Summary

Manipulation génétique de l'agent pathogène des plantes<em> Ustilago maydis</em> Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Published: September 30, 2016
doi:

Summary

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Abstract

Délétion du gène joue un rôle important dans l'analyse de la fonction génique. L'une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l'échange d'ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d'intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d'ADN de la cellule et ainsi favoriser l'intégration de la construction, soit par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l'aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l'échange d'ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l'exemple le plus simple, la suppression du gène.

Introduction

Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies 1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse 3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l' ADN homologues ont été faites à l'étape de ce champignon 4 croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l' infection sont bien caractérisés 5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur la biologie et de la virulence de ce champignon du charbon repose sur une stratégie de remplacement de gène simple 7-9 soutenu par une excellente annotation du génome 10 et la facilité de génétique inverse en utilisant, par exemple, la collecte de plasmide bien organisé dans notre institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Normalisés, tests d'infection rapide dans le maïs seedlings permettent des études détaillées de pathogénicité facteurs 11.

Le génome de U. maydis contient environ 6.900 gènes 10. Pour étudier leur fonction, ils peuvent être supprimés individuellement ou en combinaison grâce à un système de recombinaison homologue efficace. Régions flanquantes d'environ 1 kb contenant des extrémités parfaitement homologues sont idéales pour les taux de recombinaison homologue supérieure à 50%, mais déjà 250 pb avec des extrémités non homologues permettent un certain degré d'intégration correcte de la construction 9. À l' heure actuelle, cinq cassettes de résistance différentes, Hygr, CBXR, NATR, G418R, et la médiation de la résistance contre phleoR hygromycine, la carboxine, la nourséothricine, G418 et phléomycine, sont utilisés pour sélectionner les transformants 7,9. En outre, la résistance à l'hygromycine a été développé dans une cassette recyclable (TRAF-Hygr) qui peut être éliminé par l'expression transitoire d'une recombinase FLP hétérologue 12. Ceci permet le retrait de la cassette de résistance et donc en théorie illimité des modifications génétiques. Phléomycine est mutagène 13, de sorte que les nouvelles cassettes, en particulier , la cassette Hygr recyclable, l'utilisation de phleoR diminue. Mutants quadruples peuvent ainsi être générés en utilisant les quatre autres cassettes, mais pour les mutants quintuples, le système FRT-Hygr est recommandé 14.

Cette stratégie générale de délétion du gène a été transféré avec succès à d' autres champignons du charbon tels que Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 et donc offre la possibilité de nouvelles applications dans les organismes génétiquement encore intraitables avec un système de recombinaison homologue efficace. En outre, les organismes dépourvus de recombinaison homologue peuvent être modifiées pour améliorer le génie génétique comme en témoigne la suppression de gènes impliqués dans la non-homologue-end-assemblage dans Neurospora crassa 18,19.

Nous décrivons ici la stratégie de délétion du gène publié pour U. maydis 7,9 en détail expérimental avec un accent sur la vérification rapide et précise des candidats. A titre d'exemple, nous utilisons les chitinases fongiques et représentent la génération de mutants simples, ainsi que la suppression de multiples souches 20,21. Chitinases sont des exemples intéressants, car ils agissent sur chitine dans la paroi cellulaire rigide. le remodelage de la paroi cellulaire est nécessaire pour les changements morphologiques au cours de la division cellulaire, le commutateur de croissance filamenteuse et la formation de spores. Par conséquent, dans les mutants de deletion phénotypes au long du cycle peuvent être attendus.

Protocol

1. Génération de deletion Constructs Générer un plasmide contenant la construction de deletion (figure 1) comprenant un flanc respectif de 1 kb en amont (UF) et le flanc aval (DF) chacune et la cassette de résistance appropriée flanquée par des sites de restriction de coupe émoussés. NOTE: Toute stratégie de clonage peut être utilisé (pour le clonage voir référence 22) , nous recommandons Golden Gate clonage pour ces plasmides 9. Exciser la…

Representative Results

Les constructions de deletion pour les quatre gènes codés dans chitinolytiques U. maydis génome a été généré par clonage Golden Gate utilisation de la cassette Hygr pour la suppression de CTS1, le NATR pour la suppression de CTS2, la cassette d'G418R pour la suppression de CTS3 et CBXR pour la suppression de CTS4 20. Une vue d' ensemble de la stratégie de remplacement de gène est…

Discussion

Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d'intérêt contenant des séquences d'environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d' arrêt ainsi que d' une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé 7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque g?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Remerciements particuliers à Dr. Benedikt Steuten pour la lecture critique du manuscrit. Le travail original sur les chitinases a été réalisée par le Dr Thorsten Langner. Le laboratoire du VG est pris en charge par le Pôle d'excellence en sciences végétales (CEPLAS, DFG EXC 1028) et ICSOB, le laboratoire de KS est soutenu par ICSOB. KB est soutenu par ICSOB. Les activités scientifiques du Centre des sciences de la bioéconomie (ICSOB) ont été soutenus financièrement par le Ministère de l'innovation, des sciences et de la recherche dans le cadre de la NRW Strategieprojekt ICSOB (n ° 313 / 323-400-00213). LF est soutenu par une bourse de doctorat du DFG Groupe international de formation de recherche 1525 iGRADplant.

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto Agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto Peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Name Company Catalog Number Comments
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

References

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Cite This Article
Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

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