Summary
Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.
Abstract
supresión de genes juega un papel importante en el análisis de la función génica. Uno de los métodos más eficaces para interrumpir genes de una manera dirigida es la sustitución de la totalidad del gen con un marcador seleccionable a través de recombinación homóloga. Durante la recombinación homóloga, el intercambio de ADN se lleva a cabo entre las secuencias con alta similitud. Por lo tanto, las secuencias genómicas lineales que flanquean un gen diana se pueden utilizar para dirigir específicamente un marcador seleccionable para el sitio de integración deseado. Los extremos romos de la construcción de deleción activan sistemas de reparación del ADN de la célula y de ese modo promover la integración de la construcción, ya sea a través de recombinación homóloga o por no homóloga de extremo de unión. En los organismos con recombinación homóloga eficiente, la tasa de éxito de la deleción del gen puede alcanzar más de 50% haciendo de esta estrategia de un sistema de interrupción de genes valiosos. El hongo Ustilago maydis es carbón de un microorganismo eucariota modelo que muestra tales recombinantes, homóloga eficienteion. Fuera de sus cerca de 6.900 genes, muchos se han caracterizado funcionalmente con la ayuda de mutantes de deleción, y el fracaso de sustitución de genes puntos repetidos intentos en función esencial del gen. caracterización posterior de la función del gen mediante el etiquetado con marcadores fluorescentes o mutaciones de dominios predichos también se basa en el intercambio de ADN a través de recombinación homóloga. A continuación, presentamos la U. maydis estrategia de generación de la tensión en detalle utilizando el ejemplo más simple, la deleción del gen.
Introduction
Ustilago maydis es un modelo de hongo fitopatógeno que se ha estudiado ampliamente durante décadas 1,2. Existe en dos morfologías, una etapa similar a la levadura, no patógena y un filamentosos, forma infecciosa 3. Descubrimientos importantes universales, como los mecanismos de recombinación y reparación del ADN homólogas se hicieron en la etapa de crecimiento similar a la levadura de este hongo 4. Por otra parte, el interruptor morfológica de los filamentos y factores de virulencia infecciosas importantes para la infección son bien caracterizado 5,6. El conocimiento acerca de la biología molecular creciente y la virulencia de este hongo tizón se basa en una estrategia de sustitución de genes sencillo 7-9 apoyado por una excelente anotación del genoma 10 y la facilidad de uso de la genética inversa, por ejemplo, la colección de plásmido bien organizado en nuestro instituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). , ensayos de infección estandarizados rápidos en el maíz seedlings permiten estudios detallados de patogenicidad factores 11.
El genoma de U. maydis contiene alrededor de 6.900 genes 10. Para el estudio de su función, se pueden eliminar individualmente o en combinación debido a un sistema de recombinación homóloga eficiente. Regiones flanqueantes de alrededor de 1 kb que contienen extremos perfectamente homólogas son ideales para las tasas de recombinación homóloga mayor que 50%, pero ya 250 pb con extremos no homólogos permiten cierto grado de correcta integración de la construcción 9. En la actualidad, cinco casetes de resistencia diferentes, HygR, CBXR, Nat, G418r, y phleoR que media la resistencia contra la higromicina, carboxina, nourseothricin, G418 y fleomicina, se emplean para seleccionar los transformantes 7,9. Además, la resistencia a la higromicina se ha desarrollado en un casete reciclable (FRT-HygR) que se puede quitar por la expresión transitoria de una recombinasa FLP heterólogo 12. Esto permite la eliminación de la casete de resistencia y por lo tanto, en teoría, las modificaciones genéticas ilimitadas. Fleomicina es mutagénico 13, de modo que con los nuevos cassettes, en particular el casete reciclable HygR, el uso de phleoR está disminuyendo. Mutantes cuádruples por lo tanto se pueden generar utilizando los otros cuatro cassettes, pero para los mutantes quíntuples, se recomienda el sistema FRT-HygR 14.
Esta estrategia general de supresión de genes ha sido transferido con éxito a otros hongos tales como tizón Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 y por lo tanto ofrece la posibilidad de nuevas aplicaciones en organismos genéticamente aún intratables con un sistema de recombinación homóloga eficiente. Por otra parte, los organismos que carecen de recombinación homóloga pueden ser modificados para mejorar la ingeniería genética como se ejemplifica por la deleción de genes implicados en no homóloga-end-unirse en Neurospora crassa 18,19.
