Abstract
Un método para observar y cuantificar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus, se estableció bajo un microscopio estereoscópico. Para mejorar la eficiencia de acoplamiento de B. Xylophilus y para aumentar las posibilidades de observación de apareamiento, los adultos vírgenes se cultivaron y se utilizan para la investigación. Los huevos se obtuvieron manteniendo los nematodos en agua y permitiendo que las hembras ponen huevos para 10 min. Los juveniles de segunda etapa (J2) se sincronizaron mediante la incubación de los huevos durante 24 horas a 25 ° C en la oscuridad, y la temprana J4 se obtuvieron por cultivo de la J2 con el moho gris, Botrytis cinerea, por otra 52 h. En ese momento, la mayoría de los nematodos J4 podían distinguirse claramente como ser hombre o mujer usando su morfología genital. La hembra J4 macho y se recogieron y se cultivaron por separado en dos placas de Petri diferentes para 24 h para obtener nematodos adultos vírgenes. Un macho y una hembra virgen virgen fueron emparejados en una gota de water en el pozo de una diapositiva cóncava. El comportamiento de apareamiento fue filmado con un grabador de vídeo bajo un microscopio estereoscópico. todo el período del proceso de apareamiento fue del 82,8 ± 3,91 min (media ± DE) y se puede dividir en 4 fases distintas: la búsqueda, contacto, copulando, y persistentes. La media de minutos de duración fueron 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 y 7,2 ± 0,5, respectivamente. Se describen once sub-comportamientos: crucero, se acerca, el encuentro, tocando, zunchado, la localización, adjuntando, eyacular, la separación, la quietud, y la itinerancia. Curiosamente, se observó obvia la competencia intra-sexual cuando una mujer se agrupó con 3 machos o un macho con 3 hembras. Este protocolo es útil y valiosa, no sólo en la investigación del comportamiento de apareamiento de B. xylophilus, sino también en que actúa como referencia para los estudios etológicos de otros nematodos.
Protocol
1. Adquisición de Vírgenes nematodos adultos
- Aislado nematodo del pino y condiciones de cultivo
NOTA: El B. xylophilus aislar Nxy61 se extrajo originalmente de un massoniana Pinus enferma en la zona de Ningbo, provincia de Zhejiang en China.- Preparar Papa Dextrosa Agar (PDA, consulte la Tabla de Materiales) placas para el cultivo de Botrytis cinerea.
- Para la inoculación, perforar un pedazo de alfombra de hongos con diámetro de 10 mm a partir de una estera de B. cinerea y lo puso en medio de una nueva placa de PDA. Cultura del B. cinerea durante 5 días a 25 ° C en la oscuridad.
- La cultura de los nematodos de madera de pino en la placa de Petri que contiene preparada B. cinerea a 25 ° C en la oscuridad.
- Adquisición de B. xylophilus huevos
- Colocar un tubo de goma sujeta por debajo de un embudo y sostenga el embudo dispuesto en un bastidor para montar elaparato de embudo Baermann. Colocar dos capas de papel de filtro en lugar de gasa en la boca del embudo.
- La transferencia de los cultivos de hongos a la configuración de embudo y añadir agua hasta que está inmersa la flora fúngica. Esperar 2 h, y nematodos van a salir a partir del cultivo de hongos, cruce el papel de filtro, y establecerse en la parte más baja del embudo Baermann.
- Reunir la primera par de gotas de agua de la parte inferior del tubo en un tubo de 15 ml y recoger los nematodos liberando lentamente la abrazadera sobre el tubo.
- Centrifugar las colecciones anteriores a 3000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Eliminar la capa superior de agua con una pipeta y resuspender con 1 ml de estéril doblemente destilada (dd) H 2 O.
- Con una pipeta, transferir la resuspensión de arriba para un plato de Petri nuevo vidrio (6 cm de diámetro). Añadir 3 ml de estéril dd H2O para la placa de Petri para asegurar que los nematodos son capaces de nadar libremente.
