Abstract
देख और पाइनवुड निमेटोड, Bursaphelenchus xylophilus के संभोग व्यवहार बढ़ाता के लिए एक विधि है, एक stereomicroscope के तहत स्थापित किया गया था। बी Xylophilus के संभोग दक्षता में सुधार करने के लिए और संभोग अवलोकन के अवसरों को बढ़ाने के लिए, कुंवारी वयस्कों सुसंस्कृत थे और जांच के लिए इस्तेमाल किया। अंडे पानी में नेमाटोड रखने और महिलाओं के 10 मिनट के लिए अंडे देना करने की अनुमति देकर प्राप्त किया गया। दूसरे चरण किशोरों (J2) अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए अंडे सेने से सिंक्रनाइज़ कर रहे थे, और जल्दी जे 4, ग्रे मोल्ड, Botrytis धूसर पदार्थ के साथ J2 संवर्धन एक और 52 घंटे के लिए द्वारा प्राप्त किया गया। इस समय बिंदु पर, सबसे J4 नेमाटोड अपने जननांग आकृति विज्ञान का उपयोग करते हुए नर हो या मादा होने के रूप में स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। पुरुष और महिला J4 एकत्र की है और 24 घंटे के लिए दो अलग अलग पेट्री डिश में अलग से सुसंस्कृत वर्जिन वयस्क नेमाटोड मिल रहे थे। एक कुंवारी पुरुष और एक कुंवारी महिला वाट की एक बूंद में रखा गयाएक अवतल स्लाइड के कुएं में इंजी। संभोग के व्यवहार एक stereomicroscope के तहत एक वीडियो रिकॉर्डर के साथ फिल्माया गया था। संभोग की प्रक्रिया की पूरी अवधि के 82.8 ± 3.91 मिनट (मतलब ± एसई) था और 4 अलग-अलग चरणों में विभाजित किया जा सकता है: खोज, संपर्क मैथुन, और सुस्त। अवधि का मतलब मिनट क्रमश: 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 और 7.2 ± 0.5। ग्यारह उप-व्यवहार का वर्णन किया गया:, मंडरा आ रहा है, सामना, छू काली, लगाने, संलग्न, ejaculating, को अलग करने, निष्क्रियता, और रोमिंग। दिलचस्प बात स्पष्ट इंट्रा-यौन प्रतियोगिता मनाया गया था जब एक महिला 3 पुरुषों या 3 महिलाओं के साथ एक पुरुष के साथ बांटा गया था। इस प्रोटोकॉल उपयोगी और मूल्यवान है, न केवल बी xylophilus के संभोग व्यवहार की जांच में, बल्कि अन्य नेमाटोड के ethological अध्ययन के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य कर रही है।
Protocol
1. वर्जिन एडल्ट नेमाटोड के अधिग्रहण
- पाइनवुड निमेटोड अलग और संस्कृति की स्थिति
ध्यान दें: बी xylophilus को अलग Nxy61 मूल रूप से चीन में झेजियांग प्रांत के Ningbo क्षेत्र में एक रोगग्रस्त Pinus massoniana से निकाला गया था।- (पीडीए सामग्री की तालिका देखें) आलू Dextrose अग्रवाल तैयार Botrytis धूसर पदार्थ उगाने के लिए प्लेटें।
- टीका के लिए, एक बी धूसर पदार्थ चटाई से 10 मिमी व्यास के साथ कवक चटाई का एक टुकड़ा पंच और एक नया पीडीए थाली के बीच में डाल दिया। संस्कृति बी अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 डी के लिए धूसर पदार्थ।
- संस्कृति अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर बी धूसर पदार्थ युक्त तैयार पेट्री डिश में पाइनवुड नेमाटोड।
- बी xylophilus अंडे का अधिग्रहण
- एक चिमनी के नीचे एक clamped रबर ट्यूब प्लेस और एक रैक को इकट्ठा करने के लिए तैयार कीप पकड़Baermann कीप तंत्र। फिल्टर पेपर के बजाय धुंध की दो परतों कीप के मुंह में रखें।
- कीप सेटअप करने के लिए कवक संस्कृतियों स्थानांतरण और जब तक फंगल चटाई डूब जाता है पानी जोड़ें। 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें, और नेमाटोड, फंगल संस्कृति से बाहर आने के लिए फिल्टर पेपर पार, और Baermann कीप के निम्नतम भाग में बसने जाएगा।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ट्यूब के नीचे से पानी की बूंदों की पहली जोड़ी को इकट्ठा करने और धीरे धीरे ट्यूब पर दबाना जारी करके नेमाटोड इकट्ठा।
