Abstract
Een methode voor de waarneming en kwantificeren van het paargedrag van het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, werd opgericht in het kader van een stereomicroscoop. De paring efficiëntie van B. Xylophilus verbeteren en de kans op paring observatie te vergroten, maagdelijk volwassenen werden gekweekt en gebruikt voor het onderzoek. Eieren werden verkregen door het houden van de aaltjes in het water en het toestaan van de vrouwtjes om eieren te leggen gedurende 10 min. De tweede fase juvenielen (J2) werden gesynchroniseerd door het incuberen van de eieren voor 24 uur bij 25 ° C in het donker, en het begin J4 werden verkregen door het kweken van de J2 met grijze schimmel, Botrytis cinerea, nog eens 52 uur. Op dit tijdstip konden de meeste J4 nematoden duidelijk onderscheiden als zijnde mannelijke of vrouwelijke genitale behulp van hun morfologie. De mannelijke en vrouwelijke J4 werden verzameld en gekweekt in twee afzonderlijke Petrischalen voor 24 uur tot maagdelijke volwassen nematoden krijgen. Een maagd mannelijke en een vrouwelijke maagd werden gekoppeld in een druppel water in de put van een concave slide. Het paringsgedrag werd gefilmd met een videorecorder onder een stereomicroscoop. De gehele duur van de paring proces was 82,8 ± 3,91 min (gemiddelde ± SE) en kan worden opgedeeld in 4 verschillende fasen: zoeken, contact op te nemen, copuleren, en slepende. De gemiddelde notulen van duur waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 en 7,2 ± 0,5, respectievelijk. Elf sub-gedragingen werden beschreven: het kruisen, het naderbij komen, ontmoeten, aanraken, hooping, het opsporen, het bevestigen, ejaculeren, het scheiden, rust, en roaming. Interessant, werd duidelijk intraseksueel concurrentie waargenomen wanneer een vrouwtje was gegroepeerd met 3 mannen of een man met 3 vrouwen. Dit protocol is nuttig en waardevol, niet alleen bij het onderzoek het paringsgedrag van B. xylophilus, maar ook als een referentie voor ethologische studies van andere nematoden.
Protocol
1. Verwerving van Virgin Adult Nematoden
- Pinewood nematode isolaat en kweekomstandigheden
NB: De B. xylophilus isoleren Nxy61 werd oorspronkelijk gewonnen uit een zieke Pinus massoniana in de Ningbo gebied van de provincie Zhejiang in China.- Bereid Potato Dextrose Agar (PDA, zie tabel van Materialen) platen voor de teelt van Botrytis cinerea.
- Voor enting, punch een stuk schimmel mat met een diameter van 10 mm uit een B. cinerea mat en zet het in het midden van een nieuwe PDA plaat. Cultuur de B. cinerea gedurende 5 dagen bij 25 ° C in het donker.
- Cultuur dennennematoden de gevulde petrischaaltje met B. cinerea bij 25 ° C in het donker.
- Overname van B. xylophilus eieren
- Plaats een vastgeklemd rubberen slang onder een trechter en houd de voorbereide trechter in een rek aan de assemblerenBaermann trechter apparaat. Plaats twee lagen van filterpapier in plaats van gaas in de mond van de trechter.
- Breng de schimmel culturen aan de trechter setup en voeg water toe tot de schimmel mat is ondergedompeld. Wacht 2 uur, en nematoden zal komen uit de schimmel cultuur, steek de filter papier, en zich te vestigen in het laagste deel van de Baermann trechter.
- Verzamel de eerste paar druppels water van de bodem van de buis in een 15 ml buis en laat nematoden door langzaam vrijgeven van de klem op de buis.
- Centrifugeer de bovengenoemde verzamelingen bij 3000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenste laag water met een pipet en resuspendeer met 1 ml steriel dubbel gedestilleerd (dd) H 2 O.
- Met een pipet de bovenstaande resuspensie naar een nieuwe glazen petrischaal (6 cm diameter). Voeg 3 ml steriel dd H2O de petrischaal zodat de nematoden vrij kunnen zwemmen.
