 마크 2 원형질체를 동결하고 -20 ° C에서 그들을 냉각하는 둥근 바닥 ml의 튜브. 원하는 유전 적 배경을 가진 균주의 신선한 판에서 3 ㎖ YEPS 빛의 사전 문화를 시작합니다. 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어.
참고 : 변형은 solopathogenic 변형 SG200 (10), 야생형 균주 등 AB33 (23), 또는 이중 돌연변이의 생성에 대한 돌연변이 배경으로 테스터 균주가 될 수 있습니다. 변형 원하는 저항의 무료 있는지 확인합니다. - 당황 FLA는 50 ml의 YEPS 빛의 문화를 희석K와 200 rpm으로하여 28 ° C에서 궤도 통에 품어.
참고 : 배가 시간은 야생형 균주 약 2 시간이다. 세 개의 중복 최소 허용합니다. - 지수 상까지 성장한다. (1.0 허용 0.6) 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정 된 광학 밀도가 약 0.8 있는지 확인하십시오. OD 1.0 (600)는 약 1 U. 7 10 × 2에 해당 ml의 당 세포를 maydis.
- 현미경으로 오염 세포를 확인합니다. 40 배 배율을 사용합니다. 5 분 1,500 XG의 전체 50 ㎖ 문화의 세포 펠렛과 상층 액을 버린다. 25 ml의 구연산 나트륨, 소르비톨 용액 (SCS), 원심 분리기 5 분, 1,500 XG에 펠렛을 재현 탁하고, 상층 액을 버린다.
주 : 세균 오염이 작고 종종 이동하는 세포로서 식별 될 수있다. 진균 오염물은 U.의 시가 형 세포에 비하여 다른 셀의 형상이나 크기에 기초하여 식별 될 수있다 maydis. - CEN 중trifugation가 protoplasting 용액을 제조 (12.5 ㎎ / ㎖ 트리코더마는 SCS에서 효소를, 용균, 세포 펠렛 당 3 ㎖를 제조, 필터는 22 μm의 필터를 통해 살균, 솔루션은 최적의 효소 활동에 대한 신선한이어야한다). SCS는 칸막이 벽의 제거시 원형질체의 파열을 방지하기 위해 삼투 성 정제이다.
- 용액 protoplasting 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. RT에서 5 분 20 품어과 세포의 30 ~ 40 %가 원형 또는 pinheads처럼 (그림 2)가 될 때까지 현미경으로 확인합니다.
주 : 지금부터 얼음의 모든 단계를 수행하고주의 원형질체를 처리! - 10 ml의 감기 (4 ° C) SCS에서 워시 3 배, 5 분 1,000 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 버리고, 5 분 동안 1,000 XG에서 차가운 소르비톨, TrisHCl, 염화칼슘 2 용액 (STC), 스핀 (10) 용액에 펠렛을 재현 탁. 1 ml의 차가운 STC의 펠렛을 재현 탁 냉각 튜브에 100 ㎕의 분취 량을 확인합니다. 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 분취 량을 동결.
미국의 3 변환 maydis
참고 : 미국의 변환 maydis 원형질체는 기술적으로 간단하고 특수 장비를 필요로하지 않는 일렉트로과 유전자 변형 또는 대향 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 전환 방법에 의존한다.
- 2 층 선정 플레이트 (전환 반응 당 2 판)을 준비한다. 바닥 층은 배 농도의 항생제가 포함되어 있습니다. 400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 포함 RegLight 정확하게 취하여 12 ㎖ (300 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 4 μg의 / ㎖ carboxin 또는 1 ㎎ / ㎖의 G418) 페트리 접시에. 거품을 피하십시오.
참고 : 아래 층 플레이트 (아래 참조) 4 ° C에서 며칠을 저장하지만, 변환 동안 갓 최상층을 준비 할 수있다. - 얼음 해동 원형질체 (1 관 / 변환). 1 μL 헤파린 (15 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 1 μg의 DNA (선형화 구조) 또는 10 μL의 H 2 추가
- 이 시간 동안, 상위 계층에 대한 RegLight 바닥 판에 (60 ° C에 종기 멋진) RegLight를 액화 12 ml의 확산.