- आरटी पर 2 मिनट के लिए 3,000 XG पर ऊपर संग्रह अपकेंद्रित्र।
- एक विंदुक के साथ पानी की ऊपरी परत को हटाने और बाँझ दोहरा आसुत (डीडी) के 1 एमएल एच 2 ओ के साथ यह resuspend
- एक विंदुक के साथ, एक नया कांच पेट्री डिश (6 सेमी व्यास) के लिए ऊपर मेजबान हस्तांतरण। बाँझ डीडी एच 2 ओ के 3 एमएल पेट्री डिश में जोड़े सुनिश्चित करने के लिए कि नेमाटोड स्वतंत्र रूप से तैरने में सक्षम हैं।
- glas में नेमाटोड रखेंपेट्री अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पकवान है। अंडे गर्भवती महिलाओं द्वारा रखा जाएगा। उनकी ग्लाइकोप्रोटीन सतह की वजह से, अंडे गिलास पेट्री डिश के नीचे करने के लिए रहना होगा।
- पानी और कीड़े ध्यान से निकालें, अंडे के बिना परेशान। बाहर सुखाने से अंडे को रोकने के लिए तुरंत गिलास पेट्री डिश के लिए बाँझ डीडी एच 2 ओ के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
- दोहराएँ कदम 1.2.8 3x सभी लार्वा और वयस्कों को हटाने, और शुद्ध अंडे प्राप्त करने के लिए। बाँझ डीडी एच 2 ओ के एक अतिरिक्त 2 एमएल (कुल 5 एमएल) पेट्री डिश में जोड़े।
- चौथे चरण किशोरों के अधिग्रहण (J4 लार्वा)
- हैच 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 24 घंटे के लिए एकत्र अंडे J2 लार्वा प्राप्त करने के लिए।
- J2 लार्वा 2 मिनट के लिए 3,000 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब, अपकेंद्रित्र में एक विंदुक के साथ स्थानांतरण, और पानी की ऊपरी परत को हटा दें।
- बाँझ डीडी एच 2 ओ के 200 μL के साथ J2 लार्वा Resuspend, और फिर उन्हें करने के लिए स्थानांतरणपीडीए प्लेट बी धूसर पदार्थ युक्त।
- संस्कृति J2 अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 52 घंटे के लिए लार्वा। इस समय बिंदु पर, सबसे J2 लार्वा J4 लार्वा के प्रारंभिक चरण में विकसित किया जाएगा।
- कुंवारी वयस्क नेमाटोड का अधिग्रहण
- एक शराब बर्नर पर यह हीटिंग के बाद एक गिलास केशिका ड्राइंग द्वारा नेमाटोड को चुनने के लिए एक सुई तैयार करें।
नोट: इस केशिका सुई की नोक आमतौर पर, व्यास में 50 माइक्रोन, एक वयस्क के निमेटोड का लगभग शरीर चौड़ाई होना करने के लिए इतना है कि यह एक एकल निमेटोड को चुनने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है। - एक Baermann कीप इकट्ठा और कदम 1.2.1 में वर्णित के रूप में, 2 घंटे के लिए कवक संस्कृतियों से नेमाटोड निकालने - 1.2.3।
- एक साफ पेट्री डिश में पानी के साथ J4 स्थानांतरण।
- एक stereomicroscope के तहत नेमाटोड का निरीक्षण करें और के रूप में मामिया और Kiyohara 8 (चित्रा 1 द्वारा वर्णित पुरुषों और महिलाओं के जननांग आकृति विज्ञान द्वारा बीच भेद, ध्यान दें: पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को 60 में महिलाओं के प्रतिशत के साथ कर रहे हैं, - 70%। महिला योनी जाहिर पुरुष spicule से अलग है। वयस्क की तुलना में, spicule या प्रारंभिक अवस्था में J4 योनी छोटा होता है, लेकिन वे अभी भी आसानी से देखा और प्रतिष्ठित किया जा सकता है। निमेटोड हमेशा पानी है, जो कभी कभी पुरुषों और महिलाओं के भेद में कठिनाई बढ़ जाती है में बढ़ रहा है।
- संस्कृति अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर एक और 24 घंटे के लिए J4 लार्वा।
नोट: सभी नेमाटोड वयस्कों में विकसित करना चाहिए, लेकिन जब से वे unmated हैं, वे वर्जिन वयस्कों के रूप में माना जाता है। - दो Baermann funnels इकट्ठा और कदम 1.2.1 में वर्णित के रूप में, 2 घंटे के लिए कवक संस्कृतियों से कुंवारी वयस्कों निकालने - 1.2.3, और दो अलग-अलग, स्वच्छ पेट्री डिश में कुंवारी वयस्क पुरुषों और महिलाओं के हस्तांतरण।
