Abstract
Ein Verfahren zur Beobachtung und das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus Quantifizierung wurde unter einem Stereomikroskop etabliert. Um die Paarungseffizienz von B. Xylophilus verbessern und die Chancen der Paarung Beobachtung zu erhöhen, waren virgin Erwachsene kultiviert und verwendet für die Untersuchung. Die Eier wurden, indem sie die Nematoden in Wasser erhalten und damit die Weibchen für 10 min Eier zu legen. Die zweite Stufe Jugendliche (J2) wurden im Dunkeln, und die frühe J4 erhalten wurden bei 25 ° C für 24 h durch Inkubation der Eier synchronisiert durch die J2 Kultivierung mit Grauschimmel Botrytis cinerea, für eine weitere 52 h. Zu diesem Zeitpunkt konnten die meisten J4 Nematoden klar unterschieden werden als männlich oder weiblich ist, ihre Genital Morphologie verwendet wird. Die männlichen und weiblichen J4 wurden gesammelt und kultiviert getrennt in zwei verschiedenen Petrischalen für 24 h virgin erwachsenen Nematoden zu bekommen. Eine Jungfrau männliche und eine jungfräuliche Weibchen wurden in einem Tropfen wat gepaarter in die Vertiefung einer konkaven Folie. Das Paarungsverhalten wurde mit einem Videorecorder unter einem Stereomikroskop gefilmt. Die ganze Periode des Paarungsprozesses war 82,8 ± 3,91 min (Mittelwert ± SE) und konnte in 4 verschiedene Phasen unterteilt werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die mittleren Minuten Dauer waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 und 7,2 ± 0,5. Elf Unter Verhaltensweisen wurden beschrieben: kreuzen, nähern, begegnen, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming. Interessanterweise offensichtlich intra sexuellen Wettbewerb wurde beobachtet, wenn ein Weibchen mit 3 Männchen oder ein Männchen mit drei Frauen gruppiert wurde. Dieses Protokoll ist nützlich und wertvoll, nicht nur das Paarungsverhalten von B. xylophilus bei der Untersuchung, sondern auch als Referenz für ethologischer Studien anderer Nematoden in wirken.
Protocol
1. Erwerb von Virgin Adult Nematoden
- Pinewood Nematoden - Isolat und Kulturbedingungen
Hinweis: Um die B. xylophilus isolieren Nxy61 ursprünglich von einem erkrankten Pinus massoniana im Ningbo Gebiet der Provinz Zhejiang in China extrahiert wurde.- Bereiten Sie Kartoffel - Dextrose - Agar (PDA, siehe Tabelle der Materialien) Platten für den Anbau von Botrytis cinerea.
- Zur Inokulation ein Stück Pilz-Matte mit einem Durchmesser von 10 mm aus einem B. cinerea Matte Punsch und es in der Mitte eines neuen PDA - Platte setzen. Kultur der B. cinerea für 5 d bei 25 ° C im Dunkeln.
- Kultur die pinewood Nematoden in die vorbereitete Petrischale mit B. cinerea bei 25 ° C im Dunkeln.
- Erwerb von B. xylophilus Eier
- Legen Sie eine geklemmt Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie die vorbereiteten Trichter in einem Rack die zusammenBaermann Trichtervorrichtung. Platzieren zwei Schichten von Filterpapier anstelle von Gaze in den Mund des Trichters.
- Übertragen Sie die Pilzkulturen auf den Trichter Setup und Wasser hinzufügen, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Warten Sie 2 h, und Nematoden aus der Pilzkultur herauskommen wird, kreuzen Sie das Filterpapier, und sich in den untersten Teil des Baermann-Trichter nach unten.
- Sammeln Sie die ersten paar Tropfen Wasser aus dem Boden des Röhrchens in ein 15 ml-Röhrchen und sammeln Nematoden langsam auf dem Rohr die Klemme freigegeben wird.
- Zentrifugieren Sie die oben Sammlungen bei 3000 × g für 2 min bei RT.
- Entfernen Sie die obere Schicht aus Wasser mit einer Pipette und resuspendieren es mit 1 ml sterilem doppelt destilliertem (dd) H 2 O.
