Abstract
Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.
Protocol
1. Aquisição de Virgin Adulto Nematóides
- Pinewood isolado nematóide e condições de cultura
NOTA: O B. xylophilus isolar Nxy61 foi originalmente extraído de uma massoniana Pinus doente na área de Ningbo, província de Zhejiang, na China.- Prepare Potato Dextrose Agar (PDA, consulte a Tabela de Materiais) placas para o cultivo de Botrytis cinerea.
- Para inoculação, perfurar um pedaço de tapete de fungos com diâmetro de 10 mm a partir de um tapete de B. cinerea e colocá-lo no meio de uma nova placa de PDA. Cultura de B. cinerea por 5 d, a 25 ° C no escuro.
- Cultura os nematóides de pinho em placa de Petri contendo preparado de B. cinerea a 25 ° C no escuro.
- Aquisição de B. xylophilus ovos
- Coloque um tubo de borracha fixada abaixo de um funil e prender o funil preparado em um rack para montar oaparelho de funil de Baermann. Colocar duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil.
- Transferir as culturas de fungos com a configuração de funil e adicionar água até o tapete fúngico está imerso. Aguarde 2 h, e nematóides vai sair a partir da cultura fúngica, atravessar o papel de filtro, e se estabelecer na parte mais baixa do funil de Baermann.
- Reunir o primeiro par de gotas de água a partir do fundo do tubo para um tubo de 15 ml e recolher os nemátodos, libertando lentamente o grampo no tubo.
- Centrifugar as colecções acima a 3000 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
- Remover a camada superior da água com uma pipeta e ressuspender com 1 ml de estéril duplamente destilada (dd) H 2 O.
- Com uma pipeta, transferir a ressuspensão de cima para um prato de Petri de vidro novo (6 cm de diâmetro). Adicionar 3 ml de estéril dd H2O para a placa de Petri para assegurar que os nemátodos são capazes de nadar livremente.
- Mantenha os nematóides nos glass uma placa de Petri durante 10 minutos a 25 ° C no escuro. Os ovos serão estabelecidas por fêmeas grávidas. Devido à sua superfície a glicoproteína, os ovos serão agarradas ao fundo da placa de Petri de vidro.
- Retire a água e vermes cuidadosamente, sem perturbar os ovos. Adicionar 3 ml de estéril dd H2O ao prato de Petri de vidro imediatamente para evitar que os ovos de secar.
- Repetir o passo 1.2.8 3x para remover todas as larvas e adultos, e obter os ovos puro. Adicionar um extra de 2 ml (5 mL no total) de estéril dd H2O para a placa de Petri.
- Aquisição dos juvenis quarta-fase (larvas J4)
- Chocar os ovos recolhidos durante 24 horas no escuro a 25 ° C para se obter larvas J2.
- Transferir as larvas J2 com uma pipeta para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e remover a camada superior da água.
- Ressuspender as larvas J2 com 200 mL de estéril dd H2O, e depois transferi-los paraa placa PDA contendo B. cinerea.
- Cultura das larvas J2, durante 52 h a 25 ° C no escuro. Neste ponto de tempo, a maioria das larvas J2 terão desenvolvido na fase inicial de larvas J4.
- Aquisição de nematóides adultos virgens
- Prepare uma agulha para pegar nematóides pelo desenho de um capilar de vidro, depois de aquecer-lo sobre um queimador de álcool.
NOTA: A ponta da agulha capilar tem normalmente de ser de 50 um de diâmetro, mais ou menos a largura do corpo de um nemátodo adulto, de modo que ele pode ser usado como uma ferramenta para retirar um único nemátodo. - Montar um funil de Baermann e extrair nematóides das culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3.
- Transfira a J4 com água em um prato limpo Petri.
- Observe os nematóides sob um microscópio estereoscópico e distinguir entre machos e fêmeas por morfologia genital, como descrito por Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 NOTA: Existem mais mulheres que homens, com a porcentagem de fêmeas em 60 - 70%. A vulva da mulher é obviamente diferente da espícula macho. Em comparação com o adulto, a espícula ou vulva em J4 em estágio inicial é menor, mas eles ainda podem ser facilmente visto e distinto. O nemátodo está sempre em movimento na água, o que, por vezes, aumenta a dificuldade em distinguir machos e fêmeas.