- Houd de aaltjes in het glass petrischaal gedurende 10 min bij 25 ° C in het donker. De eieren worden gelegd door zwangere vrouwen. Vanwege hun glycoproteïne oppervlak, zal de eieren aan de bodem van de glazen petrischaal.
- Verwijder het water en wormen voorzichtig, zonder de eieren te storen. Voeg 3 ml steriel dd H2O de glazen petrischaal onmiddellijk te voorkomen dat de eieren uitdrogen.
- Herhaal stap 1.2.8 3x alle larven en volwassenen te verwijderen en het zuivere eieren te verkrijgen. Voeg een extra 2 ml (5 ml in totaal) steriel dd H 2 O aan de petrischaal.
- Overname van de vierde etappe jongeren (J4 larven)
- Hatch verzamelde eieren voor 24 uur in het donker bij 25 ° C J2 larven te verkrijgen.
- Breng de J2 larven met een pipet in een 15 ml buis, centrifuge bij 3000 xg gedurende 2 minuten, en verwijder de bovenste laag van het water.
- Resuspendeer de J2 larven met 200 pl steriel dd H 2 O, en vervolgens overbrengen naarde PDA plaat met B. cinerea.
- Cultuur J2 larven gedurende 52 uur bij 25 ° C in het donker. Op dit tijdstip zullen de meeste J2 larven hebben ontwikkeld in de vroege fase van J4 larven.
- Overname van maagdelijke volwassen nematoden
- Bereid een naald voor het oppakken van aaltjes door het tekenen van een glazen capillaire na verhitting het over een alcohol brander.
OPMERKING: De tip van de capillaire naald moet meestal 50 urn in diameter, ongeveer lichaam breedte van een volwassen nematode, zodat het kan worden gebruikt als instrument voor het oppakken van een nematode. - Monteer een Baermann trechter en extraheren nematoden uit de fungale culturen 2 uur, zoals beschreven in stap 1.2.1 - 1.2.3.
- Breng de J4 met water in een schone petrischaal.
- Neem de nematoden onder een stereomicroscoop en onderscheid tussen mannen en vrouwen met genitale morfologie, zoals beschreven door Mamiya en Kiyohara 8 (figuur 1 LET OP: Er zijn meer vrouwen dan mannen, met het percentage van de vrouwtjes bij 60 - 70%. De vrouwelijke vulva is duidelijk verschillend van de mannelijke spicule. In vergelijking met de volwassen, de spicule of vulva in startende J4 kleiner, maar nog goed te zien en onderscheiden. De nematode is altijd in beweging in het water, die soms moeilijk te onderscheiden mannetjes en vrouwtjes verhoogt.
- Cultuur J4 larven nog eens 24 uur bij 25 ° C in het donker.
OPMERKING: Alle aaltjes moet zich ontwikkelen tot volwassenen, maar omdat ze ongedempte, worden ze beschouwd als maagd volwassenen. - Monteer twee Baermann trechters en pak de maagd volwassenen uit de schimmel kweken gedurende 2 uur, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 - 1.2.3, en de overdracht van de maagd volwassen mannen en vrouwen in twee afzonderlijke, schone Petri gerechten.
2. Observatie en video-opname van paargedrag
- Bereid meerdere concave dia en voeg 200 ul steriel dd H 2 O aan elk van de putjes.
- Pick-up de voorbereide maagd volwassen mannelijke of vrouwelijke en met een capillaire naald en zet slechts één nematode in het water van elke concave glijbaan.
- Houd de maagd volwassenen in de put gedurende 1 uur om hen te laten passen aan de nieuwe waterige omgeving.
- Combineer een maagd mannelijk en vrouwelijk door de overdracht van één van hen van de ene put naar de andere met behulp van een pipet.
- Let op de paargedrag van de 1♀ + 1♂ combinatie in het concave dia onder een stereomicroscoop.
- Om de paring efficiëntie van virgin volwassenen te analyseren, berekenen hun paring slagingspercentage (R) en te vergelijken met die van willekeurig geselecteerde volwassen paren. Bereken R als het percentage herhalingen waarin copulatie werd waargenomen vergeleken met het totale aantal duplo onderzocht.
- Om de gegevens te verzamelen voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse, filmen het paargedrag met behulp van video-microscopie. Gewoonlijk wordt de gehele paring, vanaf het moment waarop de nematoden in de put van het concave dia moment worden geplaatst wanneer zij zich na copulatie verplaatsen, voltooid binnen 2 uur. Daarom gaat opnemen de paring gedurende minstens 2 uur als een herhaling. Volledige tenminste 30 repliceert in totaal voor elke combinatie.
NB: Voeg meer steriel dd H2O (gewoonlijk 50 pl) per 0,5 h naar de bron om te compenseren voor verdamping tijdens het opnameproces.
3. Data Collection
- Alle video voorzichtig op een computerscherm en karakteriseren van de sub-gedrag kwalitatief.
- Meet de tijdsduur van de paring met behulp the beeld-voor-beeld-functie van de videorecorder. Handmatig aftrekken van de starttijd van het eindpunt.
- Voor de 1♀ + 1♂ combinatie, analyseert elke video-opname en het meten van de duur van de volgende evenementen:
- Meet de duur van het zoeken (dwz de tijd tussen de vrouwelijke en mannelijke worden ingebracht in de put van het concave dia aan het moment dat ze ontmoeten en elkaar raken).
- Meet de duur van contact (dat wil zeggen de tijd vanaf het eerste contact tot het moment waarop de mannelijke juist is gepositioneerd op de vrouwelijke vulva voor de eerste paring).
- Meet de duur van copulerende (dat wil zeggen, de tijd vanaf het moment dat de man precies is gepositioneerd op vulva van het vrouwtje tot hij glijdt uit het lichaam van het vrouwtje na de zaadlozing). Opmerking: Sommige nematoden kan meerdere keren copuleren in 2 uur. In dit geval meet de duur van paring van de eerste paring aan het einde van de last een, inclusief de tijd daartussen.
- Meet de duur van aanhoudende (dat wil zeggen de periode na de paring tot de mannelijke en vrouwelijke zwemmen afstand van elkaar en zijn gescheiden door een afstand van meer dan de lichaamslengte nematoden (meestal 1 mm)).
- Tel de copulatie frequentie en duur van elke copulatie en de gemiddelde duur van alle copulaties in 2 uur voor elk van de verschillende combinaties (dat wil zeggen, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ en 1♀ + 3♂).
- Bereken het percentage paring succes voor het eerste contact (P) voor de verschillende combinaties van de slaagkans van paring na het eerste contact, die onmiddellijk en zonder onderbreking plaatsvindt. In het contact op te nemen fase, kan enkele contacten in acht worden genomen voordat de werkelijke copulatie.
- Wanneer de afstand tussen twee individuen is dan de lichaamslengte, eens een contact voorbij. Voor één repliceren, opnemen P 100% bij copulatie is waargenomen onmiddellijk na het eerste contact, zonder onderbreking, of 0,00% indien er geen copulatie werd waargenomen of als er copulatie maar na twee of meer contacten.
LET OP: Er waren 30 herhalingen voor elke hier beschreven combinatie.
- Wanneer de afstand tussen twee individuen is dan de lichaamslengte, eens een contact voorbij. Voor één repliceren, opnemen P 100% bij copulatie is waargenomen onmiddellijk na het eerste contact, zonder onderbreking, of 0,00% indien er geen copulatie werd waargenomen of als er copulatie maar na twee of meer contacten.
- Bereid een naald voor het oppakken van aaltjes door het tekenen van een glazen capillaire na verhitting het over een alcohol brander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De paring succespercentage (R) van maagdelijke volwassenen bedroeg 86,67% gemiddeld, die aanzienlijk hoger is dan die van de willekeurig geselecteerde volwassenen bedroeg: 13,33 ± 4,65% (V = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figuur 2). Deze bevinding suggereert dat het gemakkelijker is om de paring gedrag van B. xylophilus met Virgin volwassenen dan met willekeurig geselecteerde volwassenen nemen.
Wanneer een mannetje was gepaard met een vrouwtje, de gehele paring proces duurde 82,8 minuten gemiddeld. Het hele proces kan worden beschreven door vier verschillende fasen: het zoeken, contact op te nemen, copuleren, en slepende. De duur van deze vier fasen waren 21,8 ± 2,0 min 28,0 ± 1,9 min 25,8 ± 0,7 min en 7,2 ± 0,5 min, respectievelijk (figuur 3). In een recente publicatie beschreven we de 11 sub-gedragingen als het kruisen, naderen, encountering, ontroerende, hooping, het opsporen, het bevestigen, ejaculeren, het scheiden, rust, en roaming 9.
Wanneer een mannetje gelijktijdig met twee of meer vrouwelijke, mannelijke leek willekeurig paren met één van hen, zonder selectie. Er werd echter voor de hand liggende keuze paring waargenomen voor vrouwelijke B. xylophilus. Wanneer een vrouw in contact met een man, de vrouw de neiging om het mannetje hoofd, lichaam, staart, en genitale regio zachtjes aanraken met haar hoofd en leek te evalueren van haar potentiële partner. Als het vrouwtje niet de man heeft aanvaard, het vrouwtje liet hem snel en zwom naar een andere man voor de volgende evaluatie. Een van de mannen werd vervolgens geselecteerd door het vrouwtje om te paren. Paring slagingspercentages na het eerste contact (P) van de 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ en 1♀ + 3♂ combinaties waren 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4% en 23,4 ± 7,4%, respectievelijk, en de verschillen tussen hen were significant (F = 8,21, df = 2, p = 0,0124) (Figuur 4).
Intraseksuele wedstrijd werd waargenomen bij zowel mannen als vrouwen. Wanneer een maagdelijke vrouwelijke werd gemengd met 3 maagdelijke mannetjes, de mannetjes probeerden te benaderen en het vrouwelijke contact zoveel mogelijk de kans op paring met haar te krijgen. Toen de vulva werd bezet door een man, de andere mannetjes geprobeerd om de paring mannelijke verstoren door het gebruik van gewelddadige lichaam schommels of te slepen om ze te scheiden. Vrouw intraseksuele concurrentie werd gezien min of meer vergelijkbaar met mannelijke intraseksuele concurrentie te zijn.
Paring succes vooral afhankelijk van het vrouwtje. Wanneer een vrouw accepteerde een man, de man bewoog langzamer en gekrulde of zelfs vormden een hoepel, en de vrouwelijke naar voren actief om het gemakkelijker maken voor de man naar haar vulva te lokaliseren en om interferentie van andere mannetjes te vermijden. Als een vrouw niet een man heeft aanvaard,de vrouw probeerde hem af te schudden, zelfs als de man had gemonteerd en geplaatst zichzelf door haar vulva. Vanwege de intraseksuele concurrentie, copulatie frequenties van de 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ en 1♀ + 3♂ combinaties waren 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 en 1,83 ± 0,074, respectievelijk, en de verschillen tussen hen waren significant (F = 14,50, df = 2, p = 0,0001) (Figuur 5).
In ons onderzoek, de duur paring varieerde sterk, met een minimum van 20 s en een maximum van 42 min. Volgens onze gegevens kan de duur van de paring duidelijk worden onderscheiden in twee groepen: kortdurende paringen, die minder dan 5 minuten duurde en langdurige paringen die langer duurt dan 10 minuten. Duidelijke verschillen waargenomen tussen de verschillende groepen van de gemiddelde duur van de korte termijn copulatie (F = 3,81, df = 2; p (F = 179,52, df = 2, p = 0,0001), en alle copulaties (F = 2,93, df = 2, p = 0,0367) (Figuur 6).
Figuur 1: genitaliën van Mannelijke en Vrouwelijke B. Xylophilus. (A) spicule van mannelijke (blauwe pijl). (B) vulva van de vrouwelijke (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het koppelen slagingspercentage van Virgin volwassen koppels en willekeurig geselecteerde volwassen koppels van B. xylophilus. De berekende gemiddelde waarden van 30 duplo's. De verticale balk tonenis de standaard fout. De verschillende kleine letters geven significante verschillen bij p <0,05 in vergelijking met Tukey's test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Duur van de 4 fasen in de Mating Proces van B. xylophilus. De berekende gemiddelde waarden van 30 duplo's. De verticale balk geeft de standaard fout. De verschillende kleine letters geven significante verschillen bij p <0,05 in vergelijking met Tukey's test. De gemiddelde duur van de fase copulerende 25,80 ± 0,71 min, wat 31,17% van de gehele paring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijkenure.
