Abstract
マツ材線虫の交尾行動を観察し、定量化するための方法は、 マツノザイセンチュウは 、実体顕微鏡下で設立されました。 B.センチュウの交配効率を向上させると相手観察の機会を増加させるために、処女大人培養し、調査のために使用されます。卵を、水で線虫を維持し、女性は10分間産卵させることにより得ました。第二段目の少年（J2）は、暗所で25℃で24時間の卵をインキュベートすることによって同期化され、初期のJ4は、別の52時間、灰色カビ、 ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）とJ2を培養することによって得ました。この時点で、ほとんどのJ4線虫は彼らの生殖器の形態を使用して、男性または女性であるとして明確に区別することができました。男性と女性のJ4を回収し、バージン成体線虫を得るために、24時間に2つの異なるペトリ皿中で別々に培養しました。処女男性と処女雌はワットの低下に対になりました凹形スライドのウェル内の小胞体。交尾行動は、実体顕微鏡下でのビデオレコーダーで撮影されました。交配プロセスの全期間は82.8±3.91分（平均±SE）であったと4つの異なる段階に分けることができます、と連絡交尾、と余韻、検索。期間の平均分はそれぞれ、21.8±2.0、±1.9 28.0、25.8±0.7および7.2±0.5でした。イレブンサブ挙動が記載された：、クルージング近づいて、遭遇し、触れる、掛け、位置、取り付け、射精、分離、静止状態、およびローミング。一人の女性が3人の男性または女性3と1人の男性とグループ化されたときに興味深いことに、明らかなイントラ性的競争が観察されました。このプロトコルは、Bセンチュウの交尾行動を調査する中で、だけでなく、他の線虫の行動学的研究のための基準として機能するだけでなく、有用かつ貴重なものです。
Protocol
ヴァージンアダルト線虫の1買収
- マツ材線虫の分離株と培養条件
注：B.センチュウ Nxy61はもともと中国の浙江省の寧波領域の病気の馬尾から抽出された隔離。- ポテトデキストロース寒天（PDAを、 材料の表を参照してください）準備成長灰色かび病菌のためのプレート。
- 接種のために、B.シネレアマットから直径10mmの真菌マットの一部をパンチして、新しいPDAプレートの真ん中にそれを置きます。文化暗所で25℃で5日間B.シネレア 。
- 文化暗所で25℃においてB.シネレアを含む準備されたペトリ皿中のマツ材線虫。
- B.センチュウ卵の取得
- 漏斗の下にクランプされたゴムチューブを配置し、組み立てるためのラックに準備された漏斗を開催Baermannロート装置。漏斗の口の中でろ紙の代わりにガーゼの二つの層を配置します。
- 漏斗のセットアップに真菌培養液を移し、真菌のマットが浸漬さまで水を追加します。 2時間待ってから、線虫は、真菌培養から出てくるろ紙を横断し、Baermannロートの最下部に落ち着くだろう。
- 15 mLのチューブにチューブの底からの水の滴の最初のカップルを収集し、ゆっくりとチューブにクランプを解放することによって線虫を集めます。
- 室温で2分間、3,000×gで、上記のコレクションを遠心。
- ピペットで水の上層を削除し、滅菌蒸留（DD）の1mLのH 2 Oでそれを再懸濁
- ピペットを用いて、新しいガラスシャーレ（直径6cm）に上記の再懸濁を移します。線虫が自由に泳ぐことができることを保証するために、ペトリ皿に無菌のdd H 2 Oの3ミリリットルを追加します。
- GLASで線虫を保ちます暗所で25℃で10分間、ペトリ皿は、S。卵は妊娠した雌によって敷設されます。そのため、それらの糖タンパク質表面の、卵は、ガラスペトリ皿の底に固執します。
- 卵を乱すことなく、慎重に水やワームを削除します。乾燥から卵を防ぐために、すぐにガラスシャーレに無菌のdd H 2 Oの3ミリリットルを追加します。
- すべての幼虫と成虫を除去し、純粋な卵を得るための手順を繰り返し1.2.8 3倍。ペトリ皿に無菌のdd H 2 Oの余分な2 mLの（合計で5ミリリットル）を追加します。
- 4段目の少年の取得（J4幼虫）
- ハッチ25℃の暗所で24時間採取した卵は、J2の幼虫を得ることができます。
- 、15 mLのチューブにピペットでJ2の幼虫を移し2分間、3000×gで遠心分離し、水の上層を除去します。
- 無菌のdd H 2 Oの200μLとJ2の幼虫を再懸濁し、その後に転送B.シネレアを含むPDAプレート。
- 文化暗所で25℃で52時間、J2の幼虫。この時点で、ほとんどのJ2幼虫はJ4幼虫の初期段階へと発展してきます。
- 処女大人の線虫の取得
- アルコールバーナーの上に加熱した後、ガラスキャピラリーを描画することによって線虫を拾うための針を準備します。
