Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em> Ustilago maydis</em> По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий
Summary
Мы описываем надежную стратегию замены генов генетически манипулировать головне гриба Ustilago maydis. Этот протокол объясняет, как генерировать делеционных мутантов для исследования инфекции фенотипы. Он может быть расширен , чтобы модифицировать гены любым желаемым способом, например, путем добавления последовательность , кодирующую флуоресцентный белок тег.
Abstract
делеции гена играет важную роль в анализе функции гена. Одним из наиболее эффективных способов сорвать генов в качестве целевой группы является замена всего гена с селективным маркером посредством гомологичной рекомбинации. В процессе гомологичной рекомбинации, обмен ДНК происходит между последовательностями с высоким сходством. Таким образом, линейные геномные последовательности, фланкирующие ген-мишень, может быть использован, чтобы специально направить селективный маркер на нужный сайт интеграции. Тупые концы делеций конструкции активировать систему восстановления ДНК клетки и, таким образом, способствовать интеграции конструкции либо с помощью гомологичной рекомбинации, либо не-гомологичной отслуживших присоединения. В организмах с эффективной гомологичной рекомбинации, скорость успешного удаления гена может достигать более 50% решений эта стратегия является ценным система разрушение гена. Головне гриб Ustilago maydis является эукариотической модель микроорганизм показывает такую эффективную гомологичной рекомбинантногоиона. Из его около 6900 генов, многие из них были функционально характеризуется с помощью мутантов с делецией, и неоднократный отказ замены гена покушений точек на основной функции гена. Последующая характеристика функции генов с помощью мечения с флуоресцентными маркерами или мутации предсказанных доменов также опирается на обмен ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Здесь мы представляем U. maydis стратегия генерации штамма подробно , используя простой пример, удаление гена.
Introduction
Ustilago maydis является фитопатогенные модель грибок , который интенсивно изучали в течение многих десятилетий 1,2. Он существует в двух морфологией, дрожжей типа, непатогенных стадии и мицелиальных, инфекционная форма 3. Универсальные прорывные открытия , такие как гомологичные механизмы рекомбинации и репарации ДНК были сделаны в дрожжеподобных стадии роста этого гриба 4. Кроме того, морфологический переход к инфекционным и филаментов факторов вирулентности важных для инфекции хорошо характеризуются 5,6. Растущий молекулярно знания о биологии и вирулентность этого гриба головне опирается на стратегию замещения прямой гена 7-9 поддерживается отличным генома аннотацию 10 и легкости обратной генетики с использованием, например, хорошо организованная коллекция плазмида в нашем институте (HTTP : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Стандартизированные, быстрые анализы инфекции у кукурузы сeedlings позволяют детальные исследования факторов патогенности 11.
Геном U. maydis содержит около 6900 генов 10. Для изучения их функции, они могут быть удалены по отдельности или в комбинации из-за эффективной системы гомологичной рекомбинации. Фланкирующих участков около 1 т.п.н. , содержащий совершенно гомологичные концы идеально подходят для скоростей гомологичной рекомбинации более чем на 50%, но уже в 250 пар оснований с негомологичные концов допускают некоторую степень правильной интеграции конструкции 9. В настоящее время пять различных кассет сопротивления, HYGR, cbxR, натр, G418R и phleoR посредническую сопротивление против гигромицину, карбоксин, nourseothricin, G418 и флеомицина, используются для выбора трансформантов 7,9. Кроме того, устойчивости к гигромицину была разработана в перерабатываемых кассету (FRT-HYGR) , которые могут быть удалены путем временной экспрессии гетерологичного FLP рекомбиназой 12, Это позволяет удалять сопротивления кассеты и, таким образом, в теории неограниченных генетических модификаций. Флеомицин мутагенных 13, так что с новыми кассетами, в частности, для повторного использования HYGR кассета, использование phleoR уменьшается. Четырехместные мутанты могут , таким образом , быть получены с использованием других четырех кассет, но для пятикратных мутантов, система FRT-HYGR рекомендуется 14.
Эта общая стратегия удаления гена была успешно передана другим головни грибов , таких как Sporisorium reilianum 15, У. hordei 16, или U. съедобная 17 и , следовательно , обладает потенциалом для дальнейшего применения в еще генетически неразрешимых организмов с эффективной системы гомологичной рекомбинации. Кроме того, организмы, не имеющие гомологичной рекомбинации может быть модифицирован для улучшения методов генной инженерии на примере делеции генов, участвующих в негомологичный-анd-присоединение в нейроспора густая 18,19.
Здесь мы опишем опубликованную стратегию удаления гена для U. maydis 7,9 в экспериментальной подробно с акцентом на быстрой и точной проверки кандидатов. В качестве примера, мы используем грибковые хитиназы и изображают поколение одиночных мутантов, а также удаление множества штаммов 20,21. Хитиназы интересные примеры, потому что они действуют на хитин в жесткой клеточной стенки. Клеточная стенка ремоделирования требуется для морфологических изменений во время клеточного деления, переключиться на нитчатых роста и спорообразования. Следовательно, в делеционных мутантов можно ожидать фенотипы на протяжении всего жизненного цикла.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает , как генерировать делеционных мутантов для обратного генетических исследований в U. maydis. Отправной точкой является делеция конструкция , которая содержит фланкирующие последовательности гена представляющей интерес , содержащий последовательности около …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Особая благодарность д-ром Бенедиктом Steuten за критическое прочтение рукописи. Оригинальный работа над хитиназы была проведена доктором Торстен Ланглер. Лаборатория VG поддерживается кластером передового опыта в области растений наук (CEPLAS, DFG EXC 1028) и BioSC, лаборатория KS поддерживается BioSC. KB поддерживается BioSC. Научная деятельность биоэкономике научного центра (BioSC) при финансовой поддержке Министерства инноваций, науки и исследований в рамках NRW Strategieprojekt BioSC (№ 313 / 323-400-00213). LF поддерживается докторская общение 1525 iGRADplant DFG International Training Group Research.
Materials
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
