Abstract
שיטת התבוננות וכימות התנהגות החיזור של נמטודות עץ האורן, xylophilus Bursaphelenchus, הוקמה תחת סטראו. כדי לשפר את היעילות של ההזדווגות ב Xylophilus וכדי להגדיל את הסיכוי של התבוננות הזדווגות, מבוגרי בתולה היו בתרבית והשתמשו לחקירה. ביצים התקבלו על ידי שמירה על נמטודות במים המאפשרים הנקבות להטיל ביצים במשך 10 דקות. לנערים השלב השני (J2) סונכרנו ידי דוגרים על הביצים למשך 24 שעות ב 25 ° C בחושך, ואת מוקדם J4 התקבלו על ידי culturing J2 עם עובש אפור, בוטריטיס, עבור 52 אחר h. בנקודה זו בזמן, רוב נמטודות J4 יכול להבחין בבירור כמו להיות זכר או נקבה באמצעות מורפולוגיה גניטלי שלהם. הזכר והנקבה J4 נאספו ותרבותי בנפרד בשתי מנות שונות פטרי במשך 24 שעות כדי לקבל נמטודות מבוגר בתולה. גבר בתול ונקבה בתולה היו לזווג בטיפת וואטאה בבאר של שקופית קעורה. התנהגות החיזור שצולמה באמצעות מצלמת וידאו תחת סטראו. התקופה כולה של תהליך ההזדווגות היה 82.8 ± 3.91 דקות (ממוצע SE ±) ויכול להיות מחולק ל 4 שלבים שונים: חיפושים, פנייה, מזדווגים, ומשתהה. הפרוטוקולים הממוצעים של משך היו 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 ו -7.2 ± 0.5, בהתאמה. תת התנהגויות Eleven תוארו: שיוט, מתקרב, נתקלים, נגיעה, הופ דאנס, איתור, מצרף, לפלוט זרע, להפרדה, קפאון, נדידה. מעניין לציין, כי תחרות תוך-מינית ברורה נצפתה כאשר ונקבה אחת הייתה מקובצים עם 3 זכרים או זכר אחד עם 3 נקבות. פרוטוקול זה שימושי ובעל ערך, לא רק חוקר את התנהגות החיזור של xylophilus ב ', אלא גם מתנהג כמו הפניה ללימודים האתולוגי של נמטודות אחרות.
Protocol
1. רכישת נמטודות למבוגרים בתולים
- לבודד נמטודות פיינווד ותנאי תרבות
הערה: ב xylophilus לבודד Nxy61 הופק במקור מתוך massoniana Pinus חולה באזור Ningbo במחוז Zhejiang בסין.- הכן תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA, ראו טבלה של חומרים) צלחות לגידול בוטריטיס.
- לקבלת חיסון, אגרוף פיסת מחצלת פטרייתי עם קוטר של 10 מ"מ מן מחצלת cinerea ב והכניס אותו באמצע צלחת מחשב כף יד חדש. תרבות cinerea B. במשך 5 ד 25 מעלות צלזיוס בחושך.
- תרבות נמטודות עץ האורן בצלחת פטרי המוכנה המכילה cinerea ב 25 מעלות צלזיוס בחושך.
- רכישה ב xylophilus ביצים
- מניח צינור גומי מהדק מתחת משפך והחזק את המשפך המוכן במעמד להרכיב אתמנגנון משפך Baermann. מניחים שתי שכבות של נייר סינון במקום גזה בפה של המשפך.
- מעביר את התרבויות פטרייתי להגדרות המשפך ומוסיף מים עד מחצלת פטרייתי היא שקועה. חכה 2 h, נמטודות ייצאה המתרבות פטרייתי, לחצות את נייר הסינון, ולהשתקע בחלק הנמוך ביותר של משפך Baermann.
- אסוף את הזוג הראשון של טיפות מים מתחתית הצינור לתוך צינור 15 מ"ל ולאסוף נמטודות על ידי שחרור מהדק לאט על הצינור.
- צנטריפוגה האוספים מעל 3,000 XG במשך 2 דקות ב RT.
- הסר את השכבה העליונה של מים עם טפטפת resuspend אותו עם 1 מ"ל של (dd) מזוקקים פעמיים סטרילי H 2 O.
- עם טפטפת, להעביר את resuspension מעל לצלחת חדש זכוכית פטרי (6 ס"מ קוטר). הוסף 3 מ"ל של dd סטרילי H 2 O כדי בצלחת פטרי כדי להבטיח כי נמטודות מסוגלים לשחות בחופשיות.