Aquí se describe la estrategia de supresión de genes publicado por U. maydis 7,9 en detalle experimental con un enfoque en la verificación rápida y precisa de los candidatos. A modo de ejemplo, podemos utilizar las quitinasas fúngicas y representan la generación de mutantes individuales, así como la supresión de múltiples cepas 20,21. Quitinasas son ejemplos interesantes, ya que actúan sobre la quitina en la pared celular rígida. Se requiere remodelación de la pared celular de los cambios morfológicos durante la división celular, cambiar a un crecimiento filamentoso, y la formación de esporas. Por lo tanto, en los mutantes de deleción se puede esperar que los fenotipos de todo el ciclo de vida.
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Protocol
1. Generación de constructos de deleción
- Generar un plásmido que contiene la construcción de deleción (Figura 1) que comprende un respectivo 1 kb aguas arriba del flanco (UF) y el flanco corriente abajo (DF) cada uno y el casete de resistencia apropiada, flanqueada por sitios de restricción de corte romos.
NOTA: Cualquier estrategia de clonación se puede utilizar (para la clonación véase la referencia 22) recomendamos Golden Gate clonación de tales plásmidos 9. - Extirpar la eliminación construcción del plásmido usando un cortador romo para obtener 1 g de ADN de la supresión construir 9. Se purifica el constructo de deleción para eliminar la enzima y tampón 22 por ejemplo mediante el uso de reactivos comerciales y seguir las instrucciones del fabricante.
NOTA: La cadena principal del vector puede permanecer en la mezcla de transformación.
2. Preparación de protoplastos
NOTA: Mantener condiciones estériles durante todas las épocas del correoXperiment. La pared celular es una fuerte barrera de protección que limita el acceso de las moléculas de la membrana plasmática. Para permitir la captación del ADN que contiene la construcción de deleción, la pared celular debe ser eliminado por la pared celular de las enzimas de degradación en una reacción de protoplastos. Los pasos críticos en la preparación de protoplastos son 1) la estabilización osmótica del medio y 2) evitar el estrés mecánico en los protoplastos.
- Marcar tubos de 2 ml con fondo redondo para congelar los protoplastos y enfriarlos a -20 ° C. Iniciar un pre-cultivo en 3 ml Yeps luz de un plato fresco de la cepa con el fondo genético deseado. Incubar en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C.
NOTA: La cepa puede ser la cepa SG200 solopathogenic 10, las cepas de tipo silvestre, cepas de ensayo, tales como AB33 23, o cualquier mutante de fondo para la generación de mutantes dobles. Asegúrese de que la cepa es libre de la resistencia deseada. - Se diluye la cultura en 50 ml Yeps-luz en un flas desconcertadok y se incuba en un agitador orbital a 28 ° C con 200 rpm.
NOTA: El tiempo de duplicación es de aproximadamente 2 horas para las cepas de tipo salvaje. Permitir tres duplicaciones mínimo. - Crecer hasta fase exponencial. Asegúrese de que la densidad óptica, medida a una longitud de onda de 600 nm (OD 600), es de alrededor de 0,8 (0,6 a 1,0 es aceptable). Un OD 600 de 1,0 corresponde a aproximadamente 1-2 x 10 7 U. maydis células por ml.
- Compruebe las células en busca de contaminación bajo el microscopio. Utilice un aumento de 40x. Sedimentar las células de la completa cultivo de 50 ml durante 5 min, 1500 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 25 ml de citrato de sodio, solución de sorbitol (SCS), se centrifuga 5 min, 1.500 xg, y desechar el sobrenadante.
NOTA: contaminaciones bacterianas pueden ser identificadas como células pequeñas y, a menudo móviles. Contaminaciones fúngicas pueden ser identificados en base a una forma de la célula diferente o tamaño en comparación con las células en forma de cigarro de U. maydis. - durante CENtrifugation preparar solución de protoplastos (12,5 mg / ml Trichoderma lisis de enzimas, en SCS, así como preparar 3 ml por sedimento celular; esterilizar por filtración a través de un filtro de 22 micras; solución tiene que ser fresco para la actividad enzimática óptima). SCS es un estabilizador osmótico para evitar la ruptura de protoplastos después de la retirada de la pared celular.
- Resuspender el sedimento en 2 ml de solución de protoplastos. Incubar durante 5 a 20 min a TA y comprobar bajo el microscopio hasta el 30 a 40% de las células son redondas o como cabezas de alfiler (Figura 2).
NOTA: Realizar todos los pasos en el hielo a partir de ahora y manejar protoplastos con cuidado! - Lavar 3x en 10 ml de frío (4 ° C) SCS, centrifugar a 1000 xg durante 5 min.