- Mit einer Pipette die oben Aufwirbelung auf ein neues Glas-Petrischale (6 cm Durchmesser). 3 ml steriler dd H 2 O in die Petrischale , um sicherzustellen , dass die Nematoden frei schwimmen können.
- Halten Sie die Nematoden im Glass Petri bei 25 ° C im Dunkeln für 10 min Schale. Eier werden von schwangeren Frauen gelegt werden. Aufgrund ihrer Glykoprotein Oberfläche, klebt die Eier an der Unterseite der Glaspetrischale.
- Entfernen Sie das Wasser und Würmer vorsichtig, ohne die Eier zu stören. 3 ml steriler dd H 2 O auf die Glaspetrischale unmittelbar um die Eier zu verhindern , vor dem Austrocknen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3x zu entfernen Sie alle Larven und Erwachsene, und erhalten die reinen Eier. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml (5 ml insgesamt) steriler dd H 2 O zu der Petrischale.
- Der Erwerb der vierten Stufe Jugendlichen (J4 Larven)
- Hatch die gesammelten Eier für 24 h im Dunkeln bei 25 ° C J2 Larven zu erhalten.
- Übertragen Sie die J2-Larven mit einer Pipette in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 3000 × g für 2 min, und entfernen Sie die obere Wasserschicht.
- Resuspendieren J2 - Larven mit 200 ul steriler dd H 2 O, und dann übertragen zudie PDA - Platte B. cinerea enthält.
- Kultur der J2-Larven für 52 h bei 25 ° C im Dunkeln. Zu diesem Zeitpunkt werden die meisten J2-Larven in der frühen Phase der J4 Larven entwickelt.
- Erwerb von nativem erwachsenen Nematoden
- Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird.
HINWEIS: Die Spitze dieses Kapillarnadel benötigt normalerweise 50 & mgr; m im Durchmesser sein, etwa der Körperbreite eines erwachsenen Nematoden, so daß sie als Werkzeug zum Aufnehmen eines einzelnen Nematoden verwendet werden kann. - Bauen Sie eine Baermann-Trichter und extrahieren Nematoden aus den Pilzkulturen für 2 h, wie 1.2.1 in den Schritten - 1.2.3.
- Übertragen Sie die J4 mit Wasser in eine saubere Petrischale.
- Beachten Sie die Nematoden unter einem Stereomikroskop und zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen von Genitalmorphologie, wie von Mamiya und Kiyohara 8 (Abbildung 1 HINWEIS: Es gibt mehr Frauen als Männer, wobei der Anteil der Frauen bei 60 bis 70%. Die weibliche Vulva ist offensichtlich von dem männlichen spicule. Im Vergleich zu den Erwachsenen ist die spicule oder Vulva in der Frühphase J4 kleiner, aber sie können immer noch leicht zu erkennen und zu unterscheiden. Die Nematoden bewegt sich immer im Wasser, die manchmal die Schwierigkeit erhöht sich bei Männern und Frauen unterscheiden.
- Kultur der J4 Larven für weitere 24 h bei 25 ° C im Dunkeln.
Hinweis: Alle Nematoden zu Erwachsenen entwickeln sollte, aber da sie nicht zusammengefügten sind, werden sie als Jungfrau Erwachsene angesehen. - Montieren Sie zwei Baermann-Trichter und extrahieren Sie die jungfräuliche Erwachsene aus den Pilzkulturen für 2 h, wie in den Schritten 1.2.1 - 1.2.3, und übertragen Sie die Jungfrau erwachsenen Männern und Frauen in zwei getrennte, saubere Petrischalen.
2. Beobachtung und Videoaufzeichnung von Paarungsverhalten
- Bereiten Sie mehrere konkave Dias und mit 200 & mgr; l sterilem dd H 2 O zu jedem ihrer Brunnen.
- Pick-up die vorbereitete Jungfrau erwachsenen männlichen oder weiblichen und mit einer Kapillare Nadel und stellen nur eine Nematode in das Wasser jedes konkaven Folie.
- Halten Sie die Jungfrau Erwachsene im Inneren des gut 1 h, damit sie auf die neue wässrige Umgebung anzupassen.
- Paar eine Jungfrau männlich und weiblich von einem von ihnen von einer Vertiefung zur anderen zu übertragen mit einer Pipette.