注：これは、単一の線虫をピックアップするためのツールとして使用することができるように、このキャピラリ針の先端は、通常、直径が50ミクロン、成体線虫の略車体幅である必要があります。 - Baermannロートを組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌の培養物から線虫を抽出 - 1.2.3。
- きれいなペトリ皿に水でJ4を転送します。
- （ 図1実体顕微鏡下で線虫を観察し、間宮と清原8で説明したように、生殖器の形態によって、男性と女性を区別注： - 70％、男性よりも女性が60の雌の割合であります。女性の外陰部は明らかに男性の骨片は異なっています。大人に比べて、初期段階のJ4で骨片や外陰部は小さいですが、彼らはまだ容易に見ると区別することができます。線虫は、常に時には、男性と女性を区別することの困難を増大させ、水、に移動しています。
- 文化暗所で25℃でさらに24時間J4幼虫。
注：すべての線虫は成虫に開発する必要がありますが、彼らは嵌合解除されているので、それらは処女大人とみなされます。 - Baermannは、ファンネル2を組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌培養物から処女大人を抽出 - 1.2.3、および2つの独立した、きれいなペトリ皿に処女成人男性と女性を転送します。
2.観察と交尾行動のビデオ録画
- いくつかの凹面のスライドを準備し、それらの各ウェルに無菌のdd H 2 Oの200μLを追加します。
- キャピラリ針を用いて調製バージン成人男性やと女性をピックアップし、各凹形スライドの水の中に一つだけの線虫を置きます。
- 彼らは新たな水環境に適応させるために1時間だけでなく内部の処女大人にしてください。
- ピペットを使用して、別の1つのウェルからそれらのいずれかを転送することにより、処女オスとメスをペア。
- 実体顕微鏡下に凹のスライドで1♀+1♂組み合わせの交尾行動を観察します。
- バージン成人の接合効率を分析するために、それらの交配成功率（R）を計算し、ランダムに選択された大人のペアのそれとを比較します。交尾を検討複製の総数に比べて観察された複製の割合としてRを計算します。
- 定性および定量分析のためのデータを収集するために、ビデオ顕微鏡を使用して、交尾行動をフィルム。通常、全体の交配プロセスは、彼らは交尾後に離れて移動したときに線虫が瞬間に凹形スライドのウェル内に配置された時点から、2時間以内に完了する。従って、一つの複製、少なくとも2時間、連続的に交配処理を記録します。組合せごとに合計で少なくとも30の反復を完了します。
注：記録プロセスの間の蒸発を補償するウェルに（通常は50μL）2 O毎に0.5時間をより無菌のdd Hを追加します。
3.データ収集
- コンピュータの画面上で、慎重にすべての動画と定性的サブ行動を特徴づけます。
- 目を使用して、相手の持続時間を測定しますビデオレコーダーの電子フレーム単位で機能。手動でエンドポイントから開始時間を引きます。
- 1♀+1♂組み合わせについては、それぞれのビデオ録画を分析し、次のイベントの継続時間を測定します：
- 検索の所要時間を測定します（ つまり、女性と男性は、彼らが遭遇した瞬間に凹形スライドのウェルに導入し、互いに接触しているときからの時間）。
- 接触の持続時間を測定する（ すなわち 、男性が正確に最初の交尾のために女性の外陰部に位置している瞬間の最初の接触からの時間）。
- （彼は射精後の女性の体から滑り落ちるまで男性が正確に女性の外陰部に位置しているときから、 すなわち時間）交尾の持続時間を測定します。注：一部の線虫を2時間に数回交尾することができます。このような場合には、ラスの端部に第一の交尾から交尾の継続時間を測定します間の時間を含むトン1、。
- 余韻の長さを測定する（ すなわち 、男性と女性の水泳まで互いに離れる交尾後の期間と線虫の体の長さ（通常は1ミリメートル）以上の距離で分離されています）。
- 交尾頻度とすべての交尾の期間と異なる組み合わせのそれぞれについて、2時間内のすべてのcopulationsの平均期間をカウントする（ すなわち、1♀+1♂、3♀+1♂、および1♀+3♂）。
- すぐに任意の休憩なしで行われた第1の接触、後の交尾の成功率など、さまざまな組み合わせのための最初の接点（P）用の交尾成功率を計算します。接触させる段階では、いくつかの連絡先は、実際の交尾の前に観察されることがあります。
- 2人の間の距離は、本体の長さ以上である場合には、以上のことを一つの接点を考えます。 1複製、レコードP 100％と交尾iについてsがブレークすることなく、最初に接触した後すぐに観察、または0.00パーセント全く交尾が観察されなかった場合や交尾が、2つ以上の接点の後があった場合。
注：ここで説明する組み合わせごとに30の複製がありました。