2. अवलोकन और संभोग व्यवहार की वीडियो रिकॉर्डिंग
- कई अवतल स्लाइड तैयार करने और उनके कुओं में से प्रत्येक के लिए बाँझ डीडी एच 2 ओ के 200 μL जोड़ें।
- एक केशिका सुई के साथ तैयार वर्जिन वयस्क पुरुष या महिला और ऊपर उठाओ और प्रत्येक अवतल स्लाइड के पानी में केवल एक निमेटोड डाल दिया।
- 1 घंटे के लिए अच्छी तरह से अंदर कुंवारी वयस्कों रखें उन्हें नए जलीय पर्यावरण के लिए अनुकूल बताने के लिए।
- अच्छी तरह से एक से उनमें से एक को स्थानांतरित करने के लिए एक और एक पिपेट का उपयोग करके एक कुंवारी पुरुष और महिला जोड़ी।
- एक stereomicroscope के तहत अवतल स्लाइड में 1♀ + 1♂ संयोजन के संभोग व्यवहार का निरीक्षण करें।
- कुंवारी वयस्कों के संभोग दक्षता का विश्लेषण करने के लिए, उनके संभोग सफलता दर (आर) की गणना और बेतरतीब ढंग से चुनी वयस्क जोड़े की उस के साथ तुलना करें। आर प्रतिकृति जिसमें शयन का अध्ययन प्रतिकृति की कुल संख्या की तुलना में मनाया गया के प्रतिशत के रूप में गणना।
- आदेश में गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए, फिल्म वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग संभोग व्यवहार। आम तौर पर, पूरे संभोग की प्रक्रिया, समय से जब नेमाटोड पल के लिए अवतल स्लाइड के कुएं में रखा जाता है जब वे शयन के बाद दूर ले जाते हैं, 2 घंटे के भीतर पूरा हो गया है। इसलिए, एक दोहराने के रूप में कम से कम 2 घंटे के लिए लगातार संभोग प्रक्रिया रिकॉर्ड है। पूरा कम से कम 30 प्रत्येक संयोजन के लिए कुल में दोहराता है।
नोट: अच्छी तरह से करने के लिए और अधिक बाँझ डीडी एच हर 0.5 घंटे जोड़े 2 ओ (आमतौर पर 50 μL) रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया के दौरान वाष्पीकरण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए।
3. डेटा संग्रह
- एक कंप्यूटर स्क्रीन पर ध्यान से सभी वीडियो देखें और गुणात्मक उप-व्यवहार को चिह्नित।
- संभोग का उपयोग कर वीं की अवधि के उपायई फ्रेम-दर-फ्रेम वीडियो रिकॉर्डर का कार्य करते हैं। मैन्युअल अंत बिंदु से शुरू समय घटाना।
- 1♀ + 1♂ संयोजन के लिए, प्रत्येक वीडियो रिकॉर्डिंग का विश्लेषण और निम्न इवेंट की अवधि के उपाय:
- खोज की अवधि के उपाय (यानी, जब महिला और पुरुष क्षण वे मुठभेड़ के लिए अवतल स्लाइड के कुएं में शुरू की है और एक दूसरे से संपर्क कर रहे हैं से समय)।
- संपर्क करने की अवधि उपाय (यानी, पल के लिए पहला संपर्क में आने से समय जब पुरुष ठीक पहले शयन के लिए महिला की योनी में तैनात है)।
- मैथुन की अवधि के उपाय (यानी, जब पुरुष ठीक महिला की योनी पर तैनात है, जब तक वह स्खलन के बाद महिला के शरीर से नीचे स्लाइड से समय)। नोट: कुछ नेमाटोड में 2 घंटे में कई बार मैथुन कर सकते हैं। ऐसे मामलों में, लास का अंत करने के लिए पहले से शयन शयन की अवधि को मापनेटी एक है, के बीच में समय शामिल है।
- सुस्त की अवधि के उपाय (यानी, शयन के बाद की अवधि एक दूसरे से दूर पुरुष और महिला तैरना और नेमाटोड 'शरीर की लंबाई से अधिक की दूरी से अलग हो रहे हैं जब तक (आमतौर पर 1 मिमी))।
- गणना शयन आवृत्ति और हर शयन की अवधि और औसत विभिन्न संयोजनों से प्रत्येक के लिए 2 घंटे में सब copulations की अवधि (यानी, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, और 1♀ + 3♂)।
- पहले से संपर्क करें, जो तुरंत और बिना किसी ब्रेक के बाद आयोजित किया जाता है संभोग की सफलता दर के रूप में विभिन्न संयोजनों के लिए पहले से संपर्क करें (पी) के लिए संभोग सफलता की दर की गणना। संपर्क चरण में कई संपर्कों वास्तविक शयन से पहले मनाया जा सकता है।