- Beobachten Sie das Paarungsverhalten der 1♀ + 1♂ Kombination in der konkaven Objektträger unter einem Stereomikroskop.
- Um die Paarungseffizienz von nativem Erwachsene analysieren, berechnen ihre Paarungserfolgsrate (R) und vergleichen Sie es mit dem von zufällig ausgewählten Erwachsenen-Paare. Berechnen R als der Prozentsatz von Replikaten in denen Kopulation beobachtet wurde, verglichen mit der Gesamtzahl der untersuchten Replikaten.
- Um Daten für die qualitative und quantitative Analyse zu sammeln, zu filmen das Paarungsverhalten Videomikroskopie. Normalerweise, wenn die ganze Paarungsprozess, von der Zeit, die Nematoden in der Vertiefung des konkaven Schlitten auf den Moment gestellt werden, wenn sie weg nach der Kopulation bewegen, wird innerhalb von 2 h abgeschlossen. Daher nehmen Sie das passende Verfahren kontinuierlich für mindestens 2 h als eine Replikation. Komplette mindestens 30 Wiederholungen insgesamt für jede Kombination.
HINWEIS: In steriler dd H 2 O ( in der Regel 50 & mgr; l) alle 0,5 h auf die gut für die Verdampfung während des Aufzeichnungsprozesses zu kompensieren.
3. Datenerfassung
- Alle Videos sorgfältig auf einem Computer-Bildschirm und zeichnen die Unter Verhaltensweisen qualitativ.
- Messen Sie die Dauer der Paarung mit the Frame-by-Frame-Funktion des Videorecorders. Manuell subtrahieren von dem Endpunkt der Startzeit.
- Für die 1♀ + 1♂ Kombination, analysieren jede Videoaufzeichnung und messen die Dauer der folgenden Ereignisse:
- Messen Sie die Dauer der Suche (dh die Zeit aus , wenn die weiblichen und männlichen sind in den Brunnen des konkaven Schlitten eingeführt zu dem Moment , sie begegnen und einander berühren).
- Messen der Dauer des In- Kontakt (dh die Zeit vom ersten Kontakt bis zu dem Moment , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist zum ersten Kopulation).
- Messen der Dauer der Kopulation (dh die Zeit von , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist , bis er aus dem weiblichen Körper nach der Ejakulation gleitet nach unten). Hinweis: Einige Nematoden mehrmals in 2 h kopulieren können. In solchen Fällen messen die Dauer der Kopulation von der ersten Kopulation bis zum Ende des last ein, einschließlich der Zeit dazwischen.
- Messen Sie die Dauer des Verweilens (dh die Zeit nach der Kopulation , bis die männlichen und weiblichen Bad voneinander entfernt und sind durch einen Abstand von mehr als der Nematoden Körperlänge ( in der Regel 1 mm) getrennt).
- Zählen Sie die Kopulation Häufigkeit und Dauer jeder Kopulation und die durchschnittliche Dauer aller Paarungen in 2 h für jede der verschiedenen Kombinationen (dh 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂).
- Berechne den Paarungserfolgsrate für den ersten Kontakt (P) für die verschiedenen Kombinationen als die Erfolgsrate der Paarung nach dem ersten Kontakt, der unmittelbar und ohne Unterbrechung durchgeführt wird. In der Kontaktphase kann mehrere Kontakte vor der eigentlichen Kopulation beobachtet werden.
- Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte.
HINWEIS: Es wurden 30 Wiederholungen für jede Kombination hier beschrieben.
- Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte.
- Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Paarungserfolgsrate (R) von nativem Erwachsenen war 86,67% im Durchschnitt, was die deutlich höher war als der zufällig ausgewählten Erwachsenen: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Abbildung 2). Dieser Befund legt nahe , dass es einfacher ist , das Paarungsverhalten von B. xylophilus mit nativem Erwachsenen als bei zufällig ausgewählten Erwachsenen zu beobachten.