참고 :이 계층은 항생제가 포함되어 있지 않습니다. - 변환 튜브 (3 2)에 500 μL STC / PEG (폴리에틸렌 글리콜)를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 신중 섞는다. 얼음에 15 분을 품어.
- 2 층 RegLight 판의 두 각 변환 반응을 배포한다. . 유리 피펫으로 조심스럽게 천천히 확산 형질 전환 식민지로 성장할 때까지 5 ~ 7 일 동안 28 ° C에서 수직으로 번호판을 품어. 접시 당 약 100 ~ 200 식민지를 얻습니다.
참고 : 낮은 번호가 하나가 너무 많은 세포벽을 포함하기 때문에 DNA를 취할 수 없거나 다시 생성 할 수 없습니다 "나쁜"원형질체에 의해 발생 될 수 있습니다. 전자는 자기 복제 플라스미드, 항생제없이 플레이트상에서 재생을 테스트하여 후자 변환에 의해 시험 될 수있다. <리> / ㎖ 하이 그로 마이신 200 μg의에서 적절한 항생제를 포함 YEPS 빛 접시를 준비한다 (150 μg의 / ㎖ nourseothricin 또는 2 μg의 / ㎖ carboxin 또는 500 μg의 / ㎖ G418, 이러한 농도 바닥 판에 사용되는 하나의 동일한 반). 이 판에 최소 24 추정 형질 전환 식민지를 다시 정화. 단일 콜로니를 얻을 수 있습니다. 비 선택적 미디어의 원래 긴장 밖으로 동시에 행진에서.
참고 : 후판 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
수정 삭제 이벤트 4. 확인
참고 : 돌연변이는 3 단계 절차에서 확인된다 (그림 1). 먼저, 유전자의 야생형 카피를 포함하는 후보 PCR에 의해 제외된다. 둘째, 상기 궤적에 저항성 카세트의 통합은 PCR에 의해 확인된다. 셋째, 오직 원하는 궤적에 저항성 카세트의 통합을 서던 블롯 분석에 의해 확인된다. 주의 변형 검증 야망이다ntial는 돌연변이 표현형 정말 삭제와 상관 관계가 있도록.
- 먼저 진단 PCR (20)
- 유전자의 디자인 프라이머 쌍은 250-600 BP (그림 1)의 제품에서 그 결과를 삭제합니다. 이러한 작은 제품은 식민지 PCR로 증폭하기 쉬운 표준 겔 전기 영동의 검출을위한 충분한 시간이다.
- 각 후보 및 양성 대조군으로 원래의 균주를 들어, 20 ㎕의 0.02 M 수산화 나트륨에 이쑤시개로 하나의 식민지의 전지 재료의 약간의 (a 핀 머리의 양)을 재현 탁. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
참고 : 신선한 식민지를 사용합니다. 판 1 주 재 행진보다 오래된 경우 새로운 식민지를 얻을 수있다. - 바로 PCR에 대한 세포 현탁액 1 μl를 사용한다. 표준 PCR 반응을 실행하고 결과 조각을 분석 할 수 있습니다.
주의 : 이러한 샘플이 저장 될 수 없다.
참고 : 따라서이 PCR은 야생형 유전자의 존재에 대한 테스트 및 부정적인 CAND를 신속하게 식별 할 수 있습니다관심있는 유전자를 대체되어 있지 않은 idates. 이 PCR 반응에 밴드를 산출 클론이 삭제됩니다. 그러한 부정적인 클론은 어쨌든 추가 음성 대조군으로 함께 수행되어야한다. PCR 산물없이 후보 더 분석한다. 나머지 절반은 밴드가 발생하지 않아야하는 동안 해로운 영향없이 유전자에 대한 후보자의 약 절반은 야생형 유전자를 포함해야합니다. 이것은 50 %의 상 동성 재조합 속도에 대응한다.
- 둘째 진단 PCR
- 게놈 DNA의 준비.
주 : 게놈 DNA (gDNA를)는 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조 할 수있다. 첫 번째는 페놀과 클로로포름 따라서 만 두 번째도 4.2 4.2.1.6에 설명 된 경험이 적은 학생들 (처리 할 수있는 반면 (4.2.1.5에 4.2.1.1에서 설명) 경험이 풍부한 연구자들에 의해 처리되어야 같은 독성 시약을 포함한다. 1.11). 두 프로토콜은 안정적으로 노력하고 있습니다. 단계 4.2.1.1은 모두 protoc 동일합니다OLS.- 각 후보와 5 ml의 YEPS 빛을 접종하고 28 ℃에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어. 형상 관리 접시에 배양 2 μl를 삭제합니다. 멸균 문화를 유지합니다.
참고 : 다음 표준 프로토콜 (: 독성 단계주의)이다. - 2 ml의 튜브에 1 국자 염산 세척 유리 구슬 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 maydis 문화. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. (펠릿이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다. (24 : 1 ~ 25) 펠릿에 500 ㎕의 페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올을 추가합니다. 주의! 페놀 독성!
- 1,000 rpm에서 vibrax에 500 ㎕를 모보 우스 - 용해 버퍼 6 분 10 1. 동요를 추가합니다. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인하지만, gDNA를의 전단을 방지하기 위해 진동 확장하지 마십시오. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 새로운 반응 관에 수성 단계의 400 μl를 전송 (상간을 만지지 마십시오).
- 1 ml의 100 % (v / v)의 에탄올을 추가합니다. ㄴ 관찰, 혼합 튜브 배를 반전곧 나타납니다 DNA의 소리. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 200 μL 70 % EtOH로 씻는다. 이 단계에서 펠렛을 재현 탁하지 마십시오.
- (펠릿이 완전히 건조시키지 않음) 완전히 뜨는을 제거합니다. 50 ㎕의 TE /의 RNase를 추가합니다. 10 분 동안 50 ℃에서 400 rpm으로 진탕하여 gDNA를 녹인다. 0.8 % 아가로 오스 겔 (20)의 gDNA를 2 μL를 분석한다.
참고 : 아래의 단계는 다른 비 독성 프로토콜을 포함한다.
- 각 후보와 5 ml의 YEPS 빛을 접종하고 28 ℃에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 품어. 형상 관리 접시에 배양 2 μl를 삭제합니다. 멸균 문화를 유지합니다.
- 게놈 DNA의 다른 제조
- 염산 2 ㎖의 튜브에 유리 구슬을 세척의 1 국자 (~ 200 μl를) 넣습니다. 미국의 2 ML을 추가 5 분 동안 12,000 XG에 maydis 문화와 스핀. (펠렛이 단계에서 얼 수) 상층 액을 버린다.
- 펠릿에 500 ㎕를 모보 우스 용해 버퍼 (2)를 추가합니다. 1,000 rpm에서 vibrax에 5 ~ 15 분 동안 흔들어. 세포 펠렛을 완전히 재현 탁되어 있는지 확인합니다.
- 15 ~ 20 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 아프로 사용2 ml의 튜브를 호스팅하기 위해 설계 절한 인큐베이터 중요합니다. 그런 다음, 5 분 동안 얼음에 놓습니다.
- 100 ㎕를 8 M 칼륨 아세테이트, 소용돌이를 추가 또는 8 ~ 10 번 반전. 실온에서 15 분 동안 12,000 XG에 스핀.
- 전송 (500) 신선한 1.5 ML 튜브에 뜨는의 μL, 400 μL 이소프로판올을 추가합니다. 소용돌이 또는 반전 8 ~ 10 시간. 15 분 동안 12,000 XG에 스핀. 상층 액을 제거하고 500 μL 70 % EtOH로 씻는다. 5 분 동안 12,000 XG에 스핀.
