Observasjon og Kvantifisering av Mating Behavior i Pinewood nematode, Published: December 25, 2016 doi: 10.3791/54842

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Najie Zhu*¹, Liqun Bai*¹, Stefan Schütz², Baojun Liu³, Zhenyu Liu³, Xingyao Zhang⁴, Hongshi Yu¹, Jiafu Hu^1,5

¹Department of Forest Protection, Zhejiang Agricultural & Forestry University, ²Institute of Forest Zoology and Forest Conservation, Georg-August University Göttingen, ³College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, ⁴Institute of Forest Protection, Chinese Academy of Forestry, ⁵Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University

* These authors contributed equally

Abstract

En metode for å observere og kvantifisere parring oppførselen til furu nematode, Bursaphelenchus xylophilus, ble etablert under et stereomikroskop. For å forbedre parring effektivisere B. xylophilus og for å øke sjansene for parring observasjon, jomfruelige voksne ble dyrket og brukt til etterforskningen. Egg ble oppnådd ved å holde nematoder i vann og la hunnene å legge egg i 10 min. I det annet trinn unger (J2) ble synkronisert ved inkubering av eggene i 24 timer ved 25 ° C i mørke, og den tidlige J4 ble erholdt ved dyrking av den J2 med grå mugg, Botrytis cinerea, for en annen 52 timer. På dette tidspunktet, kan de fleste J4 nematoder være tydelig atskilt som å være mann eller kvinne ved hjelp av sine genital morfologi. Den mannlige og kvinnelige J4 ble samlet og dyrket separat i to forskjellige petriskåler i 24 timer for å få jomfruelige voksne nematoder. En jomfru mannlig og en jomfru kvinnelig var forbundet i en dråpe water i brønnen av en konkav lysbilde. Parings atferd ble filmet med en videoopptaker under et stereomikroskop. Hele perioden av paringsprosessen var 82,8 ± 3,91 min (gjennomsnitt ± SE) og kan deles inn i 4 forskjellige faser: søking, kontakter, copulating, og dvelende. De midlere minuttene av varighet var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 og 7,2 ± 0,5, respektivt. Elleve under atferd ble beskrevet: cruising, nærmer seg, møter, rørende, hooping, lokalisering, feste, ejaculating, separering, quiescence, og roaming. Interessant nok ble observert åpenbart intra-seksuell konkurranse når en kvinne ble gruppert med 3 menn eller en mann med 3 tisper. Denne protokollen er nyttig og verdifull, ikke bare i å undersøke parring oppførselen til B. xylophilus, men også i å opptre som en referanse for etologiske studier av andre nematoder.

