Abstract
Способ наблюдения и количественной оценки поведения сопряжении сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus, был создан под стереомикроскопа. Для повышения эффективности спаривания B. Xylophilus и увеличить шансы наблюдения спаривания, девственные взрослые культивировали и использовали для исследования. Яйца были получены путем держать нематод в воде и позволяя самки откладывают яйца в течение 10 мин. Молодь второго этапа (J2) были синхронизированы путем инкубирования яиц в течение 24 ч при 25 ° C в темноте, и в начале Д4 были получены культивированием J2 с серой гнили, Botrytis сшегеа, еще 52 ч. В этот момент времени, большинство J4 нематоды может быть четко отличать как мужского или женского пола с использованием их половых морфологии. Мужского и женского пола J4 собирали и культивировали отдельно в двух разных чашках Петри в течение 24 ч, чтобы получить девственные взрослых нематод. Девственница самец и самка девственницей были соединены в капле очистэр в скважине вогнутого ползуна. Брачное поведение было снято с видеомагнитофоном под стереомикроскопа. Весь период процесса спаривания был 82,8 ± 3,91 мин (среднее значение ± SE) и может быть разделен на 4 этапа: поиск, контактирующих, совокупляющихся и сохраняющиеся. Средние минуты продолжительности были 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 и 7,2 ± 0,5, соответственно. Одиннадцать суб-модели поведения были описаны: крейсерская, приближаясь, сталкиваясь, прикасаясь, Hooping, размещение, установка, эякуляцию, отделяя успокоенность, и роуминг. Интересно, что наблюдалось очевидное внутри половой конкуренции, когда одна женщина была сгруппирована с 3-х самцов или одного самца с 3-х самок. Этот протокол является полезным и ценным, а не только при исследовании брачного поведения Б. xylophilus, но и выступает в качестве эталона для этологических исследований других нематод.
Protocol
1. Приобретение Virgin взрослых нематод
- Pinewood нематода изолят и условия культивирования
Примечание: В B. xylophilus изолировать Nxy61 первоначально был извлечен из пораженной Pinus massoniana в районе Нинбо провинции Чжэцзян в Китае.- Приготовьте картофельный агар с декстрозой (PDA, приведены в таблице материалов) пластин для выращивания ботритис серый.
- Для получения прививки, перфоратор кусок грибковой мата с диаметром 10 мм от B. стегеа мата и положить его в середину нового КПК пластины. Культура B. стегеа в течение 5 дней при 25 ° С в темноте.
- Культура сосняк нематоды в подготовленную чашку Петри , содержащую B. стегеа при 25 ° С в темноте.
- Приобретение B. xylophilus яиц
- Поместите зажат резиновую трубку ниже воронки и удерживать подготовленную воронку в стойку, чтобы собратьBaermann воронку аппарата. Поместите два слоя фильтровальной бумаги вместо марли во рту воронки.
- Передача грибковые культуры к установке воронки и добавьте воду до тех пор, пока грибковая коврик погружен. Подождите 2 ч, а нематоды выйдет из грибковой культуры, пересекают фильтровальную бумагу, и осесть в самой нижней части воронки Baermann.
- Собирают первую пару капель воды из нижней части трубы в 15 мл пробирку и собирают с нематодами, медленно открывая зажим на трубке.
- Центрифуга выше коллекций при 3000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Удалите верхний слой воды с помощью пипетки и ресуспендирования его с 1 мл стерильной бидистиллированной (дд) H 2 O.
- С помощью пипетки, передать выше взмучивания к новой стеклянной чашке Петри (диаметром 6 см). Добавьте 3 мл стерильного дд H 2 O в чашке Петри , чтобы гарантировать , что нематоды могут свободно плавать.
- Держите нематод в GlasS Петри в течение 10 мин при 25 ° С в темноте. Яйца будут заложены беременных самок. Из-за их гликопротеин поверхности, яйца прилипают к нижней части стеклянной чашке Петри.
- Удалите воду и червей осторожно, не нарушая яйца. Добавьте 3 мл стерильного дд H 2 O в стеклянную чашку Петри немедленно , чтобы предотвратить яйца от высыхания.
- Повторите шаг 1.2.8 3x, чтобы удалить все личинки и взрослые, и получить чистые яйца. Добавить дополнительные 2 мл (5 мл в общей сложности) стерильного дд H 2 O в чашке Петри.
- Приобретение четвертого ювенильной стадии (личинки J4)
- Hatch собранные яйца в течение 24 ч в темноте при 25 ° С для получения личинок J2.
- Переносят личинки J2 с пипеткой в 15 мл пробирку, центрифугируют при 3000 х г в течение 2 мин, и снять верхний слой воды.