- Resuspender el precipitado en 10 ml de sorbitol frío, solución Tris-HCl, CaCl2 (STC), centrifugado a 1.000 xg durante 5 min, desechar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de STC fría, hacer 100 ml de alícuotas en los tubos enfriados. Congelar las alícuotas a -80 ° C hasta su uso posterior.
3. Transformación de U. maydis
NOTA: La transformación de la U. maydis protoplastos se basa en el polietilenglicol (PEG) método de transformación mediada por, que es técnicamente sencilla y opuesto a electroporación o transformación biolística no requiere equipo especializado.
- Preparar las placas de selección de dos capas (2 planchas por reacción de transformación). La capa inferior contiene el antibiótico en una concentración doble. Pipetear 12 ml de RegLight que contienen 400 mg / ml de higromicina (o 300 mg / ml nourseothricin o 4 mg / ml carboxin o 1 mg / ml de G418) en una placa de Petri. Evitar las burbujas.
NOTA: Las placas de capa inferior se puede almacenar un par de días a 4 ° C, pero preparar la capa superior recién durante la transformación (véase más adelante). - protoplastos descongelación en hielo (1 tubo / transformación). Añadir 1 heparina l (15 mg / ml). Añadir 1 g de ADN (constructo linealizado) o 10 l H 2
- Durante este tiempo, para la capa superior extendido 12 ml licuados RegLight (hervir y enfriar a 60 ° C) sobre la placa de fondo RegLight.
NOTA: Esta capa no contiene antibióticos. - Añadir 500 l STC / PEG (polietilenglicol) al tubo de transformación (3. 2) y mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo. Incubar 15 minutos en hielo.
- Distribuir cada reacción de transformación en dos de las placas RegLight de dos capas. Difundir lentamente y con cuidado con una pipeta de vidrio. Incubar las placas en posición vertical a 28 ° C durante 5 a 7 días hasta transformantes crecen como colonias. Obtener unos 100-200 colonias por placa.
NOTA: Los números más bajos podrían ser causados por protoplastos "malos" que, o bien contienen demasiada pared celular y por lo tanto no pueden captar ADN o no pueden regenerarse. El primero puede ser probado por transformación con un plásmido autorreplicante, este último mediante el ensayo de regeneración en las placas sin antibióticos. <li> Prepare placas Yeps-Light que contienen el antibiótico apropiado en 200 mg / ml de higromicina (o 150 mg / ml nourseothricin o 2 g / carboxin ml o 500 mg / ml de G418; estas concentraciones igual la mitad de la utilizada para placas de fondo). Re-purificar al menos 24 colonias transformantes putativos en estas placas. Las colonias individuales se deben obtener. Al mismo tiempo, la cepa original consecutivas en medios no selectivos.
NOTA: Las placas se pueden almacenar a 4 ° C durante 1-2 semanas.
4. Verificación de la deleción Eventos Corregir
NOTA: Las mutaciones se verifiquen en un procedimiento de tres pasos (Figura 1). En primer lugar, los candidatos que contienen la copia de tipo salvaje del gen están excluidos por PCR. En segundo lugar, la integración de la casete de resistencia en el locus se verifica por PCR. En tercer lugar, la integración de la casete de resistencia a solamente en el locus deseado se verificó por análisis de transferencia de Southern. la verificación cuidadosa cepa es essential, por lo que los fenotipos mutantes verdaderamente se correlaciona con la eliminación.
- En primer diagnóstico de PCR 20
- Diseño cebadores de emparejamiento en el gen que se desea borrar que resultan en un producto de 250 a 600 pb (Figura 1). Tales productos pequeños son fáciles de amplificar en una PCR de colonias, y el tiempo suficiente para la detección en la electroforesis en gel estándar.
- Para cada candidato y la cepa original como control positivo, resuspender un poco (cantidad de una cabeza de alfiler) de material celular de una sola colonia con un palillo de dientes en 20 l de NaOH 0,02 M. Incubar a TA durante 30 min.
NOTA: Utilice colonias frescas. Si las placas son mayores de 1 semana de re-consecutivas para obtener una colonia fresca. - Utilice 1 l de la suspensión celular para la PCR inmediatamente. Ejecutar una reacción de PCR estándar y analizar los fragmentos resultantes.
NOTA: Estas muestras no se pueden almacenar.