- Mantenga los nematodos en los glass placa de Petri durante 10 min a 25 ° C en la oscuridad. Los huevos serán puestos por las hembras embarazadas. Debido a su superficie la glicoproteína, los huevos se adhieren a la parte inferior de la placa de Petri de vidrio.
- Eliminar el agua y los gusanos con cuidado, sin molestar a los huevos. Añadir 3 ml de solución estéril de dd H 2 O a la placa de Petri de vidrio inmediatamente para evitar que los huevos se sequen.
- Repita el paso 1.2.8 3x para eliminar todas las larvas y los adultos, y obtener los huevos puros. Añadir un extra de 2 ml (5 ml en total) de estéril dd H2O para la placa de Petri.
- La adquisición de los juveniles de Cuarta Etapa (larvas J4)
- Escotilla de los huevos recogidos durante 24 h en la oscuridad a 25 ° C para obtener larvas J2.
- Transferir las larvas J2 con una pipeta en un tubo de 15 ml, se centrifuga a 3.000 g durante 2 min, y quitar la capa superior de agua.
- Volver a suspender las larvas J2 con 200 l de estéril dd H2O, y luego transferirlos ala placa de PDA que contiene B. cinerea.
- Cultura las larvas J2 durante 52 horas a 25 ° C en la oscuridad. En este punto de tiempo, la mayoría larvas J2 se habrá convertido en la primera etapa de larvas J4.
- Adquisición de nematodos adultos vírgenes
- Preparar una aguja para recoger nematodos mediante la elaboración de un capilar de vidrio después de haberlo calentado sobre un mechero de alcohol.
NOTA: La punta de esta aguja capilar por lo general tiene que ser 50 micras de diámetro, más o menos la anchura del cuerpo de un nematodo adulto, de manera que se puede utilizar como una herramienta para recoger un solo nematodos. - Montar un embudo Baermann y extraer nematodos de los cultivos de hongos durante 2 h, tal como se describe en los pasos 1.2.1 - 1.2.3.
- Transferir el J4 con agua en una placa Petri limpia.
- Observar los nematodos bajo un estereomicroscopio y distinguir entre machos y hembras de la morfología genital, tal como se describe por Mamiya y Kiyohara 8 (Figura 1 NOTA: Hay más mujeres que hombres, con el porcentaje de hembras a 60 - El 70%. La vulva femenina es obviamente diferente de la espícula masculina. En comparación con el adulto, la espícula o la vulva en las primeras etapas del J4 es más pequeño, pero todavía pueden ser vistos y distinguida fácilmente. El nematodo está siempre en movimiento en el agua, que a veces aumenta la dificultad de distinguir machos y hembras.
- Cultura J4 las larvas durante otras 24 horas a 25 ° C en la oscuridad.
NOTA: Todos los nematodos deben convertirse en adultos, pero como son desacoplados, que son considerados como adultos vírgenes. - Montar dos embudos Baermann y extraer los adultos vírgenes procedentes de los cultivos de hongos durante 2 h, tal como se describe en los pasos 1.2.1 - 1.2.3, y transferir los machos adultos y hembras vírgenes en dos platos separados, limpios de Petri.
2. La observación y grabación de vídeo de la conducta de apareamiento
- Preparar varias diapositivas cóncavas y añadir 200 l de estéril dd H2O a cada uno de sus pozos.
- Recoger el macho adulto o preparados virgen y hembra con una aguja capilar y poner sólo un nematodo en el agua de cada diapositiva cóncava.
- Mantenga los adultos vírgenes en el interior del pozo durante 1 hora para dejar que se adapten al nuevo entorno acuoso.
- Par una virgen masculina y femenina mediante la transferencia de uno de ellos de un pozo a otro utilizando una pipeta.
- Observar el comportamiento de apareamiento de la 1♀ + combinación 1♂ en la diapositiva cóncava bajo un microscopio estereoscópico.