Protocol

1. Kjøp av Virgin Voksen nematoder

1. Pinewood nematode isolat og dyrkningsforhold
   MERK: B. xylophilus isolere Nxy61 ble opprinnelig hentet fra en syk Pinus massoniana i Ningbo området i Zhejiang-provinsen i Kina.
   1. Forbered potetdekstroseagar (PDA, se tabell for material) plater for voksende Botrytis cinerea.
   2. For inokulasjon, punch et stykke sopp matte med diameter på 10 mm fra en B. cinerea matte og sette den i midten av en ny PDA plate. Kultur B. cinerea for 5 d ved 25 ° C i mørket.
   3. Kultur Pinewood nematoder i den klargjorte petriskål som inneholder B. cinerea ved 25 ° C i mørket.
2. Oppkjøp av B. xylophilus egg
   1. Plasser en fastklemt gummi slange under en trakt og hold forberedt trakten i et stativ for å montereBaermann trakt apparat. Plassere to lag av filterpapir i stedet for gasbind i munningen av trakten.
   2. Overfør soppkulturer til trakten oppsett og tilsett vann til sopp matten er nedsenket. Vent 2 h, og nematoder vil komme ut fra soppkultur, krysser filterpapiret, og slå seg ned i den nederste delen av Baermann trakt.
   3. Samle de første par dråper vann fra bunnen av røret inn i et 15 ml rør og samle nematoder ved langsomt å frigjøre klemmen på røret.
   4. Sentrifuger de ovennevnte samlinger ved 3000 x g i 2 minutter ved RT.
   5. Fjerne det øvre lag av vann med en pipette og resuspender den med 1 ml sterilt dobbelt-destillert (dd) H ₂ O.
   6. Med en pipette, overføre ovenfor resuspensjon til et nytt glass petriskål (6 cm diameter). Tilsett 3 ml sterilt dd H ₂ O til petriskål for å sikre at nematoder er i stand til å svømme fritt.
   7. Hold nematoder i glass petriskål i 10 minutter ved 25 ° C i mørket. Eggene legges av gravide kvinner. På grunn av deres glykoprotein flaten, vil eggene feste seg til bunnen av glasset petriskål.
   8. Fjerne vannet og ormer nøye, uten å forstyrre eggene. Tilsett 3 ml sterilt dd H ₂ O til glasset petriskål umiddelbart for å hindre at eggene tørker ut.
   9. Gjenta trinn 1.2.8 3x for å fjerne alle larver og voksne, og få de rene egg. Legg en ekstra 2 ml (5 ml totalt) sterilt dd H ₂ O til petriskål.
3. Oppkjøp av fjerde-trinns yngel (J4 larver)
   1. Hatch de oppsamlede egg til 24 timer i mørke ved 25 ° C for å oppnå J2 larver.
   2. Overfør J2 larver med en pipette til en 15 ml rør, sentrifuger ved 3000 xg i 2 minutter, og fjerne det øvre lag av vann.
   3. Resuspender J2 larver med 200 pi sterilt dd H ₂ O, og deretter overføre dem tilPDA plate som inneholder B. cinerea.
   4. Kultur den J2 larvene i 52 timer ved 25 ° C i mørket. På dette tidspunkt vil de fleste J2 larver har utviklet seg til et tidlig stadium av J4 larver.
4. Oppkjøp av jomfruelige voksne nematoder
   1. Forbered en nål for å plukke opp nematoder ved å tegne et glass kapillær etter oppvarming det over en alkohol-brenner.
      MERK: spissen av denne kapillær nål vanligvis må være 50 pm i diameter, omtrent legemet bredden på en voksen nematode, slik at den kan brukes som et verktøy for å plukke opp en enkelt nematode.
   2. Monter en Baermann trakt og trekke nematoder fra soppkulturer i 2 h, som beskrevet i trinn 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Overfør J4 med vann i en ren petriskål.
   4. Observer nematoder under et stereomikroskop og skille mellom menn og kvinner med genital morfologi, som beskrevet av Mamiya og Kiyohara ⁸ (figur 1 MERK: Det er flere kvinner enn menn, med kvinneandelen på 60 - 70%. Den kvinnelige vulva er åpenbart forskjellig fra den mannlige spicule. Sammenlignet med den voksne, den spicule eller vulva i tidlig stadium J4 er mindre, men de kan likevel være lett sett og skilles. Nematode er alltid beveger seg i vannet, noe som ofte øker vanskeligheten med å skille hanner og hunner.
   5. Kultur på J4 larver i ytterligere 24 timer ved 25 ° C i mørket.
      MERK: Alle nematoder bør utvikle seg til voksne, men siden de er uinnstukne, blir de betraktet som jomfruelige voksne.
   6. Monter to Baermann traktene og pakke ut jomfrue voksne fra soppkulturer i 2 h, som beskrevet i trinn 1.2.1 - 1.2.3, og overføre de jomfruelige voksne menn og kvinner i to separate, rene petriskåler.

