Abstract
وهناك طريقة لمراقبة وقياس سلوك التزاوج من الديدان الخيطية خشب الصنوبر، Bursaphelenchus xylophilus، وقد تم تأسيسها تحت مجهر تشريحي. لتحسين كفاءة التزاوج باء Xylophilus وزيادة فرص الملاحظة التزاوج، كان الكبار البكر مثقف وتستخدم للتحقيق. وقد تم الحصول على البيض عن طريق الحفاظ على الديدان في الماء والسماح للإناث لوضع البيض لمدة 10 دقيقة. وقد تزامن الأحداث في المرحلة الثانية (J2) التي يحتضنها البيض لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام، والتي تم الحصول عليها في وقت مبكر J4 من زراعة وJ2 مع العفن الرمادي، السنجابية المعنقدة، لمدة 52 ساعة أخرى. عند هذه النقطة الزمن، يمكن أن معظم الديدان الخيطية J4 تمييزها بوضوح عن كونه ذكرا أو أنثى باستخدام التشكل التناسلية. تم جمع الذكور والإناث J4 ومثقف بشكل منفصل في اثنين من أطباق بتري مختلفة لمدة 24 ساعة للحصول على الديدان الخيطية الكبار البكر. تم إقران وذكر البكر وأنثى العذراء في قطرة من واتإيه في البئر شريحة مقعرة. وقد تم تصوير سلوك التزاوج مع جهاز تسجيل الفيديو تحت مجهر تشريحي. وكانت الفترة كلها من عملية التزاوج 82.8 ± 3.91 دقيقة (يعني ± SE) ويمكن تقسيمها إلى 4 مراحل مختلفة: البحث، والاتصال، جماع، والعالقة. وكانت الدقائق المتوسطة لمدة 21.8 ± 2.0، 28.0 ± 1.9، 25.8 ± 0.7 و 7.2 ± 0.5، على التوالي. وقد وصفت إحدى عشرة السلوكيات الفرعية: المبحرة، تقترب، ويواجه، لمس، التطويق، وتحديد مكان، ربط، والقذف، وفصل، هدوء، والتجوال. ومن المثير للاهتمام، وقد لوحظ المنافسة داخل جنسية واضحة عندما تم تجميعها أنثى واحدة مع 3 ذكور أو ذكر واحد مع 3 إناث. هذا البروتوكول هو مفيد وقيم، وليس فقط في التحقيق في سلوك التزاوج باء xylophilus، ولكن أيضا في العمل كمرجع للدراسات علم السلوك من الديدان الخيطية أخرى.
Protocol
1. اكتساب العذراء الديدان الخيطية الكبار
- غابة الصنوبر عزل النيماتودا والظروف والثقافة
ملاحظة: إن B. xylophilus عزل تم استخراج Nxy61 أصلا من massoniana صنوبر المريضة في منطقة نينغبو بمقاطعة تشجيانغ في الصين.- إعداد البطاطس سكر العنب آجار (PDA، انظر الجدول من المواد) لوحات لزراعة عفن رمادي.
- للتلقيح، لكمة قطعة من حصير الفطرية بقطر 10 مم من حصيرة ب السنجابية ووضعها في منتصف لوحة PDA جديدة. ثقافة السنجابية B. لمدة 5 د عند 25 درجة مئوية في الظلام.
- ثقافة النيماتودا غابة الصنوبر في طبق بتري استعداد تحتوي B. السنجابية عند 25 درجة مئوية في الظلام.
- اكتساب B. xylophilus البيض
- وضع أنبوب المطاط فرضت دون قمع وعقد قمع مستعد في رف لتجميعجهاز قمع بيرمان. وضع طبقتين من ورق الترشيح بدلا من الشاش في الفم من القمع.
- نقل الثقافات الفطرية لإعداد قمع ويضاف الماء حتى يتم مغمورة حصيرة الفطرية. الانتظار 2 ساعة، وسوف يخرج الديدان من ثقافة فطرية، عبر ورقة الترشيح، ويستقر في أدنى جزء من قمع بيرمان.