- Para analizar la eficiencia de acoplamiento de los adultos vírgenes, calcular su tasa de éxito de apareamiento (R) y compararlo con el de parejas de adultos seleccionados al azar. Calcular R como el porcentaje de repeticiones en el que se observó la cópula en comparación con el número total de repeticiones estudiados.
- Con el fin de recopilar datos para el análisis cualitativo y cuantitativo, filmar el comportamiento de apareamiento mediante microscopía de vídeo. Normalmente, todo el proceso de acoplamiento, desde el momento en el que los nematodos se colocan en el pozo de la corredera cóncava para el momento en que se alejan después de la copulación, se completa dentro de 2 h. Por lo tanto, el proceso de apareamiento grabar de forma continua durante al menos 2 h como una réplica. Completar al menos 30 repeticiones en total para cada combinación.
NOTA: Añadir más estériles dd H2O (por lo general 50 l) cada 0,5 h al pozo para compensar la evaporación durante el proceso de grabación.
3. Recolección de Datos
- Ver todos los vídeos con cuidado sobre una pantalla de ordenador y caracterizar las sub-comportamientos cualitativamente.
- Medir la duración de apareamiento usando THe fotograma a fotograma en función de la grabadora de vídeo. restar manualmente el tiempo de inicio desde el punto final.
- Para la combinación 1♀ + 1♂, analizar cada grabación de vídeo y medir la duración de los eventos siguientes:
- Medir la duración de la búsqueda (es decir, el tiempo desde que la hembra y macho se introducen en el pozo de la corredera cóncava hasta el momento en que encuentran y en contacto entre sí).
- Medir la duración de contacto (es decir, el tiempo desde el primer contacto hasta el momento en que el macho se coloca precisamente en la vulva de la mujer para la primera copulación).
- Medir la duración de copulando (es decir, el tiempo desde cuando el macho se coloca precisamente en la vulva de la hembra hasta que se desliza hacia abajo del cuerpo de la hembra después de la eyaculación). Nota: Algunos nematodos pueden copular varias veces en 2 h. En tales casos, medir la duración de la copulación de la primera copulación hasta el final de la last uno, incluyendo el tiempo en el medio.
- Medir la duración de persistente (es decir, el periodo después de la copulación hasta que el baño macho y hembra de distancia unos de otros y están separados por una distancia de más de la longitud del cuerpo los nematodos '(normalmente 1 mm)).
- Contar la frecuencia de la cópula y la duración de cada copulación y la duración media de todas las copulaciones en 2 h para cada una de las diferentes combinaciones (es decir, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, y 1♀ + 3♂).
- Calcular la tasa de éxito de apareamiento para el primer contacto (P) para las diferentes combinaciones como la tasa de éxito de apareamiento después de la primera toma de contacto, que se llevó a cabo de inmediato y sin ninguna interrupción. En la fase de contacto, varios contactos pueden ser observados antes de la copulación propiamente dicha.
- Cuando la distancia entre dos individuos es más que la longitud del cuerpo, considere uno de contactos de haber terminado. Para un replicado, ficha P como el 100% cuando la cópula is observó inmediatamente después de la primera toma de contacto, sin descanso, o 0.00%, si no se observó la cópula o si había copulación pero después de dos o más contactos.
NOTA: Hubo 30 repeticiones para cada combinación descrita aquí.
- Cuando la distancia entre dos individuos es más que la longitud del cuerpo, considere uno de contactos de haber terminado. Para un replicado, ficha P como el 100% cuando la cópula is observó inmediatamente después de la primera toma de contacto, sin descanso, o 0.00%, si no se observó la cópula o si había copulación pero después de dos o más contactos.
- Preparar una aguja para recoger nematodos mediante la elaboración de un capilar de vidrio después de haberlo calentado sobre un mechero de alcohol.
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Representative Results
La tasa de éxito de acoplamiento (R) de los adultos vírgenes era 86,67% de media, que fue significativamente mayor que la de los adultos seleccionados al azar: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Este hallazgo sugiere que es más fácil de observar el comportamiento de apareamiento de B. xylophilus con adultos vírgenes que con adultos seleccionados al azar.