- 완전히 뜨는을 만끽! 결국, 잔류 액체를 제거하기 위해 짧은 스핀 (10 초)를 추가합니다. 3 ~ 5 분 동안 DNA 펠릿 건조를 할 수 있습니다. 50 ㎕의 TE / RNAase을 추가하고 400 rpm에서 10 분 ~ 15 50 ° C에서 품어.
- PCR
- 설계 중 하나가 (UF-F, RC-R, RC-F, DF-R,도 1) 측면 외부에 결합되고 저항 카세트 내 결합 중 대응하는 두 쌍의 프라이머 9.
- 모든 C의 gDNA를의 1:10 희석의 1 μl를 사용하여andidate 2 PCR 반응에서 템플릿으로 업스트림 및 다운 스트림 9 올바른 삽입을 확인.
- 각 후보에 대한 표준 PCR 반응을 사용하여 조각 (22) 결과 분석한다.
주의 : 이러한 PCR들 정확한 게놈 로커스에서 저항 카세트의 삽입 테스트. 제품은 양쪽 모두 얻은 경우, 후보 가능성이 올바른 삽입합니다. 그러나, (다운 스트림 상류 나) 한쪽 만이 확인 될 수도 후보는 PCR 반응은 단순히 하나의 측면에 실패했습니다 경우 추가 분석을 위해 함께 수행되어야한다.
- 게놈 DNA의 준비.
- 남부 오 점 분석 (22)에 의해 수정 게놈 삽입의 검증
- 유전자 또는 명확하게 DIST에 선도적 인 저항 카세트에 하나 절단, 구성하고 추가 / 궤적 외부 인하 적절한 효소 (15) 돌연변이 후보의 gDNA를 ㎕의 (4.2.1)와 대응하는 야생형 / 전구 변형 다이제스트inguishable 패턴 (그림 1) 8.
참고 : 그들이 소화되지 않은 DNA에서 명확하게 구별되도록 예상 밴드 없음,보다 큰 10킬로바이트 없어야합니다. - 상류 및 프로브와 같은 다운 스트림 측면을 사용합니다. 예는 PCR DIG 라벨 키트 또는 유사한 표준 방법을 사용할 수 있도록 라벨을합니다. 1에 표시된 프로브를 혼합 : 1 분 비율과 남부 오점을 실시하고 있습니다. 적어도 두 개의 독립적 인 올바른 형질 전환 체를 유지합니다.
주 : 야생형 패턴 원래 균주 명확히 검출되어야하며, 올바른 클론 만 예상 밴드를 포함한다. 후보 만 존재하는 추가 밴드는 잘못된 현장에서 구조의 다른 삽입을 나타냅니다. 이러한 클론 폐기해야합니다. 첫 번째 진단 PCR에서 확인 된 부정적인 후보는 잘못 통합 삭제 구조의 야생형 밴드와 (크기 예측할 수없는)의 주파수 대역을 포함해야합니다.
- 유전자 또는 명확하게 DIST에 선도적 인 저항 카세트에 하나 절단, 구성하고 추가 / 궤적 외부 인하 적절한 효소 (15) 돌연변이 후보의 gDNA를 ㎕의 (4.2.1)와 대응하는 야생형 / 전구 변형 다이제스트inguishable 패턴 (그림 1) 8.
- 글리세롤 주식
참고 : 글리세롤 주식 변형 컬렉션 년 동안 클론을 유지하는 역할을한다. 적어도 두 개의 독립적 인 형질 전환 체는 각각의 돌연변이에 대한 보관해야합니다. 이 동일해야합니다 비교 표현형을 할 수 있습니다.- 500 ㎕를 NSY 글리세롤 매체와 각 문화의 28 ° C 믹스 500 μl를 24 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛에서 확인 된 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장. 문화와 매체가 잘 혼합 될 때까지 튜브를 반전. 매체 글리세롤 얼음 결정의 형성을 방지한다.
- -80 ° C에서 고정. 재고가 작동하면 다시 연속 동결 문화의 일부를 테스트합니다.