NOTA: Este pruebas de PCR para la presencia del gen de tipo salvaje y de este modo permite la rápida identificación de cand negativoidates en el que no se ha sustituido el gen de interés. se descartarán clones que producen bandas en esta reacción PCR. Uno de tales clones negativa de todos modos debe realizarse a lo largo de como un control negativo adicional. Los candidatos que tengan un producto de PCR tienen que analizarse más. Para los genes sin efectos perjudiciales aproximadamente la mitad de los candidatos debe contener el gen de tipo salvaje, mientras que el otro medio no debe dar lugar a una banda. Esto correspondería a una tasa de recombinación homóloga de 50%.
- Segunda PCR de diagnóstico
- Preparación de ADN genómico.
NOTA: El DNA genómico (gDNA) se puede preparar usando dos protocolos diferentes. La primera consiste en reactivos tóxicos como el fenol y cloroformo y, por tanto, deberán ser manejados solamente por los investigadores experimentados (que se describen en 4.2.1.1 a 4.2.1.5), mientras que el segundo también puede ser manejado por los estudiantes menos experimentados (que se describen en 4.2.1.6 a 4,2. 1,11). Ambos protocolos están trabajando de forma fiable. Paso 4.2.1.1 es idéntica para ambos protocoles.- Inocular 5 ml Yeps-Light con cada candidato y se incuba en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. Drop 2 l de la cultura en una placa CM. Mantener el cultivo estéril.
NOTA: A continuación se presenta un protocolo estándar (PRECAUCIÓN: pasos tóxicos). - Poner 1 cucharada (~ 200 l) de perlas de vidrio lavadas-HCl para tubos de 2 ml. Añadir 2 ml de la U. cultura maydis. Girar 12.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante (pellet puede congelarse en esta etapa). Añadir 500 l de fenol / cloroformo / Alcohol isoamílico (25: 24: 1) al sedimento. ¡PRECAUCIÓN! El fenol es TÓXICO!
- Añadir 500 l Usti-buffer de lisis 1. Agitar durante 6 a 10 minutos en un Vibrax a 1.000 rpm. Compruebe que el sedimento celular se resuspendió completamente, pero evite extendida agitación para evitar el cizallamiento del gDNA. Girar a 12.000 xg durante 15 min. Transferir 400 l de la fase acuosa en el nuevo tubo de reacción (no toque la interfase).
- Añadir 1 ml 100% (v / v) de etanol. 3x invertir los tubos para mezclar, observar la cen voz alta de ADN que aparece en breve. Girar a 12.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y lavar con 200 l 70% de EtOH. No resuspender el precipitado en esta etapa.
- Aspirar el sobrenadante por completo (no deje que el pellet se seque por completo). Añadir 50 l de TE / RNasa. Disolver gDNA por agitación a 400 rpm a 50 ° C durante 10 min. Analizar 2 l de la gDNA en un gel de agarosa al 0,8% 20.
NOTA: Los siguientes pasos comprenden un protocolo alternativo no tóxico.
- Inocular 5 ml Yeps-Light con cada candidato y se incuba en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. Drop 2 l de la cultura en una placa CM. Mantener el cultivo estéril.
- Preparación alternativa de ADN genómico
- Poner 1 cucharada (~ 200 l) de HCl lava perlas de vidrio para tubos de 2 ml. Añadir 2 ml de la U. cultura maydis y centrifugado a 12.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante (gránulos se pueden congelar en esta etapa).
- Añadir 500 l Usti tampón de lisis 2 al sedimento. Agitar durante 5 a 15 min en un Vibrax a 1000 rpm. Compruebe que el sedimento celular se resuspendió completamente.
- Incubar los tubos a 65 ° C durante 15 a 20 min. usando aproincubadoras adecuadas diseñadas para albergar tubos de 2 ml es crítica. A continuación, colocarlo en hielo durante 5 min.
- Añadir 100 l 8 M acetato de potasio, vórtice o invertir 8 a 10 veces. Girar 12.000 xg durante 15 min a TA.
- Transferencia de 500 l del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 400 l de isopropanol. Vortex o invertido 8 a 10 veces. Girar 12.000 xg durante 15 min. Aspirar el sobrenadante y lavar con 500 l 70% de EtOH. Girar 12.000 xg durante 5 min.
- Empapa del sobrenadante por completo! Con el tiempo, añadir un breve centrifugado (10 seg) para eliminar el líquido residual. Dejar que el ADN seco de pellets de 3 a 5 minutos. Añadir 50 l TE / ARNasa y se incuba a 50 ° C durante 10 a 15 min a 400 rpm.
- PCR
- Diseño dos pares de cebadores con uno de ellos fuera de la unión de los flancos y la correspondiente unión dentro del casete de resistencia (UF-f, RC-R; RC-f, DF-r, Figura 1) 9.