- Cultura das larvas J4 por mais 24 h a 25 ° C no escuro.
NOTA: Todos os nematóides deve desenvolver em adultos, mas uma vez que são unmated, eles são considerados como adultos virgens. - Montar dois funis de Baermann e extrair os adultos virgens de as culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3, e transferir os machos adultas virgens e fêmeas, em duas placas de Petri limpo separadas.
2. Observação e gravação de vídeo do comportamento de acasalamento
- Preparar várias lâminas côncavas e adicionar 200 ul de estéril dd H2O a cada um dos seus poços.
- Pegar o macho preparado virgem adulto ou e feminino com uma agulha capilar e colocar apenas um nematóide na água de cada slide côncava.
- Mantenha os adultos virgens no interior do poço durante 1 h para deixá-los se adaptar ao novo ambiente aquoso.
- Emparelhar um macho virgem e feminino, transferindo um deles de um poço para outro usando uma pipeta.
- Observar o comportamento de acasalamento da 1♀ 1♂ combinação + no slide côncava sob microscópio estereoscópico.
- Para analisar a eficiência de acasalamento dos adultos virgens, calcular a sua taxa de cruzamento de sucesso (R) e compará-la com a de pares adultos selecionados aleatoriamente. Calcular R como a percentagem de repetições em que se observou a cópula em comparação com o número total de repetições estudados.
- Para a coleta de dados para análise qualitativa e quantitativa, filmar o comportamento de acasalamento usando microscopia de vídeo. Normalmente, todo o processo de acasalamento, a partir do momento em que os nemátodos são colocadas no poço do slide côncava para o momento em que eles se movem para longe após copulação, é completada dentro de 2 h. Portanto, o processo de acasalamento gravar continuamente durante pelo menos 2 h, como um replicado. Complete pelo menos 30 repetições no total para cada combinação.
NOTA: Adicionar mais estéril dd H2O (normalmente 50 uL) a cada 0,5 h ao poço para compensar a evaporação durante o processo de gravação.
3. Recolha de Dados
- Veja todos os vídeos com cuidado sobre uma tela de computador e caracterizar as sub-comportamentos qualitativamente.
- Medir o tempo de acasalamento usando thfunção e quadro-a-quadro do gravador de vídeo. subtrair manualmente o tempo a partir do ponto final.
- Para a combinação 1♀ + 1♂, analisar cada gravação de vídeo e medir a duração dos seguintes eventos:
- Medir a duração de busca (ou seja, o tempo a partir de quando o macho e fêmea são introduzidos na cavidade da corrediça côncava para o momento em que se encontram e contactam entre si).
- Medir o tempo de contacto de (isto é, o tempo desde o primeiro contacto com o momento em que o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea para a primeira cópula).
- Medir a duração da cópula (isto é, o tempo a partir de quando o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea até que ele desliza para baixo a partir do corpo da fêmea após a ejaculação). Nota: Alguns nemátodos podem copular várias vezes em 2 h. Em tais casos, medir a duração da cópula da primeira cópula para o final do lasT uma, incluindo o tempo no meio.
- Medir a duração da prolongado (isto é, o período após a cópula até o mergulho macho e fêmea de distância um do outro e estão separados por uma distância de mais do que o comprimento do corpo dos nemátodos (geralmente 1 mm)).
- Contagem da freqüência de cópula e duração de cada cópula ea duração média de todas as cópulas em 2 h para cada um dos diferentes combinações (ou seja, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂).
- Calcular a taxa de sucesso de acasalamento para o primeiro contato (P) para as diferentes combinações como a taxa de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, que é realizado imediatamente e sem qualquer interrupção. Na fase de contacto, vários contatos pode ser observado antes da cópula real.