- 2人の間の距離は、本体の長さ以上である場合には、以上のことを一つの接点を考えます。 1複製、レコードP 100％と交尾iについてsがブレークすることなく、最初に接触した後すぐに観察、または0.00パーセント全く交尾が観察されなかった場合や交尾が、2つ以上の接点の後があった場合。
- アルコールバーナーの上に加熱した後、ガラスキャピラリーを描画することによって線虫を拾うための針を準備します。
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Representative Results
バージン成人の交配成功率（R）は、ランダムに選択された成人のものよりも有意に高かった、平均で86.67％であった：13.33±4.65％（F = 1301.71、DF = 1、P = 0.0001）（ 図2）。この知見は、ランダムに選択された大人と比べ処女大人とB.センチュウの交尾行動を観察することが容易であることを示唆しています。
1人の男性が一人の女性とペアになったときに、全体の交配プロセスは、平均で82.8分続きました。全体のプロセスは、4つの異なる位相によって記述することができます、検索接触し、交尾、と余韻。これらの4つのフェーズの継続時間は21.8±2.0分、28.0±1.9分、25.8±0.7分、および7.2±0.5分で、それぞれ（ 図3）でした。最近の刊行物では、我々は、近づいて、encounteriをクルージングとして11サブ動作を説明しましたngの、、、掛けに触れ、分離、射精、取り付け、静止状態の位置を特定し、9ローミング 。
1男性は、同時に2つ以上の人の女性に会ったとき、男性は任意の選択せずに、それらのいずれかでランダムに結合するように見えました。しかし、明らかな交配の選択は、雌のB.センチュウについて観察されました。女性が男性に連絡すると、女性は彼女の頭を優しく男性の頭、胴体、尾部、および陰部に触れ傾向にあったと彼女の潜在的なパートナーを評価しているように見えました。女性が男性を受け入れなかった場合、女性はすぐに彼を残して、次の評価のために別の男性に泳ぎました。男性の一つは、その後、交配のための女性によって選ばれました。 1♂+3♀、1♀+1♂の最初の接点（P）の後の成功率を交配し、1♀+3♂組み合わせは、それぞれ46.7±9.3％、80.0±7.4％、および23.4±7.4％でしたそして、それらの違いWERE有意（F = 8.21、DF = 2、P = 0.0124）（ 図4）。
Intrasexual競争は、男性と女性の両方で観察されました。 1処女雌が3バージン雄と混合したとき、男性は近づくと彼女との交配のチャンスを得るために、できるだけ多くの女性に連絡することを試みました。外陰部が1人の男性に占領された場合には、他の男性は暴力的な身体の揺れを使用したり、それらを分離するためにドラッグして、相手の男性を妨害しようとしました。女性intrasexual競争は男性intrasexual競争に多かれ少なかれ似ているように見られました。
交尾の成功は、主に女性に依存していました。女性が男性を受け入れたとき、男性はよりゆっくりと移動し、カール、あるいはフープを形成し、女性はそれが簡単に男性が彼女の外陰部を検索すると、他の男性からの干渉を避けるためにのために作るために積極的に前方に移動しました。女性が男性を受け入れなかった場合は、女性は、男性が搭載され、彼女の外陰部によって自分自身を位置付けていた場合であっても、彼を振り払うことを試みました。そのためintrasexual競争、1♀+1♂の交尾頻度、3♀+1♂の、および1♀+3♂組み合わせは、それぞれ1.43±0.091、1.17±0.074と1.83±0.074であった、とそれらの間の違いがありました有意（F = 14.50、DF = 2、P = 0.0001）（ 図5）。
私たちの調査では、交尾継続時間は、20秒の最小値と42分の最大で、大きく変化しました。 10分よりも長く持続した5分未満の持続短期copulations、および長期copulations：我々のデータによれば、交尾の期間は明らかに二つのグループに区別することができます。明らかな違いは、短期的な交尾（F = 3.81の平均期間は、df = 2、Pのために異なるグループ間で観察されました（F = 179.52、DF = 2、P = 0.0001）、およびすべてのcopulations（F = 2.93、DF = 2、P = 0.0367）（ 図6）。