- Ресуспендируют личинки J2 200 мкл стерильного дд H 2 O, а затем передавать их вКПК пластина , содержащая B. стегеа.
- Культура личинки J2 в течение 52 часов при 25 ° С в темноте. В этот момент времени, большинство личинок J2 не развились в ранней стадии личинок J4.
- Приобретение целинных взрослых нематод
- Подготовьте иглу для получения нематод, нарисовав стеклянный капилляр после нагревания его над горелкой спирта.
Примечание: Кончик этой капиллярной иглы обычно должна быть 50 мкм в диаметре, примерно ширина тела взрослого нематоды, так что он может быть использован в качестве инструмента для получения одного нематоде. - Соберите воронку Baermann и извлечения нематод из грибковых культур в течение 2 ч, как описано в пунктах 1.2.1 - 1.2.3.
- Перенести J4 с водой в чистую чашку Петри.
- Обратите внимание на нематод под стереомикроскопа и различать самцов и самок по генитальной морфологии, как описано Mamiya и Kiyohara 8 (рис 1 Примечание: Есть больше женщин, чем мужчин, с процентом женщин на 60 - 70%. Женская вульва, очевидно, отличается от мужского спикулы. По сравнению с взрослым, спикулы или вульва в ранней стадии J4 меньше, но они все еще можно легко увидеть и отличается. Нематода всегда движется в воде, что иногда увеличивает сложность различения самцов и самок.
- Культура личинки Д4 еще в течение 24 часов при 25 ° С в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все нематоды должны развиваться во взрослых, но так как они являются Разъединенные, они считаются девственными взрослых. - Соберите два Baermann воронок и извлечь целинные взрослых от грибковых культур в течение 2 ч, как описано в пунктах 1.2.1 - 1.2.3, а также передавать целинные взрослых самцов и самок на две отдельные, чистые чашки Петри.
2. Наблюдение и видеозапись брачного поведения
- Подготовьте несколько вогнутые слайдов и добавьте 200 мкл стерильного дд H 2 O к каждому из своих скважин.
- Возьмите подготовленный девственную взрослый мужчина или женщина и с капиллярной иглой и поместить только одну нематодой в воду каждого вогнутого слайда.
- Держите целинные взрослых внутрь скважины в течение 1 часа, чтобы позволить им адаптироваться к новой водной среде.
- Пара девственной мужского и женского пола, передавая один из них из одной ямы в другую с помощью пипетки.
- Обратите внимание на поведение сопряжении 1♀ + 1♂ комбинации в вогнутом слайде под стереомикроскопа.
- Для анализа эффективности спаривания целинных взрослых, вычислить их скорость спаривание успеха (R) и сравнить ее с случайно выбранных взрослых пар. Вычислить R как процент повторностей, в которых наблюдалось спаривание по сравнению с общим числом повторностей изученных.
- Для сбора данных для качественного и количественного анализа, снимать брачное поведение с помощью видеомикроскопия. Как правило, весь процесс спаривания, с того времени, когда нематоды помещаются в лунку вогнутой слайд до момента, когда они отходят после совокупления, завершается в течение 2 ч. Таким образом, запись процесса спаривания непрерывно в течение не менее 2 ч, как один повторности. Полное по крайней мере, 30 размножается в общей сложности для каждой комбинации.
Примечание: Добавить бесплоднее дд H 2 O (обычно 50 мкл) каждые 0,5 часа в колодец , чтобы компенсировать испарение во время процесса записи.
3. Сбор данных
- Просмотреть все видео внимательно на экране компьютера и охарактеризовать подгруппы поведения качественно.
- Измерьте продолжительность спаривания с использованием гое кадр за кадром функция видеомагнитофона. Вручную вычесть начальное время от конечной точки.
- Для комбинации 1♀ + 1♂, анализировать каждую запись видео и измерения длительности следующих событий:
- Мера продолжительности поиска (то есть время от момента , когда самка и самец, вводят в лунку вогнутой слайд до момента они сталкиваются и соприкасаются друг с другом).
- Измерьте продолжительность контактирования (т.е. время от первого контакта до момента , когда мужчина точно расположить на вульву самки для первого совокупления).
- Мера продолжительности совокупления (то есть время от момента , когда мужчина точно позиционируется на вульву самки , пока он не скользит вниз от тела самки после эякуляции). Примечание: Некоторые нематоды могут совокупляться несколько раз в 2 часа. В таких случаях, измерять длительность совокупления от первого совокупления до конца Ласт один, включая время между ними.
- Измерьте продолжительность протяжные (т.е. период после совокупления до мужского и женского пола уплывают друг от друга и отделены друг от друга на расстоянии больше , чем длина тела нематод ( как правило , 1 мм)).