- جمع أول زوجين من قطرات من الماء من أسفل أنبوب في أنبوب 15 مل وجمع الديدان الخيطية عن طريق الإفراج عن ببطء المشبك على الأنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي المجموعات المذكورة أعلاه في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
- إزالة الطبقة العليا من المياه مع ماصة و resuspend مع 1 مل من معقم مزدوج المقطر (دد) H 2 O.
- مع ماصة، ونقل إعادة تعليق أعلاه إلى زجاج جديد طبق بتري (6 سم القطر). إضافة 3 مل من معقم د د H 2 O إلى طبق بيتري للتأكد من أن الديدان الخيطية هي قادرة على السباحة بحرية.
- حفاظ على الديدان الخيطية في الزجاجق طبق بيتري لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام. سيتم وضع البيض من قبل الإناث الحوامل. بسبب سطح بروتين سكري، وسوف البيض التمسك السفلي من الزجاج طبق بيتري.
- إزالة الماء والديدان بعناية، من دون إزعاج البيض. إضافة 3 مل من معقم د د H 2 O على الزجاج طبق بيتري على الفور لمنع البيض من الجفاف.
- كرر الخطوة 1.2.8 3X لإزالة جميع اليرقات والكبار، والحصول على البيض النقية. إضافة اضافي 2 مل (5 مل في المجموع) من المعقم د د H 2 O إلى طبق بيتري.
- الاستحواذ على الأحداث الرابعة من مرحلة (اليرقات J4)
- يفقس البيض التي تم جمعها لمدة 24 ساعة في الظلام عند 25 درجة مئوية للحصول على J2 اليرقات.
- نقل اليرقات J2 مع ماصة إلى 15 مل أنبوب، الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة الطبقة العليا من المياه.
- Resuspend واليرقات J2 مع 200 ميكرولتر من العقيمة د د H 2 O، ومن ثم نقلها إلىلوحة PDA يحتوي B. السنجابية.
- ثقافة اليرقات J2 لمدة 52 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام. عند هذه النقطة الزمن، وتطورت معظم اليرقات J2 في مرحلة مبكرة من J4 اليرقات.
- الحصول على الديدان الخيطية الكبار البكر
- إعداد إبرة لالتقاط الديدان الخيطية عن طريق رسم الزجاج الشعرية بعد تسخينه على موقد الكحول.
ملاحظة: غيض من هذه الإبرة الشعرية تحتاج عادة لتكون 50 ميكرون في القطر، ما يقرب من العرض الجسم من الديدان الخيطية الكبار، بحيث يمكن استخدامه كأداة لالتقاط الديدان الخيطية واحدة. - تجميع قمع بيرمان واستخراج الديدان الخيطية من الثقافات الفطرية لمدة 2 ساعة، كما هو موضح في الخطوات 1.2.1 - 1.2.3.
- نقل J4 مع الماء في طبق بيتري نظيفة.
- مراقبة الديدان الخيطية تحت مجهر تشريحي والتمييز بين الذكور والإناث من قبل التشكل الأعضاء التناسلية، كما وصفها ماميا وKiyohara 8 (الشكل 1 ملاحظة: هناك أكثر من الإناث أكثر من الذكور، مع نسبة الإناث في 60-70٪. الفرج الإناث مختلف كليا من الشوكة الذكور. بالمقارنة مع البالغين، والشوكة أو الفرج في مرحلة مبكرة J4 أصغر، لكنها ما زالت قائمة يمكن بسهولة رأيت وتميزا. الديدان الخيطية يتحرك دائما في الماء، مما يزيد في بعض الأحيان صعوبة في التمييز الذكور والإناث.