- Quando a distância entre dois indivíduos é mais do que o comprimento do corpo, considere um contato para ser terminado. Para uma réplica, ficha P como 100% quando a cópula is observado imediatamente após o primeiro contato, sem interrupção, ou 0,00%, se não foi observada a cópula ou se houve cópula, mas depois de dois ou mais contatos.
NOTA: Não foram 30 repetições para cada combinação descrita aqui.
- Quando a distância entre dois indivíduos é mais do que o comprimento do corpo, considere um contato para ser terminado. Para uma réplica, ficha P como 100% quando a cópula is observado imediatamente após o primeiro contato, sem interrupção, ou 0,00%, se não foi observada a cópula ou se houve cópula, mas depois de dois ou mais contatos.
- Prepare uma agulha para pegar nematóides pelo desenho de um capilar de vidro, depois de aquecer-lo sobre um queimador de álcool.
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Representative Results
A taxa de sucesso de acasalamento (R) de adultos virgem foi de 86,67%, em média, o que foi significativamente mais elevado do que o dos adultos seleccionadas aleatoriamente: 13,33 ± 4,65% (M = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Esta descoberta sugere que é mais fácil de observar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus com adultos virgens do que com adultos selecionados aleatoriamente.
Quando um macho foi emparelhado com uma fêmea, todo o processo de acasalamento durou 82,8 min, em média. Todo o processo pode ser descrito por quatro fases distintas: pesquisa, contactando, copulando e persistente. A duração para estes quatro fases foram 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 minutos, 25,8 ± 0,7 min e 7,2 ± 0,5 minutos, respectivamente (Figura 3). Em recente publicação, descrevemos as 11 sub-comportamentos como cruzeiro, aproximando-se, encountering, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming 9.
Quando um macho met dois ou mais fêmeas simultaneamente, o macho parecia para acasalar aleatoriamente com um deles, sem qualquer selecção. No entanto, foi observada a escolha óbvia para o acasalamento feminino B. xylophilus. Quando uma fêmea em contato com um macho, a fêmea tende a tocar na cabeça do macho, corpo, cauda e região genital suavemente com a cabeça e parecia estar avaliando seu potencial parceiro. Se a fêmea não aceitar o macho, a fêmea deixou rapidamente e nadou para outro do sexo masculino para a próxima avaliação. Um dos machos foi então seleccionada pela fêmea para o acasalamento. Acasalamento taxas de sucesso após o primeiro contacto (P) da 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂ combinações foram 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4% e 23,4 ± 7,4%, respectivamente, e as diferenças entre eles were significativo (F = 8,21, df = 2, P = 0,0124) (Figura 4).
competição intrasexual foi observada em ambos os machos e fêmeas. Quando uma fêmea virgem foi misturado com 3 machos virgens, os machos tentaram se aproximar e em contato com o sexo feminino, tanto quanto possível para ter a chance de acasalar com ela. Quando a vulva foi ocupada por um macho, os outros machos tentou perturbar o macho de acoplamento, utilizando balanços violentos corpo ou arrastando a separá-los. competição intrasexual feminino foi visto como sendo mais ou menos semelhante à concorrência intrasexual masculino.
sucesso de acasalamento dependia principalmente da mulher. Quando uma fêmea aceita um macho, o macho movido mais lentamente e enrolado ou mesmo formado um aro, ea fêmea avançou ativamente para tornar mais fácil para o macho para localizar sua vulva e evitar a interferência de outros machos. Se uma fêmea não aceitar um macho,a fêmea tentou livrar dele, mesmo que o macho tinha montado e se posicionou por sua vulva. Por causa da competição intrasexual, frequências copulação da 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂ combinações foram de 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 e 1,83 ± 0,074, respectivamente, e as diferenças entre eles eram significativo (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (Figura 5).
Na nossa investigação, a duração da cópula variou grandemente, com um mínimo de 20 s e um máximo de 42 minutos. De acordo com nossos dados, a duração da cópula poderia ser, obviamente diferenciados em dois grupos: cópulas de curto prazo, que durou menos de 5 minutos, e cópulas de longo prazo, que durou mais de 10 min. Foram observadas diferenças óbvias entre os diferentes grupos para a duração média da cópula de curto prazo (F = 3,81, df = 2, P (M = 179,52, df = 2, P = 0,0001), e todas as copulações (F = 2,93, df = 2, P = 0,0367) (Figura 6).