- Подсчитайте частоту совокупления и продолжительность каждого совокупления , а средняя продолжительность всех совокуплений в 2 ч для каждого из различных комбинаций (т.е. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ и 1♀ + 3♂).
- Рассчитать вероятность успешного спаривания для первого контакта (P) для различных комбинаций, как показатель успешности спаривания после первого контакта, который проводится немедленно и без какого-либо перерыва. В контактирующей фазе, несколько контактов могут наблюдаться до фактического совокупления.
- Когда расстояние между двумя людьми больше, чем длина тела, рассмотрим один контакт, чтобы быть более. Для одной повторности, запись P в качестве 100%, когда совокупление яs наблюдается сразу же после первого контакта, без перерыва, или 0.00%, если не наблюдалось совокупления или если существует совокупление, но после того, как два или более контактов.
Примечание: Были 30 повторностях для каждой комбинации, описанной здесь.
- Когда расстояние между двумя людьми больше, чем длина тела, рассмотрим один контакт, чтобы быть более. Для одной повторности, запись P в качестве 100%, когда совокупление яs наблюдается сразу же после первого контакта, без перерыва, или 0.00%, если не наблюдалось совокупления или если существует совокупление, но после того, как два или более контактов.
- Подготовьте иглу для получения нематод, нарисовав стеклянный капилляр после нагревания его над горелкой спирта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вероятность успешного спаривания (R) целинных взрослых была 86,67% в среднем, что значительно выше , чем у случайно выбранных взрослых: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, ДФ = 1, P = 0,0001) (Рисунок 2). Этот факт позволяет предположить , что легче наблюдать за поведением спаривания B. xylophilus с Богородицей взрослых , чем со случайным образом отобранных взрослых.
Когда один мужчина был в паре с одной женщиной, весь процесс длился спаривание 82,8 мин в среднем. Весь процесс может быть описан четырьмя различными фазами: поиск, контакт, совокупляются, и протяжные. Продолжительность этих четырех фаз 21,8 ± 2,0 мин, 28,0 ± 1,9 мин, 25,8 ± 0,7 мин, и 7,2 ± 0,5 мин, соответственно (фиг.3). В недавней публикации, мы описали 11 суб-поведения, как крейсерская, приближаясь, encounteriнг, трогательная, Hooping, размещение, установка, эякуляцию, отделяя успокоенность, и роуминг 9.
Когда один мужчина встретил двух или более самок одновременно, самец, казалось, спариваются случайным образом с одним из них, без какого-либо выбора. Тем не менее, было отмечено очевидным выбором спаривание для женского Б. xylophilus. Когда женщина связался мужчина, женщина, как правило, чтобы коснуться голову мужчины, тело, хвост, и генитальный область мягко с ее головой и, казалось, оценить ее потенциального партнера. Если самка не принимает самца, самка ушла от него и быстро поплыл к другому мужчине для следующей оценки. Один из мужчин был тогда выбран самки к спариванию. Спаривание показатели успеха после первого контакта (Р) 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ и 1♀ + 3♂ комбинации были 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, и 23,4 ± 7,4%, соответственно, и различия между ними WERе достоверны (Р = 8,21, ДФ = 2, p = 0,0124) (рис 4).
Intrasexual конкуренция наблюдалась у мужчин и женщин. Когда одна девственница смешивали с 3 целинных мужчин, мужчины пытались подойти и связаться с самку как можно больше, чтобы получить шанс на спаривание с ней. Когда вульвы был занят один самец, остальные самцы пытались нарушить спаривании самца с помощью насильственных колебания тела или перетаскиванием, чтобы отделить их. Женский intrasexual конкуренция рассматривается как более или менее похожи на мужской intrasexual конкуренции.
Спаривание успех в основном зависит от самки. Когда самка приняла самца, самец перемещается более медленно и неровных или даже сформировали обручем, и самка активно двинулась вперед, чтобы сделать его более легким для мужчины, чтобы найти ее вульву и, чтобы избежать помех от других самцов. Если самка не принимает самца,женщина попыталась встряхнуть его, даже если самец установлен и позиционирует себя ее вульвы. Из-за конкуренции intrasexual, совокупления частоты 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ и 1♀ + 3♂ комбинации были 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 и 1,83 ± 0,074 соответственно, а различия между ними были значимым (F = 14,50, ДФ = 2, p = 0,0001) (рис 5).