Wenn ein Männchen mit einem Weibchen gepaart wurde, dauerte die gesamte Paarung 82,8 min im Durchschnitt. Der gesamte Prozess könnte durch vier verschiedene Phasen beschrieben werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die Dauer für diese vier Phasen waren 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min und 7,2 ± 0,5 min (Abbildung 3). In einer kürzlich erschienenen Publikation beschrieben wir die 11 Unter Verhaltensweisen wie Kreuzen, nähern, encountering, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming - 9.
Wenn ein Männchen erfüllt zwei oder mehr Weibchen gleichzeitig schien die männlichen zufällig zu paaren mit einem von ihnen, ohne Selektion. Es wurde jedoch offensichtlich Paarung Wahl für weibliche B. xylophilus beobachtet. Wenn eine Frau, die einen männlichen Kontakt, neigten die Weibchen das Männchen Kopf, Körper, Schwanz und Genitalbereich sanft mit dem Kopf zu berühren und erschien ihr potentieller Partner zu evaluieren. Wenn die Frau nicht das männliche akzeptieren, verließ die Frau ihn schnell und schwamm für die nächste Auswertung zu einem anderen Mann. Einer der Männchen zur Paarung wurde dann durch das weibliche ausgewählt. Mating Erfolgsraten nach dem ersten Kontakt (P) von der 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂ Kombinationen waren 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4% und 23,4 ± 7,4% bzw. und die Unterschiede zwischen ihnen were signifikant (F = 8.21, df = 2, P = 0,0124) (Abbildung 4).
Intra Wettbewerb wurde in beiden Männchen und Weibchen beobachtet. Wenn eine jungfräuliche Weibchen mit 3 Jungfrau Männer gemischt wurde, versuchten die Männchen das Weibchen so viel wie möglich zu nähern und kontaktieren Sie die Chance, mit ihrer Paarung zu bekommen. Wenn der Vulva durch ein Männchen besetzt war, versuchten die anderen Männchen durch die Verwendung heftigen Körper schwingt die Paarung Männchen zu stören oder zu ziehen, sie zu trennen. Weiblich intra Wettbewerb wurde gesehen mehr oder weniger ähnlich wie männliche intra Wettbewerb zu sein.
Paarungserfolg vor allem auf die weibliche abhing. Wenn eine Frau, die einen männlichen akzeptiert, zog der Mann langsamer und gewellt oder gebildet sogar einen Reifen, und das Weibchen nach vorne bewegt, sich aktiv für die es leichter machen das Männchen ihre Vulva zu lokalisieren und zu Störungen von anderen Männchen zu vermeiden. Wenn eine Frau nicht akzeptieren, einen männlichen,die Frau versuchte, ihn abzuschütteln, auch wenn das Männchen bestiegen hatte und positioniert sich durch ihre Vulva. Aufgrund der intra Wettbewerbs Kopulation Frequenzen des 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂ Kombinationen waren 1,43 ± 0,091 1,17 ± 0,074 und 1,83 ± 0,074, bzw., und die Unterschiede zwischen ihnen waren signifikant (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (Abbildung 5).
In unserer Untersuchung variierte die Dauer der Kopulation mit einem Minimum von 20 s und maximal 42 min stark. Kurzzeit-Paarungen, die weniger als 5 min dauerte, und langfristige Paarungen, die länger als 10 min dauerte: Nach unseren Daten könnte die Dauer der Kopulation offensichtlich in zwei Gruppen unterschieden werden. Offensichtliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen für die durchschnittliche Dauer der kurzfristigen Kopulation (F = 3,81, df = 2, P beobachtet (F = 179.52, df = 2, P = 0,0001), und alle Paarungen (F = 2.93, df = 2, P = 0,0367) (Abbildung 6).
Abbildung 1: Genitalien von männlichen und weiblichen B. Xylophilus. (A) spicule der männlichen (blauer Pfeil). (B) Vulva der weiblichen (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Mating Erfolgsrate von Virgin für erwachsene Paare und Randomly Ausgewählte für erwachsene Paare von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen. Der vertikale Balken zeigens der Standardfehler. Die verschiedenen Kleinbuchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P <0,05, wenn sie von Tukey-Test verglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Dauer der 4 Phasen in der Paarung von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen. Der vertikale Balken zeigt den Standardfehler. Die verschiedenen Kleinbuchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P <0,05, wenn sie von Tukey-Test verglichen. Die durchschnittliche Dauer der kopulierenden Phase ist 25,80 ± 0,71 min, was 31,17% des gesamten Paarung ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses Bild zu sehenure.