Cuando un macho fue emparejado con una hembra, todo el proceso de apareamiento duró 82,8 min en promedio. Todo el proceso puede ser descrito por cuatro fases distintas: la búsqueda, contactando, copulando, y persistente. La duración de estas cuatro fases se 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min, y 7,2 ± 0,5 min, respectivamente (Figura 3). En una publicación reciente, describimos las 11 sub-comportamientos como de crucero, se acerca, encountering, tocar, zunchado, la localización, adjuntando, eyacular, la separación, la quietud, y la itinerancia 9.
Cuando un macho se reunió dos o más hembras al mismo tiempo, el macho parecía acoplarse al azar con uno de ellos, sin ninguna selección. Sin embargo, se observó elección obvia para el apareamiento B. hembra xylophilus. Cuando una hembra en contacto con un macho, la hembra tiende a tocar la cabeza del macho, cuerpo, la cola y la región genital suavemente con la cabeza y parecía estar evaluando su potencial pareja. Si la hembra no aceptó el macho, la hembra lo dejó rápidamente y nadó a otro macho para la siguiente evaluación. Uno de los machos a continuación, fue seleccionado por la hembra durante el apareamiento. El apareamiento tasas de éxito después del primer contacto (P) de la 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, y 1♀ + 3♂ combinaciones fueron 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, y el 23,4 ± 7,4%, respectivamente, y las diferencias entre ellos were significativo (F = 8,21, df = 2, p = 0,0124) (Figura 4).
la competencia intrasexuales se observó tanto en hombres como en mujeres. Cuando una hembra virgen se mezcló con 3 machos vírgenes, los hombres trataron de acercarse y ponerse en contacto con la hembra tanto como sea posible para obtener la oportunidad de aparearse con ella. Cuando la vulva fue ocupada por un macho, los otros machos trataron de perturbar el macho de acoplamiento mediante el uso de cambios de cuerpo violentos o arrastrando para separarlos. la competencia intrasexual femenina se ve que es más o menos similar a la competencia intrasexual masculina.
el éxito de apareamiento dependía principalmente de la hembra. Cuando una mujer acepta un macho, el macho se movía más despacio y curvado ni siquiera formó un aro, y la hembra se movió hacia delante de forma activa para que sea más fácil para el macho para localizar su vulva y para evitar interferencias de otros machos. Si una mujer no aceptó un varón,la hembra trató de quitarse de encima, incluso si el macho había montado y colocado a sí mismo por su vulva. Debido a la competencia intrasexual, las frecuencias de copulación de la 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ y 1♀ + 3♂ combinaciones fueron 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 1,83 ± 0,074 y 0,074, respectivamente, y las diferencias entre ellos eran significativo (F = 14,50; gl = 2; p = 0,0001) (Figura 5).
En nuestra investigación, la duración copulación fue muy variable, con un mínimo de 20 s y un máximo de 42 minutos. De acuerdo con nuestros datos, la duración de la cópula se podría obviamente diferenciarse en dos grupos: cópulas a corto plazo, que duró menos de 5 minutos, y cópulas a largo plazo, que duró más de 10 minutos. No se observaron diferencias obvias entre los diferentes grupos de la duración media de la cópula a corto plazo (F = 3,81, df = 2, P (F = 179,52, df = 2, p = 0,0001), y todas las copulaciones (F = 2,93, df = 2, p = 0,0367) (Figura 6).
Figura 1: Los genitales del varón y la hembra B. Xylophilus. (A) espícula del macho (flecha azul). (B) la vulva de la hembra (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Acoplamiento de la tasa de éxito de las parejas Virgen adultos y parejas de adultos seleccionados al azar de B. xylophilus. Los valores medios calculados son de 30 repeticiones. El espectáculo barra verticals el error estándar. Las diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas a P <0,05 en comparación con la prueba de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Duración de las 4 fases del proceso de apareamiento de B. xylophilus. Los valores medios calculados son de 30 repeticiones. La barra vertical muestra el error estándar. Las diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas a P <0,05 en comparación con la prueba de Tukey. La duración media de la fase copulando es 25,80 ± 0,71 min, que es 31,17% de todo el proceso de apareamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figuraUre.