В нашем исследовании, длительность совокупления сильно различаются, при этом как минимум 20 секунд и максимум 42 мин. По нашим данным, длительность совокупления может быть, очевидно, дифференцированы на две группы: краткосрочные спариваний, которые длились менее 5 мин, а также долгосрочных спариваний, которые длились дольше, чем 10 мин. Наблюдались очевидные различия между различными группами по средней продолжительности кратковременной совокупления (F = 3,81, DF = 2, P (F = 179,52, ДФ = 2, p = 0,0001), и все совокуплений (F = 2,93, DF = 2, p = 0,0367) (Рисунок 6).
Рисунок 1: Гениталии мужского и женского Б. Xylophilus. (А) спикула мужского (синяя стрелка). (Б) вульвы женского (красная стрелка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Ответный Успех Скорость Virgin взрослых пар и Произвольно выбранные для взрослых Пары Б. xylophilus. Рассчитанные средние значения от 30 повторах. Вертикальная черта шоуS стандартная ошибка. Различные строчные буквы указывают на существенные различия при р <0,05 по сравнению с помощью теста Тьюки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Продолжительность 4 этапа в Спаривание процессе Б. xylophilus. Рассчитанные средние значения от 30 повторах. Вертикальная черта показывает стандартную ошибку. Различные строчные буквы указывают на существенные различия при р <0,05 по сравнению с помощью теста Тьюки. Средняя продолжительность фазы совокупляются составляет 25,80 ± 0,71 мин, что 31,17% всего процесса спаривания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисЮр.
Рисунок 4: Спаривание Успех первого контакта Б. xylophilus. Рассчитанные средние значения от 30 повторностей ± SE. Средства с той же буквы в нижнем регистре в каждом столбце не существенно отличается при Р <0,05 по сравнению с доблестную тестом значительная разница Тьюки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Спаривание Частота B. xylophilus в разных группах. Рассчитанные средние значения от 30 повторностей ± SE. Средства с той же буквы в нижнем регистре не существенно отличается при Р <0,05, когда оценочногоared честным тестом значительная разница Тьюки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Спаривание Продолжительность Б. xylophilus. Средства с той же буквы в нижнем регистре в каждом наборе столбцов не существенно отличается при Р <0,05 по сравнению с доблестную тестом значительная разница Тьюки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поведенческие тесты являются одним из основных аспектов химической экологии, нейробиологии, молекулярной биологии и генетики. Нематоды и , в частности С. Элеганс, широко используются для исследований в этих областях. Поведение спаривание С. Элеганс было исследовано ранее 10-11. Однако Б. xylophilus является gonochoristic и отличается от гермафродитных C. Элеганс, и процесс его спаривание имеет различные поведенческие особенности 9. В последнее время поведение спаривание Bursaphelenchus okinawaensis, А гермафродитных видов сестра Б. xylophilus, было сообщено 12. Хотя использовались различные экспериментальные методы, этот гермафродитные видов показали одинаковую сексуальную привлекательность к Б. xylophilus, и наблюдалась Межвидовое притяжение между ними. Этот гермафродитные вид сестра может быть использована в качестве модели для проведения дальнейшего исследования по биологии Bursaphelenchus.
Этот протокол обеспечивает руководство о том , как наблюдать и исследовать поведенческие особенности В. xylophilus во время спаривания. Наши результаты показали , что использование целинных взрослых нематод имеет решающее значение для увеличения шансов успешного наблюдения за спаривание процесса (рисунок 1). Получение личинок J4 и точно различать их пола два важных основных шагов для приобретения целинных взрослых. В наших экспериментальных условиях (например, при 25 ° C в темноте), период 52 ч является надлежащее время , чтобы получить J4 от личинок J2. Однако, различая секс на ранней стадии J4 во многом зависит от личного опыта. Для обеспечения точности, необходимо для разных людей перепроверить распределение секс.
Поведенческие особенности В. xylophilus в процессе спаривания можно описать качественно и количественно анализировали путем записи длительности четырех отличаютсялор фазы, процент брачного успеха после того, как первый контакт, частота совокупления и длительность совокупления различных комбинаций. Интересно, что в первый раз, мы наблюдали выбор спаривании самки и сильной внутри сексуальной конкуренции в обоих мужчин и женщин. Не наблюдалось распущенность; Тем не менее, это может быть из-за ограниченного количества нематод, используемых в нашем исследовании. Этот протокол не может быть использован только для исследования поведения сопрягаемой Б. xylophilus, но оно также может быть полезным и ценным в качестве эталона для других нематод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Чжу и Лицюнь Бай внесли одинаковый вклад в эту работу. Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Специального фонда для лесного хозяйства научных исследований в социальной защиты населения (201204501) и Национального фонда естественных наук Китая (31170604, 31270688 и 31570638). Мы благодарим доктора Holighaus Герритом и д-р Даниэль Hickford за их полезные предложения по английскому письменной форме.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