- जब दो व्यक्तियों के बीच की दूरी शरीर की लंबाई की तुलना में अधिक है, से अधिक है करने के लिए एक संपर्क पर विचार करें। एक दोहराने, रिकॉर्ड पी 100% के रूप में जब मैं शयन के लिएपहले से संपर्क के बाद तुरंत मनाया, ब्रेक के बिना, या 0.00% अगर कोई शयन मनाया गया या यदि वहाँ शयन लेकिन दो या दो से अधिक संपर्क के बाद किया गया।
नोट: यहाँ वर्णित प्रत्येक संयोजन के लिए 30 प्रतिकृति थे।
- जब दो व्यक्तियों के बीच की दूरी शरीर की लंबाई की तुलना में अधिक है, से अधिक है करने के लिए एक संपर्क पर विचार करें। एक दोहराने, रिकॉर्ड पी 100% के रूप में जब मैं शयन के लिएपहले से संपर्क के बाद तुरंत मनाया, ब्रेक के बिना, या 0.00% अगर कोई शयन मनाया गया या यदि वहाँ शयन लेकिन दो या दो से अधिक संपर्क के बाद किया गया।
- एक शराब बर्नर पर यह हीटिंग के बाद एक गिलास केशिका ड्राइंग द्वारा नेमाटोड को चुनने के लिए एक सुई तैयार करें।
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Representative Results
कुंवारी वयस्कों के संभोग सफलता दर (आर) औसतन 86.67% थी, जो था बेतरतीब ढंग से चुनी वयस्कों की तुलना में काफी अधिक: 13.33 ± 4.65% (एफ = 1301.71, DF = 1, पी = 0.0001) (चित्रा 2)। यह निष्कर्ष बताते हैं कि यह आसान है बी के xylophilus बेतरतीब ढंग से चुनी वयस्कों के साथ तुलना वर्जिन वयस्कों के साथ संभोग के व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए।
एक पुरुष एक महिला के साथ रखा गया था, पूरे संभोग प्रक्रिया औसतन 82.8 मिनट तक चली। पूरी प्रक्रिया में चार अलग-अलग चरणों द्वारा वर्णित किया जा सकता है: खोज, संपर्क, मैथुन, और सुस्त। इन चार चरणों के लिए अवधि 21.8 ± 2.0 मिनट, 28.0 ± 1.9 मिनट, 25.8 ± 0.7 मिनट, और 7.2 ± 0.5 मिनट, क्रमशः (चित्रा 3) थे। हाल ही में एक प्रकाशन में, हम, मंडरा आ रहा है, encounteri के रूप में 11 उप-व्यवहार में वर्णितएनजी, छू, काली, लगाने, संलग्न ejaculating, अलग निष्क्रियता है, और 9 घूम।
जब एक पुरुष दो या दो से अधिक महिलाओं को एक साथ मुलाकात की, पुरुष किसी भी चयन बिना उनमें से एक के साथ बेतरतीब ढंग से दोस्त के लिए लग रहा था। हालांकि, स्पष्ट संभोग पसंद मादा बी xylophilus के लिए मनाया गया। एक महिला एक पुरुष से संपर्क किया है, मादा उसके सिर के साथ धीरे पुरुष के सिर, शरीर, पूंछ, और जननांग क्षेत्र को छूने के लिए जाती थी और उसके संभावित साथी का मूल्यांकन किया जा दिखाई दिया। महिला पुरुष को स्वीकार नहीं किया, तो उसे जल्दी से महिला को छोड़ दिया और अगले मूल्यांकन के लिए एक और पुरुष के लिए तैरा। पुरुषों में से एक तो संभोग के लिए महिला द्वारा चयनित किया गया था। की पहले से संपर्क करें (पी) के बाद सफलता दर संभोग 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, और 1♀ + 3♂ संयोजन 46.7 ± 9.3%, 80.0 ± 7.4%, और 23.4 ± 7.4%, क्रमशः थे, और उन दोनों के बीच मतभेद werई महत्वपूर्ण (एफ = 8.21, DF = 2, पी = 0.0124) (चित्रा 4)।
Intrasexual प्रतियोगिता पुरुषों और महिलाओं दोनों में मनाया गया। एक कुंवारी महिला 3 वर्जिन पुरुषों के साथ मिलाया गया था, जब पुरुषों के दृष्टिकोण और उसके साथ संभोग का मौका पाने के लिए जितना संभव हो उतना महिला से संपर्क करने की कोशिश की। जब योनी एक पुरुष द्वारा कब्जा कर लिया गया था, दूसरे पुरुषों हिंसक शरीर झूलों का उपयोग कर या उन्हें अलग करने के लिए खींचकर संभोग पुरुष को परेशान करने की कोशिश की। महिला intrasexual प्रतियोगिता कम या ज्यादा पुरुष intrasexual प्रतियोगिता के लिए इसी तरह देखा जा रहा था।