Abbildung 4: Paarungserfolg für den ersten Kontakt von B. xylophilus. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen ± SE. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben in jeder Spalte sind nicht signifikant verschieden bei P <0,05, wenn sie von Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied Test verglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Kopulation Häufigkeit von B. xylophilus in verschiedenen Gruppen. Die berechneten Mittelwerte aus 30 Wiederholungen ± SE. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben unterscheiden sich nicht signifikant bei p <0,05 als compared durch Test Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Kopulation Dauer von B. xylophilus. Mittel mit demselben Kleinbuchstaben innerhalb jeder Gruppe von Spalten unterscheiden sich nicht signifikant bei p <0,05, wenn sie von Tukey-Ehrlich signifikanten Unterschied Test verglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verhaltenstests sind ein grundlegender Aspekt der chemischen Ökologie, Neurobiologie, Molekularbiologie und Genetik. Nematoden und insbesondere C. elegans, sind für ein Studium in diesen Bereichen intensiv genutzt. Das Paarungsverhalten von C. elegans wurde zuvor 10-11 untersucht. Allerdings ist B. xylophilus gonochoristic und unterscheidet sich von den Zwitter C. elegans und seine Paarung hat verschiedene Verhaltensmerkmale 9. Vor kurzem wurde das Paarungsverhalten von Bursaphelenchus okinawaensis, Zwitter - Schwesterarten von B. xylophilus, 12 berichtet. Obwohl verschiedene experimentelle Methoden verwendet wurden, zeigten diese Zwitter Spezies ähnlich Geschlecht Attraktion B. xylophilus, und Interspezies-Anziehung zwischen ihnen beobachtet. Diese Zwitterschwesterarten könnten als Modell verwendet werden , weitere Untersuchungen über die Biologie von Bursaphelenchus zu führen.
Dieses Protokoll bietet einen Leitfaden, wie Sie die Verhaltensmerkmale von B. zu beobachten und zu untersuchen xylophilus während der Paarung. Unsere Ergebnisse zeigten , dass virgin erwachsenen Nematoden unter Verwendung kritisch ist die Wahrscheinlichkeit erfolgreich zur Erhöhung des Paarungsprozesses (Abbildung 1) beobachten. J4 Larven Gewinnung und genau zu unterscheiden, ihre Geschlechter sind zwei wichtige Grundschritte für den Erwerb von nativem Erwachsene. Unter unseren experimentellen Bedingungen (dh bei 25 ° C im Dunkeln), die Dauer von 52 h ist die richtige Zeit von J4 J2 Larven zu erhalten. Doch am frühen J4 Stadium unterscheiden Sex hängt vor allem von persönlichen Erfahrungen. Um die Genauigkeit ist es notwendig, für verschiedene Menschen nochmals zu überprüfen, das Geschlecht Zuweisung.
Die Verhaltensmerkmale B. xylophilus während des Paarungsprozesses kann qualitativ und quantitativ durch Aufzeichnung der Dauern der vier analysierten beschrieben abweichender Prozentsatz der Paarungserfolg nach dem ersten Kontakt, der Kopulation Frequenz und die Dauer der Kopulation von verschiedenen Kombinationen ent Phasen. Interessanterweise zum ersten Mal beobachteten wir passende Wahl von Frauen und starke inner sexuellen Wettbewerb in beiden Männern und Frauen. Keine Promiskuität wurde beobachtet; Dies könnte jedoch in unserer Untersuchung verwendet, um die begrenzte Anzahl von Nematoden fällig. Dieses Protokoll kann nicht nur für die Untersuchung der Paarungsverhalten von B. xylophilus verwendet werden, aber es kann auch als Referenz für andere Nematoden nützlich und wertvoll sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Zhu und Liqun Bai trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch den Sonderfonds für Forstwirtschaft Wissenschaftliche Forschung in der öffentlichen Wohlfahrt (201204501) und der National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 und 31570638) unterstützt. Wir danken Dr. Holighaus Gerrit und Dr. Danielle Hickford für ihre hilfreichen Anregungen auf Englisch schreiben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