- Utilice 1 l de una dilución 1:10 de la gDNA de cada candidato como una plantilla en 2 reacciones de PCR verificación de la correcta inserción de aguas arriba y aguas abajo 9.
- Utilice reacciones PCR estándar para cada candidato y analizar los fragmentos generados 22.
Nota: estos PCRs de ensayo para la inserción de la casete de resistencia en el locus genómico correcto. Si los productos se obtienen por ambos lados, el candidato es probable que una inserción correcta. Sin embargo, también candidatos en el que sólo uno de los lados (aguas arriba o aguas abajo) se pudo confirmar deben llevarse a lo largo para su posterior análisis en caso de que las reacciones de PCR simplemente fracasaron por un flanco.
- Preparación de ADN genómico.
- Verificación de la inserción genómica correcta por Southern Blot Analysis 22
- Digerir 15 l de ADNg (4.2.1) de los candidatos mutantes y la correspondiente cepa de tipo salvaje / progenitor con una enzima apropiada que corta fuera del locus / construir y además, corta o bien en el gen o en el casete de resistencia que conduce a claramente distpatrones inguishable (Figura 1) 8.
NOTA: Ninguna de las bandas esperadas debe ser mayor de 10 kb, de manera que sean claramente distinguibles de ADN no digerido. - Utilice la aguas arriba y aguas abajo del flanco como sondas. Etiquetarlos por ejemplo, utilizar el kit de etiquetado PCR DIG o cualquier método estándar similar. Mezclar las sondas marcadas en una proporción de 1: 1 moleculares y llevar a cabo la transferencia de Southern. Mantenga por lo menos dos transformantes independientes correctas.
NOTA: El patrón de tipo salvaje debe ser claramente detectable en la cepa original y los clones correctos debe contener solamente las bandas esperadas. las bandas adicionales sólo presentes en los candidatos indican otras inserciones de la construcción en un lugar equivocado. Dichos clones deben ser desechados. El candidato negativos identificados en el primer diagnóstico de PCR debe contener las bandas de tipo salvaje y las bandas (impredecibles en el tamaño) de la construcción de deleción integrado erróneamente.
- Digerir 15 l de ADNg (4.2.1) de los candidatos mutantes y la correspondiente cepa de tipo salvaje / progenitor con una enzima apropiada que corta fuera del locus / construir y además, corta o bien en el gen o en el casete de resistencia que conduce a claramente distpatrones inguishable (Figura 1) 8.
- Las existencias de glicerol
NOTA: las existencias de glicerol sirven para mantener los clones durante años en colecciones de cepas. Al menos dos transformantes independientes deben mantenerse para cada mutante. Esto permite que comparan los fenotipos que deben ser idénticos.- Crecer 5 ml de cultivos de las cepas mutantes confirmados en Yeps-Light en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C Mix 500 l de cada cultivo con 500 l NSY-glicerol-medio. Invertir tubo hasta que la cultura y el medio estén bien mezclados. El glicerol en el medio impide la formación de cristales de hielo.
- Congelar a -80 ° C. Re-racha de una parte del cultivo congelado para comprobar si la acción es funcional.
5. microscópicos fenotipos
- Crecer 5 ml de cultivos de tipo salvaje y cepas mutantes en Yeps-Light en una rueda giratoria durante 12 horas a 28 ° C.
- Al día siguiente, se diluye la cultura a un OD 600 de alrededor de 0,1 y crecer él hasta una OD 600 entre 0,5 y 0,7. Un OD 600 de 1,0 correspgundos a aproximadamente 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml.
- Inspeccionar la morfología de las células al microscopio.
NOTA: Healthy células aparecen en forma de cigarro (Figura 4, WT). vacuolas pronunciadas o la formación de filamentos indican que se destacaron las células.
NOTA: En función del fenotipo mutante era de esperar, el análisis se puede adaptar, por ejemplo, si se utilizan reportero cepas del ensayo apropiado se puede llevar a cabo en esta etapa. Si la morfología celular se debe llevar a cabo el análisis estadístico cambiado, por ejemplo, para determinar la longitud de la célula media.
6. Ensayo de infección
NOTA: El ensayo de infección de las plántulas se ha visualizado anteriormente en esta revista 11. Se puede ser llevado a cabo utilizando un fondo cepa haploide solopathogenic como SG200 10 o mediante la mezcla de los socios de acoplamiento compatibles que porten la mutación.