5. 현미경 표현형
- 28 ° C에서 12 시간 동안 회전 바퀴에 YEPS 빛의 야생형과 돌연변이 균주 5 ml의 문화를 성장.
- 다음 날, 약 0.1의 OD 600 문화를 희석 0.5과 0.7 사이의 OD 600까지를 성장. 1.0 corresp의 OD (600)onds 약 1 7 10 × 2의 미국에 ml의 당 세포를 maydis.
- 현미경으로 세포 형태를 검사합니다.
참고 : 건강한 세포는 시가 모양 (그림 4, WT)에 나타납니다. 발음 액포 또는 필라멘트의 형성은 세포가 스트레스를 나타냅니다.
주 : 리포터 균주 적절한 분석은이 단계에서 수행 될 수 사용할 경우 예상되는 돌연변이 표현형에 따라 분석은, 예를 들면, 적용 할 수있다. 세포 형태가 변경 통계적 분석이 수행되어야하는 경우 예를 들어, 평균 셀 길이를 결정한다.
6. 감염 분석
참고 : 종묘 감염 분석이 저널 11에 이미 가시화되고있다. 이 중 수 등 SG200 10 또는 모두 돌연변이를 수행 호환 결합 파트너를 혼합하여 반수체, solopathogenic 변형 배경을 이용하여 수행 될 수있다.
- 당 최소 40 옥수수 모종을 성장16 시간, 200 μE / 22 ° C (주 / 야간) 28 ° C의 빛을주기에 7 일간 변형. 그들은 3 잎 단계 및 10~15cm 감염의 날에 높이에 있어야합니다.
- 이틀 감염 전에, 28 ° C에서 24 시간 동안 회전 바퀴에 5 ml의 YEPS 빛의 균주의 사전 문화를 시작합니다. YEPS 빛이 600 = 1.0 OD 50 ml의 주 문화를 성장 (세포 분열 속도 = 2 시간을 3 분할의 최소 허용, O / N을 수행 할 수 있습니다).
- 5 분 1,500 XG에 50 ㎖ 문화의 세포를 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. 멸균 H 2 O 씻을 배 OD 3.0 600 무균 H 2 O의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 결합 파트너를 섞는다.
- 작은 주사기를 사용 칠일 된 옥수수 모종의 줄기에 세포 현탁액 500 μL - 250을 주입. 대조군으로 멸균 H 2 O를 사용합니다. 같은 빛과 온도 조건에 추가 7-14일에 대한 감염된 모종을 유지합니다. 각 공장 (a)의 표현형 점수건강, 백화, 안토시아닌 형성, 작은 종양, 큰 종양, 죽은 식물 10 ccording.
참고 : 점수가 이르면 칠일 등의 수행 시간이 지남에 감염 따라 14 일에서 반복 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
미국으로 인코딩 네 chitinolytic 유전자의 삭제 구조 maydis 게놈 cts1의 삭제에 대한 hygR 카세트를 사용하여 골든 게이트 복제에 의해 생성 된의 natR cts2의 삭제, cts3의 삭제 및 cts4 (20)의 삭제를위한 cbxR에 대한 G418R 카세트. 유전자 치환 전략의 일반적인 개요는 cts3의 삭제 (도 1)에 의해 예시된다. 두 번째 chitinolytic 유전자 cts1의 단일 및 이중 돌연변이 독성에 chitinases의 역할 분석을위한 두 개의 서로 다른 유전 적 배경에서 동일한 구조와 순차적으로 생성되었다. 두 개의 서로 다른 변형 배경이 사용되었다 : AB33은 사상 성장을 유도 할 수 있습니다, 병원성 (23)을 향한 첫 번째 단계는, SG200는 10 득점 신속하게 질병을 할 수있는 솔로 병원성 균주 cts3의 변환이 적절한 변형 배경으로 구성 -deletion 후, 제 2 선택 판의 단일 콜로니 진단의 PCR (표 1)와 남부 오 (그림 3)에 의해 올바른 삭제를 위해 시험 하였다. 흥미롭게도, 상동 재조합 속도 cts3위한 AB33 SG200보다 훨씬 높았으나,이 차이는 지속적으로 다른 chitinases 결실 관찰되지 않았다.