   2. Observasjon og videoopptak av Mating Behavior

   1. Forbered flere konkave lysbilder og legge 200 mL sterilt dd H ₂ O til hver av sine brønner.
   2. Plukk opp forberedt jomfru voksen mann eller og kvinne med en kapillær nål og sette bare en nematode i vannet av hver konkav lysbilde.
   3. Hold jomfrue voksne inne brønnen i 1 time for å la dem tilpasse seg den nye vannmiljøet.
   4. Par en jomfru mann og kvinne ved å overføre en av dem fra en brønn til en annen ved hjelp av en pipette.
   5. Observer parring oppførselen til 1♀ + 1♂ kombinasjon i den konkave skyve under et stereomikroskop.
   6. Å analysere parring effektiviteten av jomfruelige voksne, beregne deres parring suksessrate (R) og sammenligne det med at av tilfeldig utvalgte voksne par. Beregn R som prosent av replikater hvori kopulasjon ble observert sammenlignet med det totale antall replikater studert.
   7. For å samle inn data for kvalitativ og kvantitativ analyse, filme paringsatferd ved hjelp av videomikroskopi. Normalt er hele parring prosessen, fra det tidspunkt da nematodene er plassert i brønnen i den konkave side i det øyeblikk når de beveger seg bort etter parringen, fullført i løpet av 2 timer. Derfor registrerer paring prosessen kontinuerlig i minst 2 timer som en replikere. Fullstendig minst 30 replikerer i totalt for hver kombinasjon.
      MERK: Legg mer sterilt dd H ₂ O (vanligvis 50 mL) hver 0,5 timer til brønnen for å kompensere for fordampning under innspillingsprosessen.

   3. Datainnsamling

   1. Se alle videoer nøye på en dataskjerm og karakterunder atferd kvalitativt.
   2. Måle varigheten av parring ved hjelp the frame-by-frame funksjon av videoopptakeren. subtrahere starttiden fra endepunktet manuelt.
   3. For 1♀ + 1♂ kombinasjon, analysere hver videoopptak og måle varigheten av følgende hendelser:
      1. Mål varighet søker (dvs. tiden fra det kvinnelige og mannlige innføres i brønnen av den konkave side i øyeblikket de møter og kontakt med hverandre).
      2. Mål varigheten av kontakter (dvs. tiden fra første kontakt til det øyeblikket da den mannlige er nøyaktig plassert på kvinnens vulva for første copulation).
      3. Mål varighet copulating (dvs. tiden fra den mannlige er nøyaktig plassert på kvinnens vulva før han glir ned fra den kvinnelige kropp etter utløsning). Merk: Noen nematoder kan parre seg flere ganger i 2 timer. I slike tilfeller måle varigheten av parringen fra den første parringen til slutten av last ett, inkludert tiden i mellom.
      4. Måle varigheten av langvarig (dvs. perioden etter parringen inntil den mannlige og kvinnelige svømme bort fra hverandre og er adskilt med en avstand på mer enn nematodene kroppslengde (vanligvis 1 mm)).
   4. Tell copulation hyppighet og varighet av hver copulation og gjennomsnittlig varighet av alle copulations i 2 timer for hver av de ulike kombinasjoner (dvs. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, og 1♀ + 3♂).
   5. Beregn parring suksessraten for den første kontakten (P) for de ulike kombinasjonene som suksessraten for parring etter den første kontakten, som er gjennomført umiddelbart og uten pause. I kontakt fasen, kanskje flere kontakter observeres før selve parringen.
      1. Når avstanden mellom to individer er mer enn kroppslengden, bør du vurdere en kontakt for å være over. For en replikere, posten P som 100% når parringen jegs observert umiddelbart etter den første kontakt, uten brudd, eller 0,00% hvis ikke kopulasjon ble observert, eller hvis det ikke var parringen, men etter to eller flere kontakter.
         MERK: Det var 30 replikater for hver kombinasjon beskrevet her.

Representative Results

Paringssuksessrate (R) av jomfruelige voksne var 86,67% i gjennomsnitt, som var betydelig høyere enn for de tilfeldig utvalgte voksne: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (figur 2). Dette funnet tyder på at det er lettere å observere paring atferden til B. xylophilus med jomfruelige voksne enn med tilfeldig utvalgte voksne.

Når en mann ble sammen med en kvinne, hele paring prosessen varte 82,8 minutter i gjennomsnitt. Hele prosessen kan beskrives ved fire ulike faser: søker, kontakter, copulating, og dvelende. Varigheten for disse fire faser var 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min, og 7,2 ± 0,5 min, henholdsvis (figur 3). I en fersk publikasjon, beskrev vi de 11 under atferd som cruising, nærmer seg, encountering, rørende, hooping, lokalisering, feste, ejaculating, separering, quiescence, og roaming ^9.

Når en mann møtte to eller flere hunner samtidig, den mannlige virket å pare seg tilfeldig med en av dem, uten noen valg. Men åpenbart parring valget ble observert for kvinnelige B. xylophilus. Når en kvinne kontaktet en mann, den kvinnelige tendens til å ta på hannens hode, kropp, hale, og genital regionen forsiktig med hodet og syntes å være å vurdere sin potensielle partner. Hvis den kvinnelige ikke godtok den mannlige, den kvinnelige forlot ham raskt og svømte til en annen mann for neste evaluering. Ett av hannene ble så valgt av den kvinnelige for parring. Parring suksess priser etter den første kontakten (P) av 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, og 1♀ + 3♂ kombinasjoner var 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, og 23,4 ± 7,4%, henholdsvis og forskjellene mellom dem were signifikant (F = 8,21, df = 2, P = 0,0124) (figur 4).

ble observert Intrasexual konkurranse i både menn og kvinner. Når en jomfru kvinnelig ble blandet med 3 jomfruelige menn, menn forsøkte å nærme seg og ta kontakt med den kvinnelige så mye som mulig for å få sjansen til å parre med henne. Når vulva ble okkupert av en mann, de andre hanner prøvde å forstyrre parring male ved hjelp av voldelige kroppen svinger eller drar for å skille dem. Kvinne intrasexual konkurransen ble sett på som mer eller mindre lik mannlig intrasexual konkurranse.

Parring suksess hovedsakelig avhengig av hunnen. Når en kvinnelig akseptert en mannlig, den mannlige flyttet saktere og krøllet eller dannet en bøyle, og den kvinnelige flyttet frem aktivt for å gjøre det lettere for den mannlige å finne henne vulva og for å unngå forstyrrelser fra andre hanner. Hvis en kvinne ikke godtok en mannlig,den kvinnelige prøvde å riste ham av, selv om den mannlige hadde montert og plassert seg ved hennes vulva. På grunn av den intrasexual konkurranse, kopulasjon frekvenser av den 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, og 1♀ + 3♂ kombinasjoner var 1,43 ± 0,091 1,17 ± 0,074 og 1,83 ± 0,074, henholdsvis, og forskjellene mellom dem var signifikant (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (figur 5).

I vår undersøkelse, den copulation varighet varierte sterkt, med et minimum av 20 s og maksimum 42 min. Ifølge våre data, kan varigheten av copulation bli åpenbart differensiert i to grupper: kortsiktig copulations, som varte i mindre enn fem minutter, og langsiktige copulations, som varte lenger enn 10 min. Det ble ikke observert tydelige forskjeller mellom de ulike gruppene for den gjennomsnittlige varigheten av kortsiktig copulation (F = 3,81, df = 2, P (F = 179,52, df = 2, p = 0,0001), og alle copulations (F = 2,93, df = 2, p = 0,0367) (figur 6).

Figur 1: Genitalia av mannlige og kvinnelige B. xylophilus. (A) spicule av menn (blå pil). (B) vulva av kvinner (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Mating suksessraten av Virgin voksne par og tilfeldig utvalgte voksne par av B. xylophilus. De beregnede gjennomsnittsverdier er fra 30 replikater. Den vertikale linjen visers standard feil. De ulike små bokstaver indikerer signifikante forskjeller på p <0,05 sammenlignet med Tukey test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Varighet av de 4 Faser i Mating Process of B. xylophilus. De beregnede gjennomsnittsverdier er fra 30 replikater. Den vertikale linjen viser standardfeil. De ulike små bokstaver indikerer signifikante forskjeller på p <0,05 sammenlignet med Tukey test. Den gjennomsnittlige varigheten av hyrdestund fasen er 25,80 ± 0,71 min, som er 31,17% av hele paringsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette fikenure.