- ثقافة اليرقات J4 لمدة 24 ساعة أخرى في درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: يجب على جميع النيماتودا تتطور إلى البالغين، ولكن لأنها unmated، أنها تعتبر البالغين البكر. - تجميع اثنين بيرمان مداخل واستخراج البالغين البكر من الثقافات الفطرية لمدة 2 ساعة، كما هو موضح في الخطوات 1.2.1 - 1.2.3، ونقل الذكور البالغين البكر والإناث إلى قسمين، أطباق بتري نظيفة منفصلة.
2. رصد وتسجيل الفيديو من سلوك التزاوج
- إعداد عدة شرائح مقعرة وإضافة 200 ميكرولتر من العقيمة د د H 2 O لكل من آبارهم.
- التقاط استعداد البكر الذكور البالغين أو والإناث مع إبرة الشعرية ووضع الديدان الخيطية واحد فقط في الماء من كل شريحة مقعرة.
- إبقاء البالغين البكر داخل البئر لمدة 1 ساعة للسماح لهم التكيف مع البيئة المائية الجديدة.
- زوج من الذكور والإناث البكر عن طريق نقل واحد منهم من بئر واحد إلى آخر باستخدام ماصة.
- مراقبة سلوك التزاوج من 1♀ + 1♂ الجمع في الشريحة المقعرة تحت مجهر تشريحي.
- لتحليل كفاءة التزاوج من البالغين البكر، وحساب نسبة نجاح التزاوج (R) ومقارنتها مع أن من الأزواج الكبار تم اختيارها عشوائيا. حساب R كنسبة مئوية من مكررات حيث لوحظ الجماع مقارنة مع العدد الإجمالي للمكررات دراستها.
- من أجل جمع البيانات للتحليل الكمي والكيفي، تصوير سلوك التزاوج باستخدام المجهر الفيديو. عادة، يتم الانتهاء من عملية التزاوج كلها، من الوقت الذي يتم وضعها النيماتودا في بئر الشريحة المقعرة لحظة عندما تتحرك بعيدا بعد الجماع، في غضون 2 ساعة. ولذلك، تسجيل عملية التزاوج مستمر لمدة 2 ساعة على الأقل كما مكررة واحدة. كاملة لا يقل عن 30 مكرر مجموع لكل تركيبة.
ملاحظة: إضافة أكثر عقيمة ي H 2 O (عادة 50 ميكرولتر) كل 0.5 ساعة إلى البئر لتعويض التبخر أثناء عملية التسجيل.
3. جمع البيانات
- عرض جميع مقاطع الفيديو بدقة على شاشة الكمبيوتر وتوصيف سلوكيات الفرعية نوعيا.
- قياس مدة عشر التزاوج باستخدامه وظيفة الإطار حسب الإطار من مسجل الفيديو. طرح الوقت بدءا من نقطة النهاية يدويا.
- لمزيج 1♀ + 1♂، تحليل كل تسجيل الفيديو وقياس مدة من الأحداث التالية:
- قياس مدة من البحث (أي وقت من عند إدخال الإناث والذكور في البئر من الشريحة المقعرة لحظة التي يواجهونها والاتصال بعضها البعض).
- قياس مدة الاتصال (أي وقت من أول اتصال لحظة عندما يتم وضع الذكور على وجه التحديد في الفرج الأنثى للجماع الأول).
- قياس مدة جماع (أي الوقت من عند الذكور يتم وضع على وجه التحديد في الفرج الأنثى حتى تنزلق من جسم الأنثى بعد القذف). ملاحظة: يمكن لبعض الديدان الخيطية التزاوج عدة مرات في 2 ساعة. في مثل هذه الحالات، وقياس مدة الجماع من الجماع الأول إلى نهاية لاسر واحد، بما في ذلك الوقت بين بين.
- قياس مدة العالقة (أي فترة ما بعد الجماع حتى السباحة الذكور والإناث بعيدا عن بعضها البعض وتفصل بينها مسافة أكثر من طول الجسم النيماتودا "(في الغالب 1 مم)).
- عد من وتيرة الجماع ومدة كل الجماع ومتوسط مدة كل copulations في 2 ساعة لكل من مجموعات مختلفة (أي 1♀ + 1♂، 3♀ + 1♂، و1♀ + 3♂).