- Crecer al menos un 40 por plántulas de maízcepa durante 7 días a un ciclo de luz de 16 horas, 200 E · 28 ° C / 22 ° C (día / noche). Deben estar en la etapa de 3 hojas y 10-15 cm de alto hasta el día de la infección.
- Dos días antes de la infección, iniciar un pre-cultivo de las cepas en 5 ml Yeps-Light en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. Crecer un cultivo principal en 50 ml Yeps-Luz hasta DO600 = 1,0 (tasa de división celular = 2 horas, permiten 3 divisiones mínimo, se puede hacer S / N).
- Centrifugar las células de cultivo de 50 ml a 1500 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Lavar 3 veces con H2O estéril Resuspender las células en H2O estéril a un OD 600 de 3,0. Si es necesario, mezclar los socios de apareamiento.
- Inyectar 250 - 500 l de las suspensiones de células en el tallo de las plántulas de maíz de edad 7 días usando una jeringa pequeña. Utilice H2O estéril como control. Mantenga plántulas infectadas durante 7-14 días adicionales en las mismas condiciones de luz y temperatura. Anotar el fenotipo de cada planta unaegún sana, clorosis, la formación de antocianinas, los tumores pequeños, los tumores grandes, plantas muertas 10.
NOTA: La puntuación puede hacerse tan pronto como 7 días y se repite a los 14 días para seguir la infección con el tiempo.
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Representative Results
Las construcciones de deleción para los cuatro genes quitinolíticas codificados en la U. maydis genoma fueron generados por clonación Golden Gate de utilizar la cinta para la eliminación de HygR CTS1, el NATR para la eliminación de CTS2, el casete G418r para la eliminación de cts3 y la CBXR para la eliminación de cts4 20. Una visión general de la estrategia de sustitución de genes se ejemplifica mediante la supresión de cts3 (Figura 1). Mutantes simples y dobles de CTS1 con un segundo gen quitinolítica se generaron secuencialmente con las mismas construcciones en dos fondos genéticos diferentes para el análisis de la función de las quitinasas en la virulencia. Se emplearon dos diferentes cepa antecedentes: AB33 permite la inducción del crecimiento filamentoso, el primer paso hacia la patogenicidad 23, SG200 es una cepa patógena en solitario que permite rápida de la enfermedad anotando 10 cts3 -deletion constructo en el fondo cepa apropiada, las colonias individuales de la segunda placa de selección se ensayaron para la eliminación correcta de diagnóstico por PCR (Tabla 1) y Southern blot (Figura 3). Curiosamente, para cts3 la tasa de recombinación homóloga fue mucho mayor en SG200 que en AB33, pero esta diferencia no se observó consistentemente en deleciones de las otras quitinasas.
La verificación cepa estrictas asegura una sola inserción de la supresión construir en la posición deseada. Sin embargo, la modificación adicional tal como mutaciones puntuales pueden no ser detectados, lo que podría inducir a error a la interpretación de los fenotipos. Por lo tanto, al menos dos transformantes independientes se fenotipados.
Higo Ure 1. Visión general de la estrategia de eliminación ejemplificado por cts3. Esta visión esquemática incluye la supresión construir con el flanco ascendente (UF), el flanco descendente (DF), y el módulo de resistencia a geneticina (G418r), el locus genómico de tipo salvaje (WT ) y cts3 mutante de deleción y todos los cebadores, así como los sitios de restricción usados en la verificación de deformación. Los primeros resultados de diagnóstico de PCR en un producto si la copia del gen de tipo salvaje está presente, los dos PCRs de diagnóstico segundo resultado en productos si la casete de resistencia se ha integrado correctamente. Para la transferencia de Southern del ADN genómico se digiere con PstI, las sondas abarcan la UF y DF (barras rojas) que conduce a la detección de una banda de 6,7 kb en wildtype y dos bandas de 5,6 kb y 2,0 kb en el mutante. Además, la sonda DF reconoce débilmente un producto 2.6 kb. Por favorclic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. verificación microscópica de protoplasting reacción. (A) las células de tipo salvaje no tratados (FB2) aparecen en forma de cigarro. (B) Tras el tratamiento con enzimas que degradan la pared celular (aquí durante 30 min), la aparición de esferas redondas en un extremo (s) y la barra de campana como las estructuras (b) indica que la degradación de la pared celular se ha iniciado. Finalmente los protoplastos son completamente redonda (r), que es debido a la falta de la pared celular. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
FIGURA 3. Southern blot para cts3 eliminación. El ADN genómico fue digerido con PstI. Ambos flancos se marcaron, mezclados en proporciones equimolares y se utiliza como una sola sonda. En el SG200 de tipo salvaje y deleciones del CTS1 quitinasas y CTS2, se detectó una sola banda de 6,7 kb. En supresiones cts3 (G y K), dos bandas de 5,6 kb y 2,0 kb son visibles indicativo de la eliminación correcta de cts3. Una banda adicional de 2,6 kb puede ser visualizado por la sobreexposición masiva. Esto corresponde a un fragmento que es reconocido por una superposición de sólo 100 pares de bases de la sonda flanco aguas abajo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Algunas mutaciones conducen a defectos de crecimiento obvias que pueden ser detectados microscópicamente. En las supresiones de quitinasa, único mutantes no mostraroncualquier defecto evidente, mientras que CTS1 / 2 dobles mutantes mostró una separación de células pronunciado defecto 20. La tinción de septos mostró que la citocinesis se terminó pero las células se mantuvo conectado probablemente a través de la quitina residual (Figura 4 de Langner et al. 2015). Un fenotipo de crecimiento microscópico similar se conoce por el borrado de khd4 24, un gen que codifica una proteína de unión al ARN mediadora de ARN rotación post-transcripcional de genes implicados en la morfología y la patogenicidad 25.
