Drosophila og pattedyr bloddannende system deler mange fælles træk, hvilket gør Drosophila en attraktiv genetisk model til at studere hæmatopoiese. Her demonstrerer vi dissektion og montering af store larver hæmatopoietisk organ for immunhistokemi. Vi beskriver også metoder til at analysere forskellige larver hæmatopoietiske rum, herunder cirkulerende hæmocytter og fastsiddende krystal celler.
Der findes mange paralleller mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoietiske systemer, selv om Drosophila mangler den lymfoid herkomst, der karakteriserer pattedyr adaptiv immunitet. Drosophila og pattedyr hæmatopoiese forekomme i rumligt og tidsligt adskilte faser at producere flere blodcellelinjer. Begge systemer opretholder reservoirer af blod-stamceller med til at udvide eller erstatte modne afstamninger. Det hæmatopoietiske system tillader Drosophila og pattedyr til at reagere på og tilpasse sig immune udfordringer. Vigtigere er de transkriptionelle regulatorer og signalveje, der styrer generation, vedligeholdelse og funktion af det hæmatopoietiske system bevaret fra fluer til pattedyr. Disse ligheder gør det muligt Drosophila skal anvendes til genetisk model hæmatopoietisk udvikling og sygdom.
Her er vi detalje analyser til at undersøge hæmatopoietiske system Drosophila larver. IIsær vi skitsere metoder til at måle blod celletal og koncentration, visualisere en bestemt moden afstamning in vivo, og udføre immunhistokemi på blodlegemer i cirkulation og i hæmatopoietisk orgel. Disse assays kan afsløre ændringer i genekspression og cellulære processer, herunder signalering, overlevelse, proliferation og differentiering og kan anvendes til at undersøge en række spørgsmål vedrørende hæmatopoiese. Kombineret med de genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, kan disse assays anvendes til at vurdere det hæmatopoietiske system ved definerede genetiske ændringer. Mens ikke specifikt beskrevet her, kan disse assays også anvendes til at undersøge effekten af miljømæssige ændringer, såsom infektion eller kost, på det hæmatopoietiske system.
De komplekse mekanismer, der regulerer transskription faktorer og signalveje, der koordinerer udviklingen af det hæmatopoietiske system, og at fejl i hæmatologiske sygdomme stadig dårligt forstået. Disse transkriptionsfaktorer og signalveje, samt deres regulering, er stærkt konserverede mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoiese 1-5. Drosophila hæmatopoietiske system udgør således en fremragende genetisk model til at definere de molekylære mekanismer, der styrer hæmatopoiese og underliggende hæmatologiske sygdomme.
Svarende til pattedyr, Drosophila generere blodlegemer, kaldet hæmocytter, i rumligt og tidsligt adskilte faser af hæmatopoiese. Traditionelt blev Drosophila hæmatopoiese tænkt at være begrænset til faser i det embryoniske mesoderm og i larvernes lymfekirtel. Nylige undersøgelser dokumenterer, at hæmatopoiese også forekommer i larvernes siddende kosters og i den voksne maven 6-8. Alle hæmatopoietiske faser producerer to typer af modne hæmocytter: plasmatocytes og krystal celler. Plasmatocytes er makrofaglignende celler involveret i fagocytose, medfødte immunitet, og sårheling. Krystal celler indeholder pro-phenoloxidaser kræves til melanin, en reaktion, der anvendes i insekt immunreaktioner og sårheling. Larve hæmatopoiese kan generere en tredje moden hemocyte type, der kaldes en lamellocyte, som svar på visse immune udfordringer såsom snyltehveps hveps infektion 9,10. Lamellocytes er store, klæbende celler, der fungerer sammen med plasmatocytes og krystal celler, at indkapsle og neutralisere hveps æg lagt i Drosophila larver. I fravær af parasitization, er lamellocytes ikke fundet i vildtype-larver. Melanotiske masser ligne melanized, indkapslet wasp æg; mange mutant Drosophila-stammer udvikler melanotiske masser i fravær af parasitization. Tilstedeværelsen af Lamellocytes og / eller melanotiske masserne kan være tegn af hæmatopoietiske abnormiteter. Faktisk har den melanotiske masse fænotype blevet anvendt til at identificere gener og pathways involveret i hæmatopoiese 11-14.
Larvestadiet hæmatopoietiske system er den mest omfattende undersøgt til dato. Det består af hæmocytter cirkulerer i hemolymph, fastsiddende hemocyte klynger mønstrede under neglebånd og hæmocytter bosiddende i lymfeknuder kirtel. Den lymfekirtel er en række bilaterale lapper fastgjort til den dorsale fartøj. Hver primære Lap af lymfeknuder kirtel er inddelt i tre hovedzoner. Den yderste zone er kendt som den kortikale zone og indeholder modning hæmocytter. Den inderste zone kaldes medullære zone og består af hvilende hemocyte forstadier. Den tredje zone, den bageste signalering centrum, er en lille gruppe af celler ved basen af lymfekirtel, der fungerer som en stamcelle-lignende niche. Tidligt arbejde etableret kritiske funktioner for Notch 15-18 </sup>, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18, og Vingeløse 21 aktivitet til at regulere larvernes lymfe kirtel udvikling. Nyere undersøgelser har vist, at BMP 22, FGF-Ras 23, og Hippo 24,25 signalering også fungere inden larve lymfekirtel.
Fire larval hæmatopoietiske assays beskrevet her beskriver 1) måling cirkulerende hemocyte koncentration, defineret som antal celler pr volumenenhed, 2) isolering og fiksering cirkulerende hæmocytter for immunhistokemi, 3) visualisere krystal celler in vivo, og 4) dissecting, fastsættelse og montering lymfekirtler for immunhistokemi. Disse assays kan anvendes som hæmatopoietiske udlæsninger at vurdere de funktioner og forskrifter signalveje i larvernes hæmatopoietiske system. Mens disse metoder, der tidligere er blevet anvendt inden for området, har visuelle dokumentation af disse assays begyndt først for nylig 8,26-30. citeret her flere publikationer hjælpful ressourcer der beskriver lignende metoder og hæmatopoietiske markører 26,31-33. Derudover Trol og Viking er nyttige markører for lymfeknuder kirtel basalmembranen.
Ved genetisk eller miljømæssig ændring, kan de fire metoder, der er beskrevet her, kan anvendes enkeltvis eller sammen for at analysere forskellige processer under hæmatopoiese såsom signalering, overlevelse, proliferation og differentiering Drosophila hæmatopoiese er en dynamisk proces.; antallet af hæmocytter per dyr øger 35 og strukturen og genekspression af lymfeknuder kirtel skifter 32 under udviklingen. Forud for udførelse af disse analyser, derfor er det vigtigt at begræns…
The authors have nothing to disclose.
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Triton | Fisher | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
glycerol | VWR | EM-4750 | |
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
6-well plate | Corning | 351146 | |
12-well plate | Corning | 351143 | |
microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
24-well plate | Corning | 351147 | |
disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |