Abstract
Une méthode d'observation et de quantifier le comportement d'accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, a été créé sous un stéréomicroscope. Pour améliorer l'efficacité de l' accouplement de B. Xylophilus et d'augmenter les chances d'observation de l' accouplement, les adultes vierges ont été cultivées et utilisées pour l'enquête. Les œufs ont été obtenus en gardant les nématodes dans l'eau et en permettant aux femelles à pondre des oeufs pendant 10 min. Les juvéniles de deuxième stade (J2) ont été synchronisées par incubation des oeufs pendant 24 h à 25 ° C dans l'obscurité, et le début du J4 ont été obtenus en cultivant le J2 avec de la moisissure grise, Botrytis cinerea, pour un autre 52 h. A ce point du temps, la plupart des nématodes J4 pourraient être clairement distingué comme étant un homme ou une femme en utilisant leur morphologie génitale. Le mâle et la femelle J4 ont été recueillies et cultivées séparément dans deux plats différents de Pétri pendant 24 h pour obtenir nématodes adultes vierges. Un mâle et une femelle vierge vierge ont été jumelés dans une goutte de water dans le puits d'une lame concave. Le comportement d'accouplement a été filmé avec un enregistreur vidéo sous un stéréomicroscope. Toute la période du processus d'accouplement était de 82,8 ± 3,91 min (moyenne ± SE) et pourrait être divisé en 4 phases différentes: la recherche, contact, copuler et persistants. Les minutes moyennes de durée étaient de 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 et 7,2 ± 0,5, respectivement. sous-comportements Onze ont été décrits: croisière, approche, rencontrer, toucher, frettage, la localisation, la fixation, éjaculer, séparer, quiescence, et l'itinérance. Fait intéressant, la concurrence intra-sexuelle évidente a été observée lorsque une femme a été regroupé avec 3 mâles ou d'un mâle avec 3 femelles. Ce protocole est utile et précieux, non seulement dans l' étude du comportement d'accouplement de B. xylophilus, mais aussi en agissant comme une référence pour les études éthologiques des autres nématodes.
Protocol
1. Acquisition de Virgin adultes Nématodes
- Pinewood nematode isolat et des conditions de culture
NOTE: Le B. xylophilus isoler Nxy61 a été extrait d'un massoniana Pinus malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang en Chine.- Préparer Potato Dextrose Agar (PDA, voir le tableau des matériaux) plaques pour la culture Botrytis cinerea.
- Pour l' inoculation, percer un morceau de tapis fongique avec un diamètre de 10 mm à partir d' un tapis B. cinerea et le mettre dans le milieu d'une nouvelle plaque de PDA. Culture B. cinerea pendant 5 jours à 25 ° C dans l'obscurité.
- Culture des nématode du pin dans la boîte de Pétri préparée contenant B. cinerea à 25 ° C dans l'obscurité.
- Acquisition de B. xylophilus oeufs
- Placer un tube en caoutchouc serré en dessous d'un entonnoir et maintenir l'entonnoir disposé dans un rack pour assembler leAppareil d'entonnoir Baermann. Placer deux couches de papier filtre à la place de la gaze à l'embouchure de l'entonnoir.
- Transférer les cultures fongiques à la configuration de l'entonnoir et ajouter de l'eau jusqu'à ce que le tapis fongique est immergé. Attendre 2 h, et les nématodes sortiront de la culture fongique, traverser le papier filtre, et s'installer dans la partie la plus basse de l'entonnoir Baermann.
- Rassembler les deux premières gouttes d'eau à partir du fond du tube dans un tube de 15 ml et recueillir les nématodes en relâchant lentement la pince sur le tube.
- Centrifuger les collections ci-dessus à 3000 g pendant 2 min à température ambiante.
- Retirer la couche supérieure de l' eau avec une pipette et remettre en suspension avec 1 ml de stérile doublement distillée (dd) H 2 O.
- Avec une pipette, transférer la remise en suspension au-dessus d'une boîte de Petri nouveau en verre (diamètre 6 cm). Ajouter 3 ml de stérile dd H 2 O à la boîte de Pétri pour garantir que les nématodes sont capables de nager librement.
- Gardez les nématodes dans les glass boîte de Pétri pendant 10 min à 25 ° C dans l'obscurité. Les oeufs seront pondus par les femelles enceintes. En raison de leur surface de glycoprotéine, les œufs coller au fond du verre boîte de Pétri.
- Retirer l'eau et les vers soigneusement, sans déranger les œufs. Ajouter 3 ml de stérile dd H 2 O au verre boîte de Pétri immédiatement pour empêcher les oeufs de se dessécher.
- Répétez l'étape 1.2.8 3x pour supprimer toutes les larves et les adultes, et d'obtenir des œufs purs. Ajouter un supplément de 2 mL (5 ml au total) de stérile dd H 2 O à la boîte de Pétri.
- Acquisition des juvéniles de quatrième stade (J4 larves)
- Hatch les œufs récoltés pendant 24 h dans l'obscurité à 25 ° C pour obtenir des larves de J2.
- Transfert des larves de J2 avec une pipette dans un tube de 15 ml, centrifuger à 3000 g pendant 2 min, et enlever la couche supérieure de l'eau.
- Resuspendre les larves de J2 avec 200 pi de stérile dd H 2 O, puis les transférer àla plaque de PDA contenant B. cinerea.
- Culture de la larve de J2 pendant 52 h à 25 ° C dans l'obscurité. A ce point du temps, la plupart des larves J2 aura développé dans le stade précoce des larves J4.
- Acquisition de nématodes adultes vierges
- Préparer une aiguille pour prélever des nématodes en dessinant un capillaire en verre après le chauffage au-dessus d'un brûleur à alcool.
REMARQUE: La pointe de cette aiguille capillaire doit généralement être de 50 um de diamètre, à peu près la largeur du corps d'un nematode adulte, de sorte qu'il peut être utilisé comme outil pour ramasser un seul nématode. - Assembler un entonnoir Baermann et extraire les nématodes des cultures fongiques pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3.
- Transférer le J4 avec de l'eau dans une boîte de Pétri propre.
- Observer les nématodes sous un stéréomicroscope et de distinguer entre les hommes et les femmes par la morphologie génitale, comme décrit par Mamiya et Kiyohara 8 (Figure 1 NOTE: Il y a plus de femmes que d'hommes, avec le pourcentage de femmes à 60 - 70%. La vulve féminine est évidemment différent du spicule mâle. Par rapport à l'adulte, la spicule ou de la vulve au J4 stade précoce est plus petit, mais ils peuvent encore être facilement vu et distingué. Le nématode est toujours en mouvement dans l'eau, ce qui augmente parfois la difficulté de distinguer les mâles et les femelles.
- La culture des larves J4 pendant encore 24 heures à 25 ° C dans l'obscurité.
REMARQUE: Tous les nématodes devraient devenir des adultes, mais comme ils sont déconnectés, ils sont considérés comme des adultes vierges. - Assembler deux Baermann entonnoirs et extraire les adultes vierges des cultures de champignons pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3, et transférer les mâles et les femelles adultes vierges en deux, des boîtes de Petri propres séparés.
2. Observation et enregistrement vidéo de Mating Comportement
- Préparer plusieurs diapositives concaves et ajouter 200 ul d' eau stérile jj H 2 O à chacun de leurs puits.
- Décrochez le mâle préparé vierge adulte ou et femelle avec une aiguille capillaire et de mettre un seul nématode dans l'eau de chaque diapositive concave.
- Gardez les adultes vierges à l'intérieur du puits pendant 1 h pour permettre leur adaptation au nouvel environnement aqueux.
- Associez un mâle vierge et femelle en transférant l'un d'entre eux d'un puits à l'autre en utilisant une pipette.
- Observez le comportement d'accouplement de la 1♀ 1♂ combinaison + dans la glissière concave sous un stéréomicroscope.
- Pour analyser l'efficacité d'accouplement des adultes vierges, calculer leur taux de succès d'accouplement (R) et le comparer à celui des couples d'adultes choisis au hasard. Calculer R comme le pourcentage de réplications dans lequel copulation a été observée par rapport au nombre total de répétitions étudiées.
- Afin de recueillir des données pour l'analyse qualitative et quantitative, filmer le comportement d'accouplement en utilisant la microscopie vidéo. En règle générale, l'ensemble du processus d'accouplement, à partir du moment où les nématodes sont placés dans le puits de la lame concave au moment où ils se déplacent à une distance après la copulation, est achevée en 2 heures. Par conséquent, enregistrer le processus d'accouplement en continu pendant au moins 2 h comme une répétition. Remplir au moins 30 répétitions au total pour chaque combinaison.
NOTE: Ajouter plus stérile dd H 2 O (habituellement 50 pi) toutes les 0,5 h au puits pour compenser l'évaporation pendant le processus d'enregistrement.
3. Collecte de données
- Voir toutes les vidéos avec précaution sur un écran d'ordinateur et de caractériser les sous-comportements qualitativement.
- Mesurer la durée d'accouplement à l'aide ièmee fonction image par image de l'enregistreur vidéo. Manuellement soustraire le temps à partir du point d'extrémité.
- Pour la combinaison 1♀ + 1♂, analyser chaque enregistrement vidéo et de mesurer la durée des événements suivants:
- Mesurer la durée de la recherche ( à savoir le moment à partir duquel la femelle et mâle sont introduits dans le puits de la lame concave pour le moment qu'ils rencontrent et communiquer entre eux).
- Mesurer la durée de mise en contact (ie, le temps depuis le premier contact jusqu'au moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femme pour la première copulation).
- Mesurer la durée de copuler (ie, le temps entre le moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femelle jusqu'à ce qu'il glisse vers le bas du corps de la femelle après l' éjaculation). Remarque: Certains nématodes peuvent copuler plusieurs fois dans 2 h. Dans de tels cas, de mesurer la durée de copulation de la première copulation à la fin de la last-ci, y compris le temps entre les deux.
- Mesurer la durée persistante ( par exemple, la période après l' accouplement jusqu'à ce que la nage mâle et femelle loin de l'autre et sont séparés par une distance supérieure à la longueur du corps de nematodes ( le plus souvent 1 mm)).
- Compter la fréquence de copulation et la durée de chaque copulation et la durée moyenne de l' ensemble des copulations en 2 h pour chacune des combinaisons différentes (c. -à 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ et 1♀ + 3♂).
- Calculer le taux de succès d'accouplement pour le premier contact (P) pour les différentes combinaisons que le taux de réussite de l'accouplement après le premier contact, qui est conduit immédiatement et sans interruption. Dans la phase en contact, plusieurs contacts peuvent être observés avant la copulation réelle.
- Lorsque la distance entre deux individus est supérieure à la longueur du corps, envisager un contact pour être terminée. Pour une répétition, record P 100% lorsque la copulation is observé immédiatement après le premier contact, sans interruption, ou 0,00% si aucune copulation a été observée ou s'il y avait copulation mais après deux ou plusieurs contacts.
NOTE: Il y avait 30 répétitions pour chaque combinaison décrite ici.
- Lorsque la distance entre deux individus est supérieure à la longueur du corps, envisager un contact pour être terminée. Pour une répétition, record P 100% lorsque la copulation is observé immédiatement après le premier contact, sans interruption, ou 0,00% si aucune copulation a été observée ou s'il y avait copulation mais après deux ou plusieurs contacts.
- Préparer une aiguille pour prélever des nématodes en dessinant un capillaire en verre après le chauffage au-dessus d'un brûleur à alcool.
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Representative Results
Le taux de succès d'accouplement (R) des adultes vierges était 86,67% en moyenne, ce qui est nettement plus élevé que celui des adultes choisis au hasard: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (figure 2). Cette découverte suggère qu'il est plus facile d'observer le comportement d'accouplement de B. xylophilus avec des adultes vierges que les adultes choisis au hasard.