Figura 4: Acoplamiento de éxito para el Primer Contacto de B. xylophilus. Los valores medios calculados son de 30 repeticiones ± SE. Medias con la misma letra minúscula dentro de cada columna no son significativamente diferentes a P <0,05 en comparación con la prueba diferencia significativa honesta de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cópula de frecuencia de B. xylophilus en diferentes grupos. Los valores medios calculados son de 30 repeticiones ± SE. Medias con la misma letra minúscula no son significativamente diferentes a P <0,05 en losared mediante la prueba de diferencia significativa honesta de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La cópula Duración de B. xylophilus. Medias con la misma letra minúscula dentro de cada conjunto de columnas no son significativamente diferentes a P <0,05 en comparación con la prueba diferencia significativa honesta de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pruebas de comportamiento son un aspecto fundamental de la ecología química, la neurobiología, la biología molecular y la genética. Nematodos, y en particular de C. elegans, se usan ampliamente para estudios en estas áreas. El comportamiento de apareamiento de C. elegans se ha investigado previamente 10-11. Sin embargo, B. xylophilus es gonochoristic y diferente de los hermafroditas C. elegans, y su proceso de apareamiento tiene diferentes características de comportamiento 9. Recientemente, se informó de la conducta de apareamiento de Bursaphelenchus okinawaensis, una especie hermana de B. xylophilus hermafroditas, 12. Aunque se utilizaron diferentes métodos experimentales, esta especie hermafrodita mostraron atracción sexual similar a B. xylophilus, y se observó la atracción entre las especies entre ellas. Este hermafroditas especies hermanas podrían usarse como modelo para llevar a cabo más investigaciones sobre la biología de Bursaphelenchus.
Este protocolo proporciona una guía sobre cómo observar e investigar las características de comportamiento de B. xylophilus durante el apareamiento. Nuestros resultados mostraron que el uso de nematodos adultos vírgenes es fundamental para aumentar la probabilidad de observar con éxito el proceso de apareamiento (Figura 1). La obtención de larvas J4 y distinguir con precisión sus sexos son dos importantes pasos fundamentales para la adquisición de los adultos vírgenes. Bajo condiciones experimentales (es decir, a 25 ° C en la oscuridad), el período de 52 h es el momento adecuado para obtener a partir de larvas J2 J4. Sin embargo, para distinguir el sexo en la etapa temprana J4 depende sobre todo de la experiencia personal. Para asegurar la precisión, es necesario que las diferentes personas que compruebe la asignación del sexo.
Las características de comportamiento de B. xylophilus durante el proceso de apareamiento se pueden describir cualitativamente y se analizaron cuantitativamente mediante el registro de las duraciones de los cuatro diferirfases ent, el porcentaje de éxito de apareamiento después del primer contacto, la frecuencia de la cópula, y la duración de la cópula de combinaciones diferentes. Curiosamente, por primera vez, se observó la elección de apareamiento de las hembras y la fuerte competencia intra-sexual tanto en hombres como en mujeres. No se observó la promiscuidad; sin embargo, esto podría ser debido al número limitado de nematodos utilizados en nuestra investigación. Este protocolo no sólo se puede utilizar para investigar el comportamiento de apareamiento de B. xylophilus, pero también puede ser útil y valioso como referencia para otros nematodos.
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Acknowledgments
Najie Zhu y Liqun Bai contribuyeron igualmente a este trabajo. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Fondo Especial para la Investigación Científica Forestal en el Bienestar Público (201204501) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31170604, 31270688, 31570638 y). Agradecemos al Dr. Gerrit Holighaus y el Dr. Danielle Hickford por sus útiles sugerencias sobre la escritura Inglés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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