図1：男性と女性B.センチュウの生殖器。 （a）は男性（青い矢印）の骨片。 （b）の女性（赤矢印）の外陰部。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ヴァージンアダルトカップルの交尾成功率およびB.センチュウのランダムに選択された大人のカップル。計算された平均値が30の反復からのものです。垂直バーショー標準誤差です。 Tukeyの検定により比較した場合、異なる小文字はP <0.05で有意差を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：B.センチュウの嵌合過程での4フェーズの持続時間。計算された平均値が30の反復からのものです。垂直バーは標準誤差を示しています。 Tukeyの検定により比較した場合、異なる小文字はP <0.05で有意差を示します。交尾期の平均期間は、全体の交配プロセスの31.17パーセントで25.80±0.71分、です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。URE。
図4：B.センチュウのファーストコンタクトのための交配成功。計算された平均値は、SE±30の反復からのものです。 Tukeyの正直な有意差検定により比較した場合、各列内の同じ小文字で意味は、P <0.05で有意差はありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：異なるグループ内のB.センチュウの交尾頻度。計算された平均値は、SE±30の反復からのものです。同じ小文字で意味は、P <0.05コンプで有意差はありませんTukeyの正直な有意差検定によりared。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：B.センチュウの交尾時間。 Tukeyの正直な有意差検定により比較した場合、列の各セット内で同じ小文字で意味は、P <0.05で有意差はありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
行動試験は、化学生態学、神経生物学、分子生物学、遺伝学の基本的な側面です。線虫、特にC.エレガンスは 、広くこれらの分野での研究のために使用されています。 線虫の交尾行動は、以前10-11検討されています。しかし、B.のセンチュウは gonochoristicと雌雄同体C.エレガンスとは異なり、その嵌合プロセスは、異なる行動機能9を有しています。最近では、 マツノザイokinawaensis、B. センチュウの雌雄同体の姉妹種の交尾行動は、12を報告しました。別の実験方法を用いたが、この雌雄同体の種はBに類似したセックスの魅力を示したセンチュウ 、 それらの間の種間の引力が観察されました。この雌雄同体の姉妹種は、 マツノザイの生物学上の更なる調査を実施するためのモデルとして使用される場合があります。
このプロトコルは、嵌合時のB.センチュウの行動的特徴を観察し、調査方法についてのガイドラインを提供します。我々の知見は、バージン成体線虫を使用して成功裏に嵌合工程（ 図1）を観察する機会を増加させるために重要であることが示されました。 J4幼虫を入手し、正確に自分の性別を区別することは処女大人の取得のための2つの重要な基本的なステップです。我々の実験条件の下で（ すなわち、暗所で25℃）、52時間の間には、J2の幼虫からJ4を得るための適切な時間です。しかし、初期のJ4段階での特徴的なセックスは、主に個人的な経験に依存します。異なる人々が性別の割り当てを再確認するための精度を確保するために、それが必要です。
B.のセンチュウ交配プロセス中の行動の特徴を定性的に説明し、異なる4の持続時間を記録することによって定量的に分析することができます耳鼻咽喉科のフェーズ、第一接触、交尾頻度、および異なる組み合わせの交尾継続時間後の交尾成功の割合。興味深いことに、初めて、私たちは、女性と男性と女性の両方に強いイントラ性的競争によって、相手の選択肢を観察しました。いいえ混乱は見られませんでした。しかし、これは私たちの調査に使用される線虫の限られた数に起因する可能性があります。このプロトコルは、B.センチュウの交尾行動を調査するために使用することができないが、それはまた、他の線虫のための基準として有用で貴重であることができます。
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Acknowledgments
Najie朱とLiqun白が、この作品にも同様に貢献しました。この作品は、財政的に公共の福祉における林業科学研究のための特別基金（201204501）と中国の国家自然科学基金（31170604、31270688、および31570638）によってサポートされていました。私たちは英語の書き込みに自分の役立つ提案のために博士Holighausヘリット・博士ダニエルHickfordに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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