Summary

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em> Ustilago maydis</em> ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

Abstract

מחיקת ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בניתוח של תפקוד גן. אחת השיטות היעילות ביותר לשבש גנים באופן ממוקד הוא החלפת הגן כולו עם סמן לבחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגי. במהלך הומולוגי, חילופי DNA מתרחשים בין רצפים עם דמיון גבוה. לכן, רצפי הגנום ליניארי איגוף גן מטרה ניתן להשתמש כדי לכוון סמן לבחירה במיוחד לאתר אינטגרציה הרצוי. קצוות בלאנט של לבנות את המחיקה להפעיל את מערכות תיקון דנ"א של התא ובכך לקדם אינטגרציה של המבנה או דרך רקומבינציה הומולוגי או שאינו הומולוגיים סוף-שהצטרף. באורגניזמים עם הומולוגיים יעילים, שיעור מחיקת גן מוצלח יכול להגיע ליותר מ -50% ביצוע אסטרטגיה זו מערכת שיבוש הגנטי יקרה. פטריית התועבה Ustilago maydis היא מיקרואורגניזם מודל אוקריוטים מראה recombinat הומולוגי יעיל כזהיוֹן. מתוך שלה על 6,900 גנים, רבים מתאפיינים תפקודי בעזרת מוטציות מחיקות, וחזר על כישלון נקודות ניסיונות החלפת גן על תפקוד חיוני של הגן. האפיון הבא של תפקוד הגן על ידי תיוג עם סמני ניאון או מוטציות של תחומים ניבאו גם מסתמך על חילופי דנ"א באמצעות רקומבינציה הומולוגי. כאן, אנו מציגים את U. דור אסטרטגית זן maydis בפירוט באמצעות הדוגמא הפשוטה ביותר, את מחיקת הגן.

Introduction

Ustilago maydis היא פטרייה מודל phytopathogenic כי נחקרה בהרחבה במשך עשרות שנים 1,2. היא קיימת בשני מורפולוגיות, שלב שמרים דמוי, שאינם פתוגניים וטופס filamentous, זיהומיות 3. תגליות פריצת דרך יוניברסל כגון מנגנוני רקומבינציה ותיקון DNA הומולוגיים נעשו בשלב הגדילה דמוי השמרים של פטריית 4 זו. יתר על כן, בורר מורפולוגיים לגורמי הנימה ארסי זיהומיות החשובים לזיהום הם היטב מאופיינים 5,6. הידע המולקולרי הגדיל אודות ביולוגיה ארסית של פטריית התועבה הזה מסתמך על אסטרטגיית התחדשות גן פשוט 7-9 הנתמך על ידי ביאור הגנום מעולה 10 ואת הקלות של גנטיקה הפוכה באמצעות, למשל, באוסף פלסמיד המאורגן היטב במכון שלנו (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). סטנדרטיים, מבחני זיהום מהירים של תירסeedlings לאפשר מחקרים מפורטים של פתוגניות גורמי 11.

הגנום של U. maydis מכיל כ 6,900 גנים 10. כדי ללמוד את תפקידם, הם יכולים להימחק בנפרד או בשילוב בשל מערכת הומולוגית יעילה. אזורי איגוף של כ 1 kb המכילים קצוות הומולוגיים מושלם הם אידיאליים עבור שיעורים הומולוגיים יותר מ -50%, אבל כבר 250 נ"ב עם קצוות שאינם הומולוגיים לאפשר מידה מסוימת של אינטגרציה הנכונה של המבנה 9. נכון לעכשיו, חמש קלטות התנגדות שונות, hygR, cbxR, natR, G418R, ו phleoR בתיווך התנגדות נגד hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 ו- phleomycin, מועסק כדי לבחור עבור transformants 7,9. בנוסף, התנגדות hygromycin כבר התפתחה קלטת למחזור (FRT-hygR) כי ניתן להסיר על ידי הביטוי החולף של recombinase FLP Heterologous 12. זה מאפשר סר של הקלטת התנגדות ובכך ב שינויים גנטיים בלתי מוגבלים תאוריה. Phleomycin הוא מוטגנים 13, כך שעם הקלטות החדשות, בפרט את קלטת hygR למחזור, שימוש phleoR הולך ופוחת. מוטציות Quadruple ולכן יכולות להיוצר באמצעות הקלטות הארבעה אחרים, אבל עבור מוטציות מחומשות, מערכת FRT-hygR מומלצת 14.