- حساب نسبة نجاح التزاوج لأول اتصال (P) لمجموعات مختلفة مثل نسبة نجاح التزاوج بعد الاتصال الأول الذي يجرى على الفور ودون أي انقطاع. في مرحلة الاتصال، يمكن ملاحظة عدة اتصالات قبل الجماع الفعلي.
- عندما تكون المسافة بين شخصين هي أكثر من طول الجسم، والنظر في جهة اتصال واحدة لتكون أكثر. لتكرار واحد، سجل P إلى 100٪ عند الجماع طلاحظ الصورة على الفور بعد أول اتصال، دون انقطاع، أو ما يعادل 0.00٪ إذا لم يلاحظ أي الجماع أو إذا كان هناك الجماع ولكن بعد يومين أو مزيد من الاتصالات.
ملاحظة: كان هناك 30 مكررات لكل تركيبة هو موضح هنا.
- عندما تكون المسافة بين شخصين هي أكثر من طول الجسم، والنظر في جهة اتصال واحدة لتكون أكثر. لتكرار واحد، سجل P إلى 100٪ عند الجماع طلاحظ الصورة على الفور بعد أول اتصال، دون انقطاع، أو ما يعادل 0.00٪ إذا لم يلاحظ أي الجماع أو إذا كان هناك الجماع ولكن بعد يومين أو مزيد من الاتصالات.
- إعداد إبرة لالتقاط الديدان الخيطية عن طريق رسم الزجاج الشعرية بعد تسخينه على موقد الكحول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان معدل نجاح التزاوج (R) من البالغين البكر 86.67٪ في المتوسط، وهو أعلى بكثير من البالغين تم اختيارها عشوائيا: 13.33 ± 4.65٪ (F = 1301.71، مدافع = 1، P = 0.0001) (الشكل 2). وتشير هذه النتيجة أنه من الأسهل لمراقبة سلوك التزاوج باء xylophilus مع الكبار البكر من وبالغين مختارين عشوائيا.
عندما يقترن ذكر واحد مع أنثى واحدة، واستمرت عملية التزاوج بالكامل 82.8 دقيقة في المتوسط. ويمكن وصف العملية برمتها من خلال أربع مراحل مختلفة: البحث، والاتصال، جماع، والعالقة. وكانت مدة هذه المراحل الأربع 21.8 ± 2.0 دقيقة، 28.0 ± 1.9 دقيقة، 25.8 ± 0.7 دقيقة، و 7.2 ± 0.5 دقيقة، على التوالي (الشكل 3). في منشور صدر مؤخرا، وصفنا 11 السلوكيات الفرعية كما المبحرة، تقترب، encounteriنانوغرام، ولمس، التطويق، وتحديد مكان، ربط، والقذف، وفصل، هدوء، والتجوال 9.
عندما اجتمع رجل واحد اثنين أو أكثر من الإناث في نفس الوقت، يبدو أن الذكور للتزاوج عشوائي مع واحد منهم، دون أي اختيار. ومع ذلك، لوحظ اختيار التزاوج واضح لxylophilus B. الإناث. عندما اتصلت امرأة من الذكور، تميل الإناث إلى لمس رأس الذكر، والجسم، والذيل، والمنطقة التناسلية بلطف مع رأسها ويبدو أن تقييم لها شريك محتمل. إذا لم الأنثى تقبل الذكور، تركت الأنثى له بسرعة وسبح إلى ذكر آخر لتقييم المقبل. ثم اختيار واحد من الذكور قبل الإناث للتزاوج. التزاوج معدلات النجاح بعد أول اتصال (ف) من 1♀ + 1♂، 3♀ + 1♂، و1♀ كانت + 3♂ مجموعات 46.7 ± 9.3٪، 80.0 ± 7.4٪، و 23.4 ± 7.4٪، على التوالي، والخلافات بينهما وره كبير (F = 8.21، DF = 2، P = 0.0124) (الشكل 4).