Quand un mâle a été jumelé avec une femelle, le processus d'accouplement entière a duré 82,8 min en moyenne. L'ensemble du processus peut être décrit par quatre phases différentes: la recherche, la mise en contact, copuler et persistante. La durée de ces quatre phases étaient 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min et 7,2 ± 0,5 min, respectivement (figure 3). Dans une publication récente, nous avons décrit les sous-comportements 11 que la croisière, approche, encountering, toucher, frettage, la localisation, la fixation, éjaculer, séparer, quiescence et itinérance 9.
Quand un mâle est réuni à deux ou plusieurs femelles simultanément, le mâle semblait accoupler de façon aléatoire avec l'un d'eux, sans aucune sélection. Cependant, le choix d'accouplement évidente a été observée pour femme B. xylophilus. Quand une femme a contacté un mâle, la femelle a tendance à toucher la tête du mâle, le corps, la queue, et la région génitale doucement avec sa tête et semblait évaluer son partenaire potentiel. Si la femelle n'a pas accepté le mâle, la femelle l'a quitté rapidement et a nagé vers un autre mâle pour la prochaine évaluation. Un des hommes a ensuite été choisi par la femelle pour l'accouplement. Accouplement taux de réussite après le premier contact (P) du 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ et 1♀ + 3♂ combinaisons étaient de 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, et de 23,4 ± 7,4%, respectivement, et les différences entre les were significative (F = 8,21, df = 2, P = 0,0124) (figure 4).
la concurrence intrasexuelle a été observée chez les mâles et les femelles. Quand une femelle vierge a été mélangé avec 3 mâles vierges, les hommes ont essayé d'approcher et de contacter la femme autant que possible d'avoir la chance de se marier avec elle. Lorsque la vulve était occupée par un mâle, les autres hommes ont essayé de perturber l'accouplement mâle en utilisant des sautes de corps violents ou en faisant glisser pour les séparer. Femme concurrence intrasexuelle a été considérée comme plus ou moins similaire à la concurrence intrasexuelle masculine.
succès Mating dépendait principalement de la femelle. Quand une femme a accepté un mâle, le mâle déplacé plus lentement et courbé ou même formé un cercle, et la femelle avançait activement pour le rendre plus facile pour le mâle de localiser sa vulve et pour éviter les interférences des autres mâles. Si une femme n'a pas accepté un mâle,la femelle a essayé de le secouer, même si le mâle était monté et se positionne par sa vulve. En raison de la concurrence intrasexuelle, les fréquences de copulation de la 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ et 1♀ + 3♂ combinaisons étaient de 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 et 1,83 ± 0,074, respectivement, et les différences entre eux étaient significative (F = 14,50, df = 2, p = 0,0001) (figure 5).
Dans notre enquête, la durée de la copulation variait considérablement, avec un minimum de 20 s et un maximum de 42 min. Selon nos données, la durée de la copulation pourrait évidemment être différenciée en deux groupes: copulations à court terme, qui a duré moins de 5 minutes, et copulations à long terme, qui a duré plus de 10 minutes. Différences évidentes ont été observées entre les différents groupes pour la durée moyenne de copulation à court terme (F = 3,81, df = 2, P (F = 179.52, df = 2, P = 0,0001), et toutes les copulations (F = 2,93, df = 2, P = 0,0367) (figure 6).