엄격한 변형 검증 삭제 단일 삽입이 원하는 위치에 있도록 구성. 그러나, 이러한 점 돌연변이 등의 추가 수정 표현형의 해석을 오해 할 수있는, 발견되지 않은 남아있을 수 있습니다. 따라서, 적어도 두 개의 독립적 인 형질 전환 phenotyped 있습니다.
무화과 cts3 예시 삭제 전략의 URE 1. 개요.이 개략적 개요 (삭제 상류 측면 (UF), 하류 측면 (DF), 그리고 네티 저항 카세트 (G418R), 야생형의 게놈 궤적으로 구성 WT를 포함 ) cts3 결실 돌연변이 모든 프라이머뿐 아니라 변형 인증에 사용 된 제한 부위와. 야생형 유전자 카피가 존재하는 경우, 저항 카세트가 제대로 통합 된 경우 제품의 최초 진단 PCR 결과는, 2 개의 제 2의 PCR 진단 제품 초래한다. 게놈 DNA는 PstI로 분해되는 남부 오점를 들어, 프로브는 UF 및 DF (빨간색 막대)이 야생형에서 6.7 킬로바이트 밴드의 검출에 이르는 5.6 킬로바이트의 두 밴드와 돌연변이 2.0 킬로바이트에 걸쳐. 또한, DF 프로브는 약 2.6 kb의 제품을 인식한다. 주세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 반응을 protoplasting의 현미경 검증. (A) 처리되지 않은 야생형 세포 (FB2)는 시가 모양이 나타납니다. 셀 벽 (30 분 동안 여기에 대한) 분해 효소로 처리하면 (B)는 유사한 구조 일 단부 (들) 및 바 종의 원형 분야의 모양의 (b)는 세포벽 분해가 시작되었음을 나타낸다. 마지막으로, 원형질체는 세포벽의 부족에 기인 한 완전히 라운드 (R)이다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무화과 URE 3. cts3 삭제. 게놈 DNA에 대한 서던 블랏은 PstI로 분해되었다. 두 측면은 동일한 몰 비율로 혼합하고, 하나의 프로브로 사용되는 라벨되었다. 야생형의 SG200과 chitinases의 cts1 및 cts2의 삭제에 6.7 킬로바이트의 단일 밴드가 검출된다. cts3의 삭제 (g와 k)를, 5.6 킬로바이트의 두 밴드와 2.0 킬로바이트에서 cts3의 올바른 삭제를 나타내는 볼 수 있습니다. 2.6 KB의 추가적인 대역 대규모 과다에 의해 시각화 될 수있다. 이 하류 측면 프로브의 100 염기쌍의 중첩에 의해 인식되는 단편에 해당한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
일부 돌연변이는 현미경으로 검출 할 수있다 명백 성장 결함을 초래할. 키틴 삭제에서, 하나의 돌연변이가 표시되지 않았습니다명백한 결함, cts1 동안 / 2 이중 돌연변이 결함 (20) 뚜렷한 세포 분리를 보였다. 격막의 염색은 세포질 분열이 완료되었음을 보여 주었다 그러나 세포 (LANGNER 외. 2015에서 그림 4) 잔류 키틴을 통해 가능성이 연결된 남아 있었다. 유사한 미세 성장 표현형이 khd4 (24)의 삭제 알려져, 형태 및 병원성 (25)에 관여하는 유전자의 전사 후 RNA 회전율을 매개 RNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자.
결실 돌연변이의도 4 현미경 분석. 키틴 결실 균주의 세포 형태와 격벽 형성. cts1 / 2 Δ 균주는 세포 분리 결함을 나타내고 격막 형성의 부족으로 인해없는 큰 응집체를 형성한다. 기본 및 보조격막은 (세트의 5 배 확대 참조) CALCOFLUOR 화이트 (CW) 현미경의 세계 이전으로 염색 하였다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림은 LANGNER 등. 2015 진핵 세포 (20)로부터 허가 재판된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
병원성하는 chitinases의 기여를 테스트하기 위해, 모 감염 검정법은 SG200 균주 배경 돌연변이 체를 사용하여 수행 하였다. khd4에 돌연변이가 독성이 감소 된 반면, chitinases의 삭제 (그림 5) 20,25 옥수수 모종의 감염에 영향을 미치지 않았다.