Figura 4. El análisis microscópico de los mutantes de deleción. La morfología celular y el tabique formación de las cepas de deleción de quitinasa. CTS1 / 2 delta cepas exhiben un defecto de separación de células y forman grandes agregados, que no es debido a la falta de formación de septum. Primaria y secundariaseptos (ver la ampliación 5x en inserciones) se tiñeron con Calcofluor White (CW) antes de la microscopía. Barras de escala = 10 m. Esta cifra es reimpreso con el permiso de Langner et al. 2015 de la célula eucariótica 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para probar la contribución de quitinasas a la virulencia, ensayos de infección de plántulas se llevaron a cabo utilizando los mutantes de la cepa de fondo SG200. Mientras que los mutantes en khd4 se redujeron en la virulencia, la supresión de las quitinasas no afectó a la infección de las plántulas de maíz (Figura 5) 20,25.
Figura 5. ensayo de infección de los mutantes de deleción. Calificación de la enfermedad deplántulas de maíz 9 días después de la infección con el respectivo U. maydis cepas. (A) los síntomas macroscópicas que se utilizan para la puntuación de la enfermedad. (B) dos transformantes independientes fueron probadas para cada cepa (N> 100). Todos los mutantes de quitinasa deficientes (1/2 / 3Δ: endochitinases mutantes triples, 4Δ: único mutante N-acetilglucosaminidasa, 1/2/3 / 4Δ: mutante cuádruple) infectan la planta huésped que conduce a la formación de tumores pesada como se observa en las infecciones de tipo salvaje con la cepa SG200 solopathogenic. Por el contrario, una cepa con una deleción del gen que codifica la proteína de unión al ARN Khd4 se redujo en la virulencia como se informó anteriormente 24. Las barras de error indican la desviación estándar de tres experimentos independientes. Esta cifra se modifica con el permiso de Langner et al 2015 de la célula eucariótica 20.. Por favor, haga clic aquí para ver una granr Versión de esta figura.
| antecedentes genéticos | 1 diagn st. PCR (excluidos / probado) | 2º diagn. PCR (confirmado / prueba) | Del Sur (confirmado / prueba) | RECOMB%. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 CTS1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabla 1:. Comprobación de tracción para las supresiones cts3 El cts3 gen de quitinasa se ha eliminado en cuatro diferentes bases genéticas para permitir que los estudios sobre el crecimiento filamentoso (AB33) e infección (SG200) en deleciones únicas y múltiples.
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Discussion
Este protocolo se describe cómo generar mutantes de deleción para estudios de genética inversa en U. maydis. El punto de partida es una construcción de deleción que contiene secuencias flanqueantes del gen de interés que contiene secuencias de aproximadamente 1 kb aguas arriba del inicio y aguas abajo del codón de parada, así como un casete de resistencia apropiada, ya que estaba previamente optimizado 7,9 . Las construcciones que se han generado de forma individual para cada gen y verificado cuidadosamente para errores de secuencia antes de eliminar el gen. Las mutaciones puntuales en los flancos pueden producir alteraciones no deseadas en la secuencia genómica, en particular si los flancos llegan en el gen vecino o la mutación modifica elementos reguladores. Esto afectaría a todos los transformantes y puede causar fenotipos y los efectos secundarios no relacionados con la deleción del gen deseado.