Figure 1: Genitalia de mâle et femelle B. Xylophilus. (A) spicule du mâle (flèche bleue). (B) de la vulve de la femelle (flèche rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Mating Taux de réussite des couples Virgin adultes et les couples adultes sélectionnés au hasard de B. xylophilus. Les valeurs moyennes sont calculées à partir de 30 répétitions. La barre verticale shows l'erreur standard. Les différentes lettres minuscules indiquent des différences significatives à P <0,05 par rapport par le test de Tukey. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Durée des 4 phases du processus d'accouplement de B. xylophilus. Les valeurs moyennes sont calculées à partir de 30 répétitions. La barre verticale représente l'erreur standard. Les différentes lettres minuscules indiquent des différences significatives à P <0,05 par rapport par le test de Tukey. La durée moyenne de la phase de copulation est de 25.80 ± 0,71 min, ce qui est 31,17% de l'ensemble du processus d'accouplement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Mating Succès pour le premier contact de B. xylophilus. Les valeurs moyennes calculées sont de 30 réplicats ± SE. Moyens avec la même lettre minuscule dans chaque colonne ne sont pas significativement différentes à P <0,05 par rapport par Honest test de différence significative de Tukey. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Copulation Fréquence de B. xylophilus dans les différents groupes. Les valeurs moyennes calculées sont de 30 réplicats ± SE. Moyens avec la même lettre minuscule ne sont pas significativement différentes à P <0,05 quand compARED par Honest test de différence significative de Tukey. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Copulation Durée de B. xylophilus. Moyens avec la même lettre minuscule au sein de chaque ensemble de colonnes ne sont pas significativement différentes à P <0,05 par rapport par Honest test de différence significative de Tukey. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les tests comportementaux sont un aspect fondamental de l'écologie chimique, la neurobiologie, la biologie moléculaire et la génétique. Nématodes, et en particulier C. elegans, sont largement utilisés pour des études dans ces domaines. Le comportement d'accouplement de C. elegans a été étudiée précédemment 10-11. Cependant, B. xylophilus est gonochorique et différent des C. elegans hermaphrodites, et son processus d'accouplement a différentes caractéristiques comportementales 9. Récemment, le comportement d'accouplement de Bursaphelenchus okinawaensis, une espèce sœur hermaphrodites de B. xylophilus, a été signalé 12. Bien que différentes méthodes expérimentales ont été utilisées, cette espèce hermaphrodites ont montré des relations sexuelles similaires attirance pour B. xylophilus, et inter-espèces attraction entre eux a été observée. Cette espèce sœur hermaphrodites peuvent être utilisées comme un modèle pour mener une enquête plus approfondie sur la biologie de Bursaphelenchus.
Ce protocole fournit une ligne directrice sur la façon d'observer et d' étudier les caractéristiques comportementales de B. xylophilus pendant l' accouplement. Nos résultats ont montré que l' utilisation de nématodes adultes vierge est essentielle pour augmenter la chance d'observer avec succès le processus d'accouplement (figure 1). L'obtention de larves de J4 et distinguer précisément leurs sexes sont deux étapes fondamentales importantes pour l'acquisition des adultes vierges. Dans nos conditions expérimentales ( par exemple, à 25 ° C dans l'obscurité), la période de 52 h est le bon moment pour obtenir J4 à partir de larves J2. Cependant, en distinguant le sexe au stade J4 précoce dépend surtout de l'expérience personnelle. Pour garantir la précision, il est nécessaire pour différentes personnes de double-vérifier l'attribution du sexe.
Les caractéristiques comportementales de B. xylophilus au cours du processus d'accouplement peut être décrit qualitativement et quantitativement analysées en enregistrant les durées des quatre diffèrentphases ent, le pourcentage de succès d'accouplement après le premier contact, la fréquence de copulation, et la durée de la copulation de combinaisons différentes. Il est intéressant, pour la première fois, nous avons observé le choix d'accouplement par des femmes et une forte concurrence intra-sexuelle chez les mâles et les femelles. Aucune promiscuité a été observée; Cependant, cela pourrait être dû au nombre limité de nématodes utilisées dans notre étude. Ce protocole ne peut pas être utilisé pour étudier le comportement d'accouplement de B. xylophilus, mais il peut aussi être utile et précieux comme une référence pour d' autres nématodes.
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Acknowledgments
Najie Zhu Liqun et Bai ont contribué également à ce travail. Ce travail a été soutenu financièrement par le Fonds spécial pour la recherche forestière scientifique dans le bien-être public (201204501) et la National Natural Science Foundation de Chine (31170604, 31270688 et 31570638). Nous remercions le Dr Holighaus Gerrit et la Dre Danielle Hickford pour leurs suggestions utiles sur l'anglais écrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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