삭제 돌연변이의 그림 5. 감염 분석.의 질병 평가옥수수 모종 구일 각각 미국과 감염 후 균주를 maydis. (A) 질병 점수에 사용되는 육안 증상. (B)는 두 개의 독립적 인 형질 전환 체 각각의 균주 (N> 100)에 대해 시험 하였다. 모든 키티 나제 결핍 된 돌연변이 체 (1 / 2 / 3Δ : 트리플 돌연변이 endochitinases, 4Δ : 단일 돌연변이 N 아세틸 글루코사민, 1 / 2 / 3 / 4Δ : 배 돌연변이)와 야생형 감염에서 관찰 무거운 종양 형성을 유도하는 기주 식물을 감염 solopathogenic 변형 SG200. 이전에보고 된 24 대조적으로, RNA 결합 단백질 Khd4를 코딩하는 유전자의 결실을 담지 한 균주 병독성이 감소 하였다. 오차 막대는 3 개의 독립적 인 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는 LANGNER 등의 허가를 수정됩니다. 2015 진핵 세포 (20). 대형을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 R 버전입니다.
| 유전 적 배경 | 1 차 diagn. PCR (제외 / 테스트) | 2 차의 diagn. PCR (확인 / 테스트) | 남부 지방 사투리 (확인 / 테스트) | %의 recomb. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | (32) |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | (21) |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | (70) |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | (7)0 |
표 1 :. cts3의 삭제에 대한 스트레인 검증은 키티 나제 유전자 cts3는 단일 및 다중 삭제에 사상 성장 (AB33) 감염 (SG200)의 연구를 할 수 있도록 네 개의 다른 유전 적 배경에서 삭제되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 미국에서 역 유전 연구에 대한 결실 돌연변이 체를 생성하는 방법에 대해 설명 maydis. 시작점은 나란히 7,9 최적화되었을 유전자의 관심에 대한 1 시작 상류 및 정지 코돈의 하류 KB뿐만 아니라 적절한 저항성 카세트의 서열을 함유 플 랭킹 서열을 포함하는 결실 구조체이며 . 구조는 개별적으로 각각의 유전자에 대해 생성 조심스럽게 유전자를 삭제하기 전에 시퀀스 오류를 확인해야합니다. 측면은 이웃 유전자에 도달하거나 돌연변이 규제 요소를 수정하는 경우 측면에 점 돌연변이는 특히 게놈 시퀀스에서 원치 않는 변화를 일으킬 수 있습니다. 이것은 모든 형질 전환에 영향을 미칠 것이며, 목적 유전자 결실 무관 표현형 및 부작용을 일으킬 수있다.
삭제 전략을 계획 할 때, 예상되는 표현형은 유전 적 배경을 선택하기 위해 고려되어야. 본 경우 AB33 23 SG200 (10)은 형태 학적 전환 식물 감염 표현형을 테스트 할 수 있도록하기 위해 선택되었다. 마찬가지로, 다른 많은 읽기 아웃이 관심을 가질만한, cts1와 예 융합은 이종 단백질 14,26의 수출에 사용되며, 형광과 변형 배경 rrm4 태그 엔도 좀 27,28에 RNA 수송의 분석을 할 수 있습니다.
균주의 확인 중에 높은 처리량의 PCR 진단 후보 수의 급격한 감소는 다소 힘드는 서던 블랏에서 테스트 할 수있다. 특히, 제 진단 PCR 여전히 유전자의 야생형 카피를 포함하는 후보들의 배제를 허용하여 gDNA를 준비 독성 페놀의 대량 사용을 방지한다. 비 - 필수 유전자가있는 표준 경우에, 콜로니의 약 절반은 야생형 유전자를 함유 할 수있다. 이 전 검사는 유전자에 대한 큰 관심이 될 수 있습니다 잠재적으로 해로운 성장 표현형과. 후보자의 수백 신속하게 선별 할 수있다.