Figuur 4: Het koppelen Succes voor het eerste contact van B. xylophilus. De berekende gemiddelde waarden van 30 herhalingen ± SE. Middelen met dezelfde kleine letter in elke kolom zijn niet significant verschillend bij P <0,05 in vergelijking met eerlijke Significant Difference Tukey's test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Copulation Frequentie van B. xylophilus in verschillende groepen. De berekende gemiddelde waarden van 30 herhalingen ± SE. Middelen met dezelfde kleine letter zijn niet significant verschillend bij P <0,05 wanneer compingared door Honest Significant Difference-test Tukey's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Copulation Duur van B. xylophilus. Middelen met dezelfde kleine letter binnen elke set van kolommen zijn niet significant verschillend bij P <0,05 in vergelijking met Honest Significant Difference-test Tukey's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behavioral tests zijn een fundamenteel aspect van de chemische ecologie, neurobiologie, moleculaire biologie en genetica. Nematoden, met name C. elegans, worden veelvuldig gebruikt voor onderzoek op dit gebied. Het paargedrag van C. elegans is eerder 10-11 onderzocht. Echter, B. xylophilus gonochoristic en verschillend van de tweeslachtige C. elegans en de paring heeft verschillende gedragskenmerken 9. Onlangs heeft het paargedrag van Bursaphelenchus okinawaensis, een tweeslachtig zus soorten B. xylophilus, werd gemeld 12. Hoewel verschillende experimentele methoden werden gebruikt, dit hermafrodiete soort toonde vergelijkbare sekse aantrekkingskracht B. xylophilus, en tussen species aantrekkingskracht tussen hen werd waargenomen. Deze hermafrodiete zuster soort kan worden gebruikt als een model voor verder onderzoek naar de biologie van Bursaphelenchus voeren.
Dit protocol voorziet in een richtlijn over hoe om te observeren en onderzoeken van de gedragskenmerken van B. xylophilus tijdens de paring. Onze resultaten toonden dat bij gebruik van primaire volwassen nematoden essentieel is voor het verhogen van de kans op succes waarnemen van de paring (Figuur 1). Het verkrijgen van J4 larven en hun geslachten precies te onderscheiden zijn twee belangrijke fundamentele stappen voor de overname van Virgin volwassenen. Onder onze experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld bij 25 ° C in het donker), de periode van 52 uur is de juiste tijd om J4 verkrijgen van J2 larven. Echter, het onderscheiden van seks in een vroeg stadium J4 meestal afhankelijk van persoonlijke ervaring. Om de nauwkeurigheid te waarborgen, is het noodzakelijk dat verschillende mensen nogmaals controleren of het geslacht toewijzing.
De gedragskenmerken van B. xylophilus tijdens de paring kan kwalitatief worden beschreven als kwantitatief geanalyseerd door het opnemen van de duur van de vier verschillenent fasen, het percentage paarsucces na eerste contact copulatie frequentie en de duur van copulatie verschillende combinaties. Interessant is dat voor de eerste keer zagen we paring keuze door vrouwen en sterke intraseksueel concurrentie in zowel mannen als vrouwen. Geen promiscuïteit werd waargenomen; maar dit kan vanwege het beperkte aantal nematoden die in ons onderzoek. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor het onderzoeken van het paringsgedrag van B. xylophilus, maar het kan ook nuttig en waardevol als een referentie voor andere nematoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Zhu en Liqun Bai eveneens bijgedragen aan dit werk. Dit werk werd financieel ondersteund door het speciaal fonds voor de bosbouw Wetenschappelijk Onderzoek in het algemeen welzijn (201204501) en de National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 en 31570638). Wij danken Dr. Holighaus Gerrit en Dr. Danielle Hickford voor hun nuttige suggesties over Engels schrijven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