Figur 4: Mating suksess for den første kontakten med B. xylophilus. De beregnede gjennomsnittsverdier er fra 30 replikater ± SE. Betyr med samme liten bokstav i hver kolonne er ikke signifikant forskjellig på P <0,05 sammenlignet med Tukey sin Ærlig signifikant forskjell test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: copulation Frekvens av B. xylophilus i ulike grupper. De beregnede gjennomsnittsverdier er fra 30 replikater ± SE. Betyr med samme liten bokstav er ikke signifikant forskjellig på P <0.05 når kompared av Tukey sin Ærlig signifikant forskjell test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: copulation Varighet av B. xylophilus. Betyr med samme liten bokstav i hvert sett i kolonnene er ikke signifikant forskjellig på P <0,05 sammenlignet med Tukey sin Ærlig signifikant forskjell test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Atferdstester er en grunnleggende del av kjemisk økologi, nevrobiologi, molekylærbiologi og genetikk. Nematoder, og spesielt C. elegans, er mye brukt for studier i disse områdene. Den parring oppførselen til C. elegans har tidligere blitt ^10-11 undersøkt. Men B. xylophilus gonochoristic og forskjellig fra de tvekjønnet C. elegans og sin paring prosessen har forskjellige atferds funksjoner ^9. Nylig ble det parring oppførselen til Bursaphelenchus okinawaensis, en tvekjønnet søsterarter B. xylophilus, rapporterte ^12. Selv om ulike eksperimentelle metoder ble brukt, dette tvekjønnet arter viste lignende sex tiltrekning til B. xylophilus, og inter-arter tiltrekning mellom dem ble observert. Denne tvekjønnet søsterarter kan brukes som modell for å gjennomføre ytterligere undersøkelser på biologi Bursaphelenchus.

Denne protokollen gir en retningslinje om hvordan å observere og undersøke atferdsmessige trekk ved B. xylophilus under parring. Våre funn viste at bruk av jomfruelige voksne nematoder er avgjørende for å øke sjansen for å lykkes observere paring prosessen (figur 1). Innhenting J4 larver og presist skille deres kjønn er to viktige grunnleggende trinn for kjøp av jomfru voksne. Under våre forsøksbetingelser (dvs. ved 25 ° C i mørket), perioden på 52 timer er den riktige tid for å oppnå J4 J2 fra larver. Men skille sex på et tidlig J4 scenen meste avhenger av personlig erfaring. For å sikre nøyaktighet, er det nødvendig for forskjellige folk til å dobbeltsjekke sex tildeling.

De atferdsmessige trekk ved B. xylophilus under paring prosessen kan beskrives kvalitativt og analysert kvantitativt ved å registrere varigheten av fire forskjelligeskjellige faser, hvor mange prosent av parring suksess etter første kontakt, copulation frekvens, og den copulation varigheten av ulike kombinasjoner. Interessant, for første gang, observerte vi parring valg av hunner og sterke intra seksuell konkurranse i både menn og kvinner. Ingen promiskuitet ble observert; Men dette kan være på grunn av begrenset antall nematoder som brukes i vår undersøkelse. Denne protokollen kan ikke bare brukes til å undersøke den paring oppførselen til B. xylophilus, men det kan også være nyttig og verdifull som en referanse for andre nematoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolate Nxy61			Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China
Grey mold strain			Obtained from Forestry Academy of China
Baermann funnels	Sengong
falcon tubes	Sengong
centrifuge	Sengong
pipette	Sengong
sterile dd H2O			Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min.
Petri dishes	Sengong
PDA medium	Huankai Bio.	021050
incubator	Sengong
Laminar flow	Sengong
glass capillary	Sengong
Stereoscope	Leica	LED5000 RL
inverted stereo microscope	Zeiss	A1
concave slides	Sengong