- שמור את נמטודות של גלאסזה צלחת פטרי במשך 10 דקות ב 25 ° C בחושך. ביצים תונח על ידי נשים בהריון. בגלל משטח גליקופרוטאין שלהם, הביצים ידבק לתחתית צלחת זכוכית פטרי.
- הסר את המים ותולעים בזהירות, מבלי להפריע את הביצים. הוסף 3 מ"ל של dd סטרילי H 2 O כדי בצלחת זכוכית פטרי מיד כדי למנוע את הביצים מהתייבשות.
- חזור על שלב 1.2.8 3x להסיר את כל הזחלים ומבוגרים, ולקבל את הביצים הטהורות. הוסף 2 מ"ל תוספת (5 מ"ל בסך הכל) של H dd סטרילי 2 O כדי בצלחת פטרי.
- רכישת הקטינים הרביעי שלבית (זחלי J4)
- האץ את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך ב 25 ° C כדי להשיג זחלי J2.
- מעבירים את הזחלים J2 עם טפטפת לתוך צינור 15 מ"ל, צנטריפוגות ב 3,000 XG למשך 2 דקות, ולהסיר את שכבת המים העליונה.
- Resuspend הזחלים J2 עם 200 μL של dd סטרילי H 2 O, ולאחר מכן להעביר אותםצלחת PDA המכילה cinerea ב.
- תרבות זחלי J2 עבור 52 שעות ב 25 ° C בחושך. בנקודה זו בזמן, רוב זחלי J2 יהיו התפתחו בשלב המוקדם של זחלי J4.
- רכישת נמטודות מבוגרת בתולה
- הכין מחט עבור להרים נמטודות על ידי ציור זכוכית נימים לאחר חימום זה מעל מבער אלכוהול.
הערה: קצה מחט נימים זה בדרך כלל צריך להיות 50 מיקרומטר קוטר, בערך רוחב הגוף של נמטודות מבוגרת, כך שהוא יכול לשמש ככלי להרים נמטודות יחיד. - להרכיב משפך Baermann ולחלץ נמטודות מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבים 1.2.1 - 1.2.3.
- מעביר את J4 עם מים לתוך צלחת פטרי נקיה.
- שים את נמטודות תחת סטראו ולהבחין בין זכרים ונקבות ידי המורפולוגיה של איברי המין, כפי שתואר על ידי ממיה ו Kiyohara 8 (איור 1 הערה: יש יותר נשים מאשר גברים, עם אחוז נקבות ב 60 - 70%. הפות הנשית היא ללא ספק שונה spicule זכר. בהשוואה המבוגרת, spicule או הפות ב J4 בשלב מוקדם הוא קטן יותר, אבל הם עדיין ניתן לראות בקלות ומכובדת. נמטודות תמיד נעות בתוך המים, שלפעמים מגביר את הקושי להבחין זכרים ונקבות.
- תרבות זחלי J4 במשך 24 שעות אחרות במהירות של 25 ° C בחושך.
הערה: כל נמטודות צריך להתפתח מבוגרים, אבל מאז הם בךזוג, הם נחשבים כמבוגרים בתולה. - להרכיב שני Baermann משפכים ולחלץ מבוגרי הבתולה מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבי 1.2.1 - 1.2.3, ולהעביר את הזכרים בוגרים בתולה ונקבות לשתי מנות נפרדות, נקיות פטרי.
תצפית 2. הקלטת וידאו של התנהגות חיזור
- הכן כמה שקופיות קעורות ולהוסיף 200 μL של H dd סטרילי 2 O לכל אחד הבארות שלהם.
- תרים את זכר בוגר בתולה המוכן או ונקבה עם מחט נימים ולשים רק נמטודות אחד לתוך המים של כל שקופית קעורה.
- שמור על מבוגרי הבתולה בתוך הבאר 1 h לתת להם להסתגל לסביבה מהימית החדשה.
- זוג זכר ונקבה בתולה ידי העברת אחד מהם מאחד היטב למשנהו בעזרת פיפטה.
- שים את התנהגות החיזור של שילוב 1♀ + 1♂ בשקופית הקעורה תחת סטראו.
- כדי לנתח את יעילות ההזדווגות של מבוגרי בתולה, לחשב את שיעור הצלחת ההזדווגות שלהם (R) ולהשוות אותו עם זה של זוגות מבוגרים שנבחרו באופן אקראי. חישוב R כאחוז משכפל שבו הזדווגות נצפתה בהשוואה למספר הכולל של משכפל למד.