אסטרטגיה מחיקת גן כללית זו הועברה בהצלחת פטריות תועבה אחרות כגון Sporisorium reilianum 15, ע ' 16 hordei, או U. אסכאלאנטה 17 ולכן מציע את הפוטנציאל עבור יישומים נוספים באורגניזמים עדיין גנטי סוררים עם מערכת הומולוגית יעילה. יתר על כן, אורגניזמים חסרי הומולוגיים יכול להיות שונה כדי לשפר את ההנדסה הגנטית כפי שהודגם על ידי מחיקה של גנים המעורבים שאינם הומולוגיים-אןד-מצטרף Neurospora crassa 18,19.

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה המחיקה גן שפורסם U. maydis 7,9 בפירוט הניסיון עם דגש על האימות המהירה ומדויקת של המועמדים. כדוגמא, אנו משתמשים chitinases פטרייתי מתארים את הדור של מוטציות יחידות, כמו גם מחיקת מספר זני 20,21. Chitinases הם דוגמאות מעניינות, כי הם פועלים על כיטין בקיר התא הנוקשה. שיפוץ דופן התא נדרש עבור שינויים מורפולוגיים במהלך חלוקת התא, לעבור לצמיחה פילמנטיות, ולאחר יצירת הנבגים. לפיכך, מוטנטים מחיקה פנוטיפים לאורך כל מחזור החיים ניתן לצפות.

Protocol

דור 1. בין שני מושגים מחיקים צור פלסמיד המכיל את המבנה המחיק (איור 1) המהווים אגף זרם בהתאמת 1 kb (UF) לבין אגף במורד זרם (DF) כל ואת קלטת ההתנגדות המתאימה מוקפת אתרי הגבלת חיתוך בוטים. הערה: כל אסטרטגיה שיבוט יכול…

Representative Results

הקונסטרוקציות המחיקות של כל ארבעת הגנים chitinolytic רשומים U. הגנום maydis נוצרו על ידי שיבוט גולדן גייט באמצעות קלטת hygR למחיקה של cts1, את natR למחיקה של cts2, הקלטת G418R למחיקה של cts3 ואת cbxR למחיקה של cts4 20. סקירה…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מוטציות מחיקות למחקרים גנטיים הפוכים ב U. maydis. נקודת המוצא היא קונסטרוקציה המחיקה המכיל רצפים איגוף של הגן של ריבית המכיל רצפים של כ 1 קילו במעלה הזרם של ההתחלה במורד הזרם של תחנת-קודון וכן קלטת התנגדות מתאימה כפי שהוא היה מותאם בעבר

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה מיוחדת לד"ר בנדיקט Steuten לקריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה המקורית על chitinases בוצע על ידי ד"ר תורסטן Langner. המעבדה של VG נתמך לפי האשכול של מצוינות למדעי הצמח (CEPLAS, DFG EXC 1028) ו BioSC, המעבדה של KS הוא נתמך על ידי BioSC. KB נתמך על ידי BioSC. הפעילות המדעית של מרכז המדע Bioeconomy (BioSC) נתמכו כלכלית על ידי משרד חדשנות, מדע ומחקר במסגרת של NRW Strategieprojekt BioSC (מס '313 / 323-400-00213). LF נתמך על ידי דוקטורט של 1525 iGRADplant קבוצת הדרכת המחקר הבינלאומי DFG.

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto Agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto Peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Name Company Catalog Number Comments
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

References

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

View Video