Al planificar la estrategia de eliminación, el fenotipo esperado tiene que ser considerado para elegir el fondo genético. En el presente caso, AB33 23 y 10 SG200 se eligieron para permitir para el ensayo de fenotipos en el interruptor y la planta de la infección morfológica. Del mismo modo, muchos otros de lectura-outs pueden ser de su interés, por ejemplo, fusiones con CTS1 se emplean en la exportación de proteínas heterólogas 14,26, y un fondo de cepa con fluorescencia etiquetados rrm4 permite el análisis de ARN de transporte en endosomas 27,28.
Durante la verificación de tracción, los informes de terminación de diagnóstico de alto rendimiento permiten una rápida reducción del número de candidatos a ensayar en el Southern blot bastante laborioso. En particular, la primera PCR de diagnóstico permite la exclusión de los candidatos que todavía contengan la copia de tipo salvaje del gen y por lo tanto evita el uso masivo de fenol tóxico en preparaciones gDNA. En un caso estándar con un gen no esencial, aproximadamente la mitad de las colonias puede contener el gen de tipo salvaje. Esta preselección puede ser de gran interés para los genes con fenotipos de crecimiento potencialmente perjudiciales. Cientos de candidatos pueden ser rápidamente controlados.
Si todos los candidatos contienen la copia de tipo salvaje, la deleción del gen es más probable letal. Esto se puede confirmar mediante la supresión de una copia en un fondo diploide cepa (por ejemplo, D132) y el análisis de la segregación después de la germinación teliospora 29. Alternativamente, una estrategia de supresión condicional utilizando un promotor inducible se puede elegir para seguir el fenotipo mutante. Sin embargo, también la contaminación resultante del método basado en NaOH crudo para la preparación ADNg puede interferir con la PCR y dar lugar a falsos negativos, es decir, los candidatos no muestran una banda y por lo tanto se mantienen a pesar de que contienen el gen. Esto puede ser excluida por la prueba de un gen de control con un producto de tamaño comparable en una reacción PCR independiente o por multiplex-PCR con los dos cebadores y cebadores específicos de genes para un gen de control que resultan en un fragmento más grande.
contenido "> Si un mutante ya está disponible, por ejemplo, Δ CTS1 30 o Δ rrm4, la generación de la tensión de las versiones etiquetadas se puede acelerar mediante la sustitución del casete de resistencia de supresión de genes (por ejemplo, HygR) en el genoma con una novela construcción que contiene, por ejemplo, la rrm4 marcado fluorescentemente y un marcador de resistencia diferente (por ejemplo NATR). En este caso, los transformantes se pueden seleccionar por la pérdida del marcador de resistencia inicial 9. candidatos correctos son resistentes sólo contra el nuevo antibiótico (nourseothricin) y han perdido su resistencia inicial (higromicina ). Además, la complementación del fenotipo mutante en trans se puede llevar a cabo para verificar la funcionalidad de los constructos etiquetados 30,31.La deleción del gen y la modificación de la estrategia aquí descrita ofrece una herramienta fiable y exacta en el análisis genético de U. maydis. Para embargo deleciones múltiples, la cepa generación puede conseguir mucho tiempo, ya que las alteraciones tienen que llevarse a cabo de forma secuencial. Por lo tanto, como una herramienta complementaria, el año pasado el sistema CRISPR-cas se ha establecido para U. maydis 32. Ofrece la posibilidad de interrumpir varios genes simultáneamente y es una excelente adición a la caja de herramientas genética de U. maydis.
En resumen, el protocolo para la manipulación genética y U. maydis generación cepa se describe aquí es un método robusto que ha sido ampliamente utilizado en la comunidad durante años. Junto con la colección completa de módulos de casete respectiva resistencia que permite todo tipo de ingeniería genética en este hongo, abordar diversas cuestiones que van desde la investigación básica a la aplicada.
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Acknowledgments
Un agradecimiento especial al Dr. Benedikt Steuten para la lectura crítica del manuscrito. El trabajo original sobre las quitinasas se llevó a cabo por el Dr. Thorsten Langner. El laboratorio de VG es apoyado por el Cluster de Excelencia en Ciencias de las Plantas (CEPLAS, DFG EXC 1028) y BioSC, el laboratorio de KS es apoyado por BioSC. KB es apoyado por BioSC. Las actividades científicas del Centro de Ciencias de Bioeconomía (BioSC) fueron apoyados económicamente por el Departamento de Innovación, Ciencia e Investigación, en el marco de la NRW Strategieprojekt BioSC (Nº 313 / 323-400-00213). LF es apoyado por una beca de doctorado de la DFG Grupo Internacional de Formación de Investigadores 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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