- על מנת לאסוף נתונים לניתוח איכותי וכמותי, לצלם את התנהגות החיזור באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בדרך כלל, תהליך ההזדווגות כולו, מהרגע כאשר נמטודות ממוקמים הבאר של השקופית הקעורה אל הרגע שבו הם מתרחקים לאחר הזדווגות, יושלם בתוך 2 שעות. לכן, להקליט את תהליך ההזדווגות ברציפות במשך לפחות 2 שעות כפי לשכפל אחד. שלם לפחות 30 משכפל בסך הכל לכל צירוף.
הערה: הוסף dd סטרילי יותר H 2 O (בדרך כלל 50 μL) כל 0.5 שעות אל הבאר כדי לפצות על אידוי במהלך תהליך הצריבה.
3. איסוף נתונים
- הצג את כל הסרטונים בקפידה על מסך מחשב ולאפיין את ההתנהגויות תת איכותי.
- מדוד את המשך באמצעות הזדווגות המסגרת לפי מסגרת דואר פונקציה של מקליט וידאו. ידני להפחית את הזמן החל לנקודת הסיום.
- עבור שילוב 1♀ + 1♂, לנתח כל הקלטת וידאו ולמדוד את משך אחד מהאירועים הבאים:
- מדדו את משך חיפוש (כלומר, הזמן וממתי הנשית והגברית מוכנסים היטב של השקופית קעורה אל הרגע הם נתקלים קשר אחד לשני).
- מדוד את משך פנייה (כלומר, הזמן מהמגע הראשון ועד לרגע שבו הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עבור ההזדווגות הראשונה).
- מדוד את משך מזדווגים (כלומר, זמן וממתי הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עד שהוא מחליק למטה מהגוף של הנקבה לאחר שפיכה). הערה: חלק נמטודות יכול להזדווג כמה פעמים ב 2 h. במקרים כאלה, למדוד את משך ההזדווגות מן ההזדווגות הראשונה סוף last אחד, כולל הזמן שביניהם.
- מדדו את משך וקידוח (כלומר, בתקופה שלאחר ההזדווגות עד לשחות זכר ונקבה אחד מהשני והם מופרדים על ידי מרחק של יותר מאורך הגוף 'נמטודות (בדרך כלל 1 מ"מ)).
- ספירת תדירות ההזדווגות ומשך כל הזדווגות ומשך חיים ממוצע של כל הזדווגויות ב 2 h עבור כל אחד מהשילובים שונים (כלומר, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, ו 1♀ + 3♂).
- חשב את שיעור ההצלחה ההזדווגות של איש הקשר הראשון (P) עבור שילובים שונים כמו שיעור ההצלחה של הזדווגות לאחר המגע הראשון, אשר מתבצע באופן מיידי וללא כל הפסקה. בשלב הפנייה, אנשי קשר כמה עלולים להיות שנצפו לפני ההזדווגות בפועל.
- כאשר המרחק בין שני אנשים הוא יותר מאורך הגוף, שקול קשר אחד ייגמר. ראשית לשכפל, להקליט P 100% כשאני הזדווגותהים נצפה מייד לאחר המגע הראשון, ללא הפסקה, או 0.00% אם לא הזדווגות נצפתה או אם יש הזדווגות אבל אחרי שניים או יותר אנשי קשר.
הערה: היו 30 משכפל עבור כל שילוב המתואר כאן.
- כאשר המרחק בין שני אנשים הוא יותר מאורך הגוף, שקול קשר אחד ייגמר. ראשית לשכפל, להקליט P 100% כשאני הזדווגותהים נצפה מייד לאחר המגע הראשון, ללא הפסקה, או 0.00% אם לא הזדווגות נצפתה או אם יש הזדווגות אבל אחרי שניים או יותר אנשי קשר.
- הכין מחט עבור להרים נמטודות על ידי ציור זכוכית נימים לאחר חימום זה מעל מבער אלכוהול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיעור ההצלחה ההזדווגות (R) של מבוגרים בתולה היה 86.67% בממוצע, שהיה גבוה משמעותית מזה של המבוגרים שנבחרו באקראי: 13.33 ± 4.65% (F = 1301.71, df = 1, P = 0.0001) (איור 2). ממצא זה מצביע על כך שהוא קל יותר לבחון את התנהגות החיזור של B. xylophilus עם מבוגרים בתולה מאשר עם מבוגרים שנבחרו באופן אקראי.