وقد لوحظ المنافسة Intrasexual في كل من الذكور والإناث. عندما كانت مختلطة واحدة أنثى عذراء مع 3 ذكور البكر، حاولت ذكور الاقتراب والاتصال الأنثى قدر الإمكان للحصول على فرصة للتزاوج معها. عندما احتلت الفرج من قبل رجل واحد، حاولت الذكور الأخرى للتشويش على التزاوج من الذكور باستخدام يتأرجح الجسم عنيفة أو سحب للفصل بينهما. وقد شهدت المسابقة intrasexual الإناث إلى أن تكون أكثر أو أقل على غرار المنافسة intrasexual الذكور.
نجاح التزاوج تعتمد أساسا على الأنثى. عندما قبلت الأنثى الذكر، انتقل الذكور أكثر ببطء وكرة لولبية أو حتى تشكيل طوق، ونقل الأنثى إلى الأمام بنشاط لجعل الأمر أكثر سهولة للذكور لتحديد الفرج لها ولتفادي أي تشويش من الذكور الأخرى. لو كانت امرأة لم تقبل من الذكور،حاولت الأنثى لزعزعة قبالة له، حتى لو كان الذكور قد شنت وضعه نفسه الفرج لها. بسبب المنافسة intrasexual، كانت ترددات الجماع من 1♀ + 1♂، 3♀ + 1♂، و1♀ + 3♂ تركيبات 1.43 ± 0.091، 1.17 ± 0.074 و 1.83 ± 0.074 على التوالي، وكانت الخلافات بينهما كبير (F = 14.50، مدافع = 2، P = 0.0001) (الشكل 5).
في تحقيقنا، تفاوتت مدة الجماع إلى حد كبير، مع حد أدنى من 20 ثانية وبحد أقصى 42 دقيقة. وفقا لمعلوماتنا، ومدة الجماع يمكن التفريق الواضح إلى مجموعتين: copulations على المدى القصير، والتي استمرت أقل من 5 دقائق، وcopulations على المدى الطويل، والتي استمرت لفترة أطول من 10 دقيقة. وقد لوحظت اختلافات واضحة بين المجموعات المختلفة للمتوسط مدة الجماع على المدى القصير (F = 3.81، DF = 2، P (F = 179.52، مدافع = 2، P = 0.0001)، وجميع copulations (F = 2.93، DF = 2، P = 0.0367) (الشكل 6).
الشكل 1: الأعضاء التناسلية للذكر وأنثى ب Xylophilus. (أ) الشوكة من الذكور (السهم الأزرق). (ب) الفرج من الإناث (السهم الأحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التزاوج نسبة نجاح الأزواج العذراء الكبار وتم اختيارها عشوائيا الأزواج الكبار باء xylophilus. يحسب متوسط القيم هي من 30 مكررات. شريط العرض الرأسيق الخطأ المعياري. وتشير أحرف صغيرة مختلفة فروق ذات دلالة إحصائية عند P <0.05 بالمقارنة بواسطة اختبار توكي و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: مدة 4 مراحل في عملية التزاوج باء xylophilus. يحسب متوسط القيم هي من 30 مكررات. ويظهر الشريط العمودي الخطأ المعياري. وتشير أحرف صغيرة مختلفة فروق ذات دلالة إحصائية عند P <0.05 بالمقارنة بواسطة اختبار توكي و. متوسط مدة المرحلة جماع هو 25.80 ± 0.71 دقيقة، وهو 31.17٪ من عملية التزاوج كلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا التينلدى عودتهم.