Figura 1: Genitália do masculino e feminino B. Xylophilus. (A) espícula do macho (seta azul). (B) vulva da fêmea (seta vermelha). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Acoplamento taxa de sucesso de Casais Virgin adultos e casais adultos aleatoriamente selecionados de B. xylophilus. Os valores médios calculados são de 30 repetições. O show barra verticalé o erro padrão. As letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas em P <0,05 quando comparadas pelo teste de Tukey. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Duração das 4 fases do processo de acasalamento de B. xylophilus. Os valores médios calculados são de 30 repetições. A barra vertical mostra o erro padrão. As letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas em P <0,05 quando comparadas pelo teste de Tukey. A duração média da fase cópula é 25,80 ± 0,71 min, o que é de 31,17% de todo o processo de acasalamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 4: Acasalamento sucesso para o primeiro contato de B. xylophilus. Os valores médios calculados a partir de 30 são replicados ± SE. Significa com a mesma letra minúscula dentro de cada coluna não são significativamente diferentes em P <0,05 quando comparadas pelo teste de Diferença significativa Honest de Tukey. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cópula Frequência de B. xylophilus em grupos diferentes. Os valores médios calculados a partir de 30 são replicados ± SE. Significa com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes em P <0,05 quando compared pelo teste Diferença significativa Honest de Tukey. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Cópula Duração do B. xylophilus. Significa com a mesma letra minúscula dentro de cada conjunto de colunas não são significativamente diferentes em P <0,05 quando comparadas pelo teste de Diferença significativa Honest de Tukey. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente 10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais 9. Recentemente, o comportamento de acasalamento de Bursaphelenchus okinawaensis, uma espécie-irmã hermafroditas de B. xylophilus, foi relatada 12. Embora foram utilizados métodos experimentais diferentes, esta espécie hermafrodita mostrou atração sexual semelhante ao B. xylophilus, e observou-se atracção inter-espécies entre eles. Esta espécie irmã hermafroditas pode ser usado como um modelo para conduzir uma investigação mais aprofundada sobre a biologia do Bursaphelenchus.
Este protocolo fornece uma orientação sobre a forma de observar e investigar as características comportamentais de B. xylophilus durante o acasalamento. Os nossos resultados mostraram que o uso de nemátodos adultos virgem é crítico para aumentar a possibilidade de observar o processo de acasalamento com sucesso (Figura 1). Obtenção de larvas J4 e distinguir precisamente seus sexos são dois passos fundamentais importantes para a aquisição de adultos virgens. Sob as nossas condições experimentais (isto é, a 25 ° C no escuro), o período de 52 horas é um tempo apropriado para se obter a partir de larvas J4 J2. No entanto, distinguir o sexo na fase J4 início na maior parte depende da experiência pessoal. Para garantir a precisão, é necessário que as pessoas diferentes para verificar novamente a alocação sexo.
As características comportamentais de B. xylophilus durante o processo de acasalamento podem ser descrita qualitativamente e quantitativamente analisada por gravar as durações dos quatro diferemfases otorrinolaringológico, a percentagem de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, a frequência de copulação e a duração da cópula de combinações diferentes. Curiosamente, pela primeira vez, observamos escolha de acasalamento por fêmeas e forte concorrência intra-sexual em ambos os sexos masculino e feminino. Não foi observada a promiscuidade; No entanto, isto pode ser devido ao número limitado de nemátodos utilizados na investigação. Este protocolo não só pode ser usado para investigar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também pode ser útil e valioso como uma referência para outros nematóides.
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Acknowledgments
Najie Zhu e Liqun Bai contribuíram igualmente para este trabalho. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Especial para Pesquisa Científica Florestal na Public Welfare (201204501) ea National Science Foundation Natural da China (31170604, 31270688 e 31570638). Agradecemos ao Dr. Holighaus Gerrit e Dr. Danielle Hickford por suas sugestões úteis sobre Inglês escrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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