כאשר חולה אחד זכה זיווג עם נקבה אחת, תהליך ההזדווגות כולו נמשך 82.8 דקות בממוצע. התהליך כולו יכול להיות מתואר על ידי ארבעה שלבים שונים: חיפוש, פנייה, מזדווגים, ומשתהה. המשך עבור ארבעת השלבים הללו היו 21.8 ± 2.0 דקות, 28.0 ± 1.9 דקות, 25.8 ± 0.7 דקות, ו -7.2 ± 0.5 דקות, בהתאמה (איור 3). בפרסום אחרון תארנו 11-ההתנהגויות תת כמו שיוט, מתקרבים, encountering, נוגע ללב, הופ דאנס, איתור, מצרף, לפלוט זרע, להפרדה, קפאון, נדידה 9.
כאשר זכר אחד פגש שתיים או יותר נקבות בו זמנית, הזכר נראה להזדווג באופן אקראי עם אחד מהם, ללא כל בחירה. עם זאת, בחירת הזדווגות ברורה נצפתה xylophilus ב נקבה. כאשר נקבו קשר זכר, הנקבה נטתה לגעת בראשו של הזכר, גוף, זנב, ובאזור איברי המין בעדינות כשראשה ועשתה כאילו שאני הערכת השותף הפוטנציאלי שלה. אם הנקבה לא קבלה את הזכר, הנקבה עזבה אותו במהירות ושח זכר אחר עבור ההערכה הבאה. אחד הזכרים נבחר ואז על ידי הנקבה לזיווג. זיווג הצלחה שיעורי לאחר המגע הראשון (P) של 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, ו 1♀ + 3♂ שילובים היו 46.7 ± 9.3%, 80.0 ± 7.4%, ו -23.4 ± 7.4%, בהתאמה, ואת ההבדלים ביניהם werדואר משמעותי (F = 8.21, df = 2, P = 0.0124) (איור 4).
תחרות Intrasexual נצפתה בשני זכרים ונקבות. כאשר נקבת בתולה אחת עורבבה עם 3 זכרי בתולה, הזכרים ניסו להתקרב וליצור קשר עם הנקבה ככל האפשר כדי לקבל את הסיכוי של הזדווגות איתה. כאשר הפות נכבשה על ידי זכר אחד, הזכרים האחרים ניסו להפריע זכר ההזדווגות באמצעות נדנדות גוף אלימות או הגרירה להפריד ביניהם. תחרות intrasexual נקבה נתפסה להיות פחות או יותר דומה לתחרות intrasexual זכר.
הצלחה זיווג היתה תלויה בעיקר הנקבה. כאשר נקבה קבלה זכר, הזכר נע לאט יותר מסולסל או אפילו יצר חישוק, והנקבה התקדמה באופן פעיל כדי להקל על הזכר לאתר הערווה וכדי למנוע הפרעה מצד זכרים אחרים. אם נקבה לא קיבל זכר,הנקבה ניסתה להתנער ממנו, גם אם הזכר היה רכוב ממקם את עצמו לצד ערוותה. בגלל התחרות intrasexual, תדרים הזדווגות של 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, ו 1♀ + 3♂ שילובים היו 1.43 ± 0.091, 1.17 ± 0.074 ו 1.83 ± 0.074, בהתאמה, ואת ההבדלים ביניהם היו משמעותי (F = 14.50, df = 2, P = 0.0001) (איור 5).
בחקירתו שלנו, משך ההזדווגות מגוון מאוד, עם מינימום של 20 שניות ועד למקסימום של 42 דק '. על פי הנתונים שלנו, משך ההזדווגות יכול להיות מובחן ברור לשתי קבוצות: הזדווגות לטווח קצר, שנמשך פחות מ -5 דקות, ומשגלים לטווח ארוך, שנמשך יותר מ 10 דקות. הבדלים ברורים נצפו בין הקבוצות השונות עבור מח"מ הזדווגות לטווח קצר (F = 3.81, df = 2, P (F = 179.52, df = 2, P = 0.0001), וכל הזדווגויות (F = 2.93, df = 2, P = 0.0367) (איור 6).
איור 1: איברי מין של זכר ונקבה ב Xylophilus. (א) spicule של גברים (חץ כחול). (ב) פות של נקבה (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: זיווג אחוז ההצלחה של זוגות מבוגרי בתולה וזוגות מבוגרים שנבחרו באופן אקראי של xylophilus ב. הערכים הממוצעים מחושבים הם מ 30 חזרות. מופע הקו האנכיזה סטיית התקן. האותיות הקטנות השונות מעידות על הבדלים משמעותיים ב- P <0.05 בהשוואה ידי המבחן של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: משך 4 השלבים בתהליך ההזדווגות של B. xylophilus. הערכים הממוצעים מחושבים הם מ 30 חזרות. הבר אנכי מציג את סטיית התקן. האותיות הקטנות השונות מעידות על הבדלים משמעותיים ב- P <0.05 בהשוואה ידי המבחן של Tukey. מח"מ של השלב המזדווג הוא 25.80 ± 0.71 דקות, המהווה 31.17% של תהליך ההזדווגות כולו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של תאנה זויור.