संभोग सफलता मुख्य रूप से महिला पर निर्भर करता था। एक महिला एक पुरुष को स्वीकार कर लिया है, पुरुष और धीरे धीरे चले गए और कर्ल करवाने या यहां तक कि एक घेरा गठन किया है, और महिला सक्रिय रूप से आगे ले जाया यह आसान पुरुष उसे योनी पता लगाने के लिए और अन्य पुरुषों से हस्तक्षेप से बचने के लिए बनाने के लिए। एक महिला एक पुरुष को स्वीकार नहीं किया,महिला उसे हिला करने की कोशिश की है, भले ही पुरुष मुहिम शुरू की थी और उसे योनी से खुद को तैनात। intrasexual प्रतिस्पर्धा के कारण, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ के शयन आवृत्तियों, और 1♀ + 3♂ संयोजन 1.43 ± 0.091, 1.17 ± 0.074 और 0.074 ± 1.83, क्रमशः थे, और उन दोनों के बीच मतभेद थे महत्वपूर्ण (एफ = 14.50, DF = 2, पी = 0.0001) (चित्रा 5)।
हमारी जांच में, शयन अवधि 20 एस की एक न्यूनतम और 42 मिनट की एक अधिकतम के साथ बहुत विविध। अल्पकालिक copulations है, जो कम से कम 5 मिनट तक चली, और लंबी अवधि के copulations, जो 10 मिनट से अधिक समय तक चली: हमारे आंकड़ों के अनुसार, शयन की अवधि स्पष्ट रूप से दो समूहों में भेदभाव किया जा सकता है। स्पष्ट मतभेद, लघु अवधि के शयन (एफ = 3.81 की औसत अवधि के लिए विभिन्न समूहों के बीच मनाया गया DF = 2, पी (एफ = 179.52, DF = 2, पी = 0.0001), और सभी copulations (एफ = 2.93, DF = 2, पी = 0.0367) (चित्रा 6)।
चित्रा 1: पुरुष और महिला बी Xylophilus के जननांग। (क) पुरुष (नीले तीर) के spicule। (ख) महिला (लाल तीर) की योनी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: की वर्जिन एडल्ट युगल संभोग सफलता दर और बी xylophilus के बेतरतीब ढंग से चुनी प्रौढ़ जोड़े। गणना मतलब मूल्यों 30 प्रतिकृति से हैं। ऊर्ध्वाधर बार शोमानक त्रुटि है। विभिन्न छोटे अक्षरों पी <0.05 पर महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत मिलता है जब Tukey के परीक्षण के द्वारा की तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: बी xylophilus की संभोग की प्रक्रिया में 4 चरणों की अवधि। गणना मतलब मूल्यों 30 प्रतिकृति से हैं। ऊर्ध्वाधर बार मानक त्रुटि से पता चलता है। विभिन्न छोटे अक्षरों पी <0.05 पर महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत मिलता है जब Tukey के परीक्षण के द्वारा की तुलना में। मैथुन चरण की औसत अवधि 25.80 ± 0.71 मिनट, पूरे संभोग की प्रक्रिया का 31.17% है जो है। इस अंजीर का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंUre।
चित्रा 4: के लिए बी xylophilus के पहले संपर्क संभोग सफलता। गणना मतलब मूल्यों एसई ± 30 प्रतिकृति से हैं। प्रत्येक स्तंभ के भीतर एक ही छोटा अक्षर के साथ मतलब है जब Tukey ईमानदार महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के द्वारा की तुलना में पी <0.05 पर काफी अलग नहीं कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: ख की xylophilus अलग अलग समूहों में शयन आवृत्ति। गणना मतलब मूल्यों एसई ± 30 प्रतिकृति से हैं। एक ही छोटा अक्षर के साथ मतलब पी <0.05 जब कंप्यूटर अनुप्रयोग पर नहीं काफी अलग हैंTukey ईमानदार महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण द्वारा ared। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: बी xylophilus के शयन अवधि। स्तंभों के प्रत्येक सेट के भीतर एक ही छोटा अक्षर के साथ मतलब है जब Tukey ईमानदार महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के द्वारा की तुलना में पी <0.05 पर काफी अलग नहीं कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