모든 후보가 야생형 사본이 포함 된 경우, 유전자 삭제는 대부분 치명적이다. 이것은 teliospore 발아 29 일 후 분리의 이배체 변형 배경 (예 : D132) 및 분석에 복사본을 삭제하여 확인할 수있다. 대안 적으로, 유도 성 프로모터를 사용하여 조건부 삭제 전략 돌연변이 표현형을 따르도록 선택 될 수있다. 그러나 gDNA를 준비를위한 조 NaOH를 기반 방법의 결과 또한 오염은 PCR을 방해하고 거짓 네거티브는 후보자들이 유전자를 포함하는 경우에도 유지됩니다 따라서 밴드를 표시하지 않는, 즉에 발생할 수 있습니다. 이것은 더 큰 단편을 발생하는 제어 유전자 두 개의 유전자 특이 적 프라이머 및 프라이머 독립적 인 PCR 반응 또는 다중-PCR에 의해 유사한 크기의 제품 제어 유전자 검사에 의해 제외 될 수있다.
내용은 "> 이미, 예를 들면, cts1의 Δ 30 rrm4의 Δ, 태그 버전의 변형 생성은, 예를 들어, 포함하는 새로운 구조와 게놈에서 유전자 삭제 저항 카세트 (예 : hygR)을 대체하여 사용할 수 가속화 될 수있는 돌연변이가되어있는 경우 형광 표지 rrm4과 다른 저항 마커 (예 natR는).이 경우에, 형질 전환 체는 해당 후보 만 새로운 항생제 (nourseothricin)에 대한 내성이다. 초기 저항 마커 (9)의 손실에 의해 스크리닝 할 수 있고, 초기 저항 (하이 그로 마이신을 잃은 ). 또한, 트랜스의 돌연변이 표현형의 보완은 태그 구조 (30, 31)의 기능을 확인하기 위해 수행 될 수있다.여기에 설명 된 유전자 삭제 및 수정 전략은 미국의 유전 적 분석에서 안정적이고 정확한 도구를 제공합니다 maydis. 그러나 다수의 삭제를 들어, 변형 GE변경이 순차적으로 수행 될 필요가 보낸 neration은 시간 소모적 얻을 수있다. 따라서, 보완 도구로, 지난해는 CRISPR-카스 시스템은 미국을 위해 설립되었습니다 32 maydis. 그것은 동시에 여러 유전자를 방해 할 수있는 가능성을 제공하며, 미국의 유전 도구 상자에 우수한 추가이다 maydis.
유전자 조작 및 U. 대한 요약하면, 프로토콜 여기에 설명 maydis 변형 생성 널리 년 동안 지역 사회에서 사용 된 강력한 방법이다. 함께 각각의 저항 카세트 모듈의 포괄적 인 컬렉션은 기본에서 응용 연구에 이르기까지 다양한 문제를 해결,이 곰팡이에 유전 공학의 모든 종류의 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
원고의 중요한 읽기 박사 베네딕트 Steuten 특별 감사. chitinases의 원작이 박사 토르스텐 LANGNER에 의해 수행되었다. VG의 기관은 식물 과학 우수 (CEPLAS, DFG EXC 1028)과 BioSC의 클러스터에서 지원, KS의 기관은 BioSC에 의해 지원됩니다. KB는 BioSC에 의해 지원됩니다. 바이오 경제 과학 센터 (BioSC)의 과학 활동은 재정적으로 NRW Strategieprojekt BioSC (313 / 323-400-00213)의 틀 내에서 혁신, 과학 연구의 교육부에 의해 지원되었다. LF는 DFG 국제 연구 교육 그룹 1525 iGRADplant의 박사 친교에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