الشكل 4: التزاوج النجاح لأول اتصال باء xylophilus. يحسب متوسط القيم هي من 30 مكررات ± SE. يعني مع حرف صغير نفسه داخل كل عمود ليست مختلفة كثيرا في P <0.05 بالمقارنة بواسطة اختبار الاختلاف الهام صادق توكي و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: الجماع التردد باء xylophilus في المجموعات المختلفة. يحسب متوسط القيم هي من 30 مكررات ± SE. يعني بنفس الحرف الصغير لا تختلف كثيرا في P <0.05 عندما شركاتعرب كورب بواسطة اختبار الاختلاف الهام صادق توكي و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (6): الجماع مدة B. xylophilus. يعني مع حرف صغير نفسه داخل كل مجموعة من الأعمدة التي لا تختلف كثيرا في P <0.05 بالمقارنة بواسطة اختبار الاختلاف الهام صادق توكي و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاختبارات السلوكية تشكل جانبا أساسيا من البيئة الكيميائية، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئية، وعلم الوراثة. الديدان الخيطية، وبخاصة C. ايليجانس، وتستخدم على نطاق واسع للدراسات في هذه المجالات. وقد تم التحقيق في سلوك التزاوج من جيم ايليجانس سابقا 10-11. ومع ذلك، B. xylophilus هو كثير البيض ومختلفة من C. ايليجانس خنثوي، وعملية التزاوج لله عدة مظاهر سلوكية 9. مؤخرا، تم الإبلاغ عن سلوك التزاوج من Bursaphelenchus okinawaensis، وهي من الأنواع الشقيقة خنثوي باء xylophilus، 12. على الرغم من واستخدمت أساليب تجريبية مختلفة، وأظهرت هذه الأنواع خنثوي انجذاب جنسي مشابه لب xylophilus، ولوحظ جذب بين الأنواع بينهما. يمكن استخدام هذا النوع شقيقة خنثوي كنموذج لإجراء مزيد من التحقيقات في بيولوجيا Bursaphelenchus.
وينص هذا البروتوكول على المبادئ التوجيهية بشأن كيفية مراقبة والتحقيق الميزات السلوكية باء xylophilus أثناء التزاوج. وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن استخدام الديدان الخيطية الكبار البكر أمر بالغ الأهمية لزيادة فرصة مراقبة عملية التزاوج (الشكل 1) بنجاح. الحصول على J4 اليرقات والتمييز بدقة بين الجنسين هم خطوتين الأساسية الهامة لاقتناء البالغين البكر. تحت ظروف تجريبية لدينا (أي، عند 25 درجة مئوية في الظلام)، في الفترة من 52 ساعة هو الوقت المناسب للحصول على J4 من J2 اليرقات. ومع ذلك، مع التمييز الجنسي في مرحلة مبكرة J4 يعتمد في الغالب على تجربة شخصية. لضمان الدقة، فمن الضروري لأشخاص مختلفين لمضاعفة التحقق من تخصيص الجنس.
الميزات السلوكية باء xylophilus أثناء عملية التزاوج يمكن وصف نوعي وتحليل كمي عن طريق تسجيل المدد من أربعة تختلفمراحل الأنف والحنجرة، ونسبة نجاح التزاوج بعد أول اتصال، وتيرة الجماع، ومدة الجماع من تركيبات مختلفة. ومن المثير للاهتمام، للمرة الأولى، لاحظنا اختيار التزاوج من الإناث والمنافسة داخل جنسية قوية في كل من الذكور والإناث. لم يكن هناك أي اختلاط. ومع ذلك، فإن هذا قد يكون راجعا إلى عدد محدود من الديدان الخيطية المستخدمة في تحقيقنا. هذا البروتوكول لا يمكن أن تستخدم إلا للتحقيق في سلوك التزاوج باء xylophilus، ولكن يمكن أيضا أن تكون مفيدة وقيمة كمرجع لالديدان الخيطية أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ساهم Najie تشو ولى تشون باي بالتساوي على هذا العمل. وأيد هذا العمل ماليا من الصندوق الخاص للبحوث العلمية الغابات في النفع العام (201204501) ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31170604، 31270688، 31570638 و). نشكر الدكتور جيريت Holighaus والدكتور دانييل Hickford للحصول على اقتراحات مفيدة على الكتابة باللغة الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