व्यवहार परीक्षण रासायनिक पारिस्थितिकी, तंत्रिका जीव विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान, और आनुवंशिकी का एक मूलभूत पहलू हैं। नेमाटोड, और विशेष रूप से एलिगेंस, बड़े पैमाने पर इन क्षेत्रों में अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एलिगेंस के संभोग व्यवहार पहले 10-11 जांच की गई है। हालांकि, बी xylophilus gonochoristic और उभयलिंगी एलिगेंस से अलग है, और इसके संभोग की प्रक्रिया अलग अलग व्यवहार सुविधाओं 9 है। हाल ही में, Bursaphelenchus okinawaensis, बी xylophilus की एक उभयलिंगी बहन प्रजातियों के संभोग व्यवहार 12 की सूचना मिली थी। हालांकि विभिन्न प्रयोगात्मक विधियों का प्रयोग किया गया, इस उभयलिंगी प्रजातियों बी xylophilus के समान सेक्स आकर्षण से पता चला है, और उन दोनों के बीच अंतर-प्रजाति आकर्षण मनाया गया। इस उभयलिंगी बहन प्रजातियों Bursaphelenchus के जीव विज्ञान पर आगे की जांच का संचालन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का पालन और बी के xylophilus संभोग के दौरान व्यवहार सुविधाओं की जांच करने के लिए कैसे पर एक दिशानिर्देश प्रदान करता है। हमारा निष्कर्ष से पता चला है कि वर्जिन वयस्क नेमाटोड का उपयोग कर सफलतापूर्वक संभोग प्रक्रिया (चित्रा 1) के अवलोकन की संभावना को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। J4 लार्वा प्राप्त करने और ठीक उनके लिंगों भेद वर्जिन वयस्कों के अधिग्रहण के लिए दो महत्वपूर्ण मौलिक कदम उठाए हैं। हमारे प्रयोगात्मक शर्तों (यानी, अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर), 52 घंटा की अवधि उचित समय J2 लार्वा से J4 प्राप्त करने के लिए है के तहत। हालांकि, जल्दी J4 चरण में सेक्स भेद ज्यादातर व्यक्तिगत अनुभव पर निर्भर करता है। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, यह अलग अलग लोगों की दोबारा जांच करने के लिए सेक्स आवंटन आवश्यक है।
बी के xylophilus संभोग की प्रक्रिया के दौरान व्यवहार सुविधाओं में गुणात्मक वर्णित किया जा सकता है और मात्रात्मक विश्लेषण किया चार के durations अलग रिकॉर्डिंग सेईएनटी चरणों, पहले से संपर्क करें, शयन आवृत्ति, और विभिन्न संयोजनों के शयन अवधि के बाद संभोग सफलता का प्रतिशत। दिलचस्प है, पहली बार के लिए, हम संभोग पसंद महिलाओं और पुरुषों और महिलाओं दोनों में मजबूत इंट्रा-यौन प्रतियोगिता से मनाया। कोई संकीर्णता मनाया गया; बहरहाल, यह हमारी जांच में इस्तेमाल किया नेमाटोड की सीमित संख्या के कारण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल केवल बी xylophilus के संभोग व्यवहार की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी उपयोगी और अन्य नेमाटोड के लिए एक संदर्भ के रूप में महत्वपूर्ण हो सकता है।
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Acknowledgments
Najie झू और Liqun बाई इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया। इस काम के लिए आर्थिक रूप से लोक कल्याण में वनों के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए विशेष कोष (201204501) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31170604, 31270688, और 31570638) द्वारा समर्थित किया गया। हम अंग्रेजी लेखन पर अपने उपयोगी सुझाव के लिए डॉ Holighaus Gerrit और डॉ डेनिएल Hickford धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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