איור 4: זיווג הצלחה עבור לתקשר קודם ב xylophilus. הערכים הממוצעים מחושבים הם בין 30 משכפל ± SE. אמצעי עם אותה האות קטנה בתוך כל עמודה אינו שונה באופן מהותי ב- P <0.05 בהשוואה ידי מבחן ההבדל משמעותי הישר של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תדר הזדווגות של B. xylophilus בקבוצות שונות. הערכים הממוצעים מחושבים הם בין 30 משכפל ± SE. אמצעי עם אותה האות הקטנה אינם שונים באופן מהותי ב- P <0.05 כאשר compared ידי מבחן ההבדל משמעותי הישר של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: משך הזדווגות של B. xylophilus. אמצעי עם אותה האות קטנה בתוך כל קבוצה של עמודות אינם שונה באופן משמעותי ב- P <0.05 בהשוואה ידי מבחן ההבדל משמעותי הישר של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקות התנהגות הן היבט בסיסי של אקולוגיה כימית, נוירוביולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה. נמטודות, ובמיוחד סי אלגנס, נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים בתחומים אלה. התנהגות החיזור של C. elegans נחקרה בעבר 10-11. עם זאת, ב xylophilus הוא gonochoristic ושונה אלגנס hermaphroditic, ותהליך החיזור שלה יש תכונות התנהגותיות שונות 9. לאחרונה, התנהגות החיזור של Bursaphelenchus okinawaensis, מין אחות hermaphroditic של xylophilus ב ', נמסרה 12. למרות שיטות ניסיוניות שונות שמשו, מיני hermaphroditic זה הראה משיכת מין דומה ב xylophilus, ומשיכה בין המינים ביניהם נצפתה. מיני אחות hermaphroditic זה עשויים לשמש כמודל לנהל חקירה נוספת על הביולוגיה של Bursaphelenchus.
פרוטוקול זה מספק קו מנחה כיצד להתבונן ולחקור את תכונות התנהגותיות של B. xylophilus בעת ההזדווגות. הממצאים שלנו הראו ששימוש נמטודות מבוגר בתולה הוא קריטי להגדלת הסיכוי לצפות בתהליך ההזדווגות בהצלחה (איור 1). קבלת J4 זחלים והבחנת המינים שלהם בדיוק הם שני שלבים בסיסיים חשובים לרכישת מבוגרי בתולה. תחת תנאי הניסוי שלנו (כלומר, ב 25 ° C בחושך), התקופה של 52 שעות זה הזמן הנכון כדי לקבל J4 הזחלים J2. עם זאת, תוך הבחנה סקס בשלב מוקדם J4 בעיקר תלוי ניסיון אישי. כדי להגיע לרמת דיוק, יש צורך עבור אנשים שונים לשוב ולבדוק הקצאת המין.
המאפיינים ההתנהגותיים של B. xylophilus במהלך תהליך ההזדווגות ניתן לתאר באופן איכותי ונותחו כמותית על ידי הקלטת המשכים מהארבעה שונהשלבי אף אוזן גרון, אחוז ההצלחה ההזדווגות לאחר המגע הראשון, תדירות ההזדווגות, ואת משך ההזדווגות של שילובים שונים. מעניין לציין, כי בפעם הראשונה, צפינו בחירת הזדווגות ידי נקבות ותחרות פן-מינית חזקה בשני זכרים ונקבות. אין הפקרות נצפתה; עם זאת, זה יכול להיות בגלל המספר המוגבל של נמטודות בשימוש חקירתנו. פרוטוקול זה לא יכול לשמש רק על חקירת התנהגות החיזור של B. xylophilus, אבל זה גם יכול להיות שימושי ובעל ערך כהפנית נמטודות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Zhu ו Liqun Bai תרמו באופן שווה על עבודה זו. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הקרן המיוחדת עבור יערנות מחקר מדעי ברווחת הציבור (201204501) ואת הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (31170604, 31270688, ו 31,570,638). אנו מודים לד"ר Holighaus חריט וד"ר דניאל Hickford עבור הצעות מועילות שלהם על הכתיבה באנגלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
