Abstract
En metode til at observere og kvantificere parringsadfærd af fyrretræsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, blev etableret under et stereomikroskop. For at forbedre parring effektivitet B. Xylophilus og øge chancerne for parring observation, jomfru voksne blev dyrket og anvendt til undersøgelsen. Æg opnåedes ved at holde nematoderne i vand og lade hunnerne at lægge æg i 10 min. Andet trin yngel (J2) blev synkroniseret ved inkubering af æg til 24 timer ved 25 ° C i mørke, og tidlig J4 blev opnået ved dyrkning af J2 med gråskimmel, Botrytis cinerea, for en anden 52 timer. På dette tidspunkt, kunne de fleste J4 nematoder være klart adskilt som mand eller kvinde ved hjælp af deres kønsorganer morfologi. Den mandlige og kvindelige J4 blev opsamlet og dyrket separat i to forskellige petriskåle i 24 timer for at få jomfruelige voksne nematoder. En jomfru mandlige og en jomfru kvinde blev parret i en dråbe watis i brønden af en konkav objektglas. Den parring opførsel blev filmet med en video-optager under et stereomikroskop. Hele periode af parring proces var 82,8 ± 3,91 min (gennemsnit ± SE) og kunne opdeles i 4 forskellige faser: søgning, kontakt, kopulerende og dvælende. De gennemsnitlige minutter af varighed var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 og 7,2 ± 0,5, hhv. Elleve sub-adfærd blev beskrevet: cruising, nærmer sig, støder, røre, hooping, lokalisering, fastgørelse, sædafgang, adskillelse, ubevægelighed, og roaming. Interessant nok blev observeret indlysende intra-seksuel konkurrence, når en kvindelig blev grupperet med 3 hanner eller en han med 3 hunner. Denne protokol er nyttig og værdifuld, ikke kun i at undersøge parring adfærd B. xylophilus, men også i at fungere som en reference for etologiske studier af andre nematoder.
Protocol
1. Erhvervelse af Virgin Voksen Nematoder
- Pinewood nematode isolat og dyrkningsbetingelser
BEMÆRK: B. xylophilus isolere Nxy61 blev oprindeligt udvundet fra et sygt Pinus massoniana i Ningbo-området i Zhejiang-provinsen i Kina.- Forbered kartoffeldextroseagar (PDA, Se tabel of Materials) plader til dyrkning Botrytis cinerea.
- For podning, punch et stykke svampe måtte med diameter på 10 mm fra en B. cinerea mat og sætte det i midten af en ny PDA plade. Kultur B. cinerea i 5 dage ved 25 ° C i mørke.
- Kultur de fyrretræ nematoder i den klargjorte petriskål indeholdende B. cinerea ved 25 ° C i mørke.
- Erhvervelse af B. xylophilus æg
- Placer en fastspændt gummislange under en tragt og hold den forberedte tragt i et rack til at samleBaermann tragt apparat. Lægges to lag filterpapir i stedet for gaze i munden af tragten.
- Overfør svampekulturer til tragten setup og tilsæt vand indtil den fungale måtten er nedsænket. Vent 2 h, og nematoder vil komme ud fra svampe kultur, krydse filterpapir, og slå sig ned i den laveste del af Baermann tragt.
- Saml de første par dråber vand fra bunden af røret ind i et 15 ml rør og indsamle nematoder ved langsomt at frigive klemmen på slangen.
- Centrifuger de ovennævnte samlinger ved 3.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern det øverste lag af vand med en pipette og resuspender det med 1 ml sterilt dobbelt destilleret (dd) H 2 O.
- Med en pipette ovenstående resuspension til en ny glas petriskål (6 cm i diameter). Tilsæt 3 ml sterilt dd H2O til petriskålen for at sikre, at nematoderne kan svømme frit.
- Hold nematoder i glass petriskål i 10 minutter ved 25 ° C i mørke. Æg bliver lagt af gravide kvinder. På grund af deres glycoprotein overflade, vil æggene fast på bunden af glasset petriskålen.
- Tag vand og orme forsigtigt, uden at forstyrre æggene. Tilsæt 3 ml sterilt dd H2O til glasset petriskålen samme for at forhindre æggene tørrer ud.
- Gentag trin 1.2.8 3x at fjerne alle de larver og voksne, og få de rene æg. Tilføj en ekstra 2 ml (5 ml i alt) sterilt dd H2O til petriskålen.
- Erhvervelse af fjerde fase yngel (J4 larver)
- Hatch de indsamlede æg til 24 timer i mørke ved 25 ° C til opnåelse J2 larver.
- Overfør J2 larver med en pipette til et 15 ml rør, centrifugeres ved 3.000 xg i 2 min, og fjerne det øverste lag af vand.
- Resuspender J2 larver med 200 uL sterilt dd H2O, og derefter overføre dem tilPDA-plade indeholdende B. cinerea.
- Kultur J2 larver i 52 timer ved 25 ° C i mørke. På dette tidspunkt, vil de fleste J2 larver har udviklet sig til den tidlige fase af J4 larver.
- Erhvervelse af jomfruelige voksne nematoder
- Forbered en nål til at afhente nematoder ved at tegne et glas kapillarrør efter opvarmning det over en alkohol brænder.
BEMÆRK: Spidsen af denne kapillær nål skal normalt være 50 um i diameter, omtrent det organ bredde en voksen nematode, således at det kan anvendes som et redskab til opsamling af en enkelt nematode. - Saml en Baermann tragt og udtrække nematoder fra svampekulturer i 2 h, som beskrevet i trin 1.2.1 - 1.2.3.
- Overfør J4 med vand i en ren petriskål.
- Overhold nematoder under et stereomikroskop og skelne mellem hanner og hunner ved genital morfologi, som beskrevet af Mamiya og Kiyohara 8 (figur 1 BEMÆRK: Der er flere kvinder end mænd, med den procentdel af hunner ved 60 - 70%. Den kvindelige vulva er naturligvis forskellig fra den mandlige spicule. I forhold til den voksne, den spicule eller vulva i den tidlige fase J4 er mindre, men de kan stadig let ses og fornem. Nematoden bevæger sig altid i vandet, som undertiden øger vanskeligheden ved at skelne hanner og hunner.
- Kultur den J4 larver i yderligere 24 timer ved 25 ° C i mørke.
BEMÆRK: Alle nematoder bør udvikle sig til voksne, men da de er frakobles, bliver de betragtet som jomfruelige voksne. - Saml to Baermann tragte og udtrække de jomfruelige voksne fra de svampekulturer i 2 h, som beskrevet i trin 1.2.1 - 1.2.3, og overføre de jomfruelige voksne hanner og hunner i to separate, rene petriskåle.
2. Observation og videooptagelse af parringsadfærd
- Forbered flere konkave objektglas og tilsættes 200 pi sterilt dd H2O til hver af deres brønde.
- Saml den forberedte jomfru voksen mand eller og kvindelige med en kapillær nål og sætte kun én nematode i vandet af hvert konkave dias.
- Hold jomfruelige voksne inde brønden i 1 time for at lade dem tilpasse sig det nye vandigt miljø.
- Par en jomfru mandlige og kvindelige ved at overføre en af dem fra en brønd til en anden ved hjælp af en pipette.
- Vær opmærksom på parring adfærd 1♀ + 1♂ kombination i den konkave dias under et stereomikroskop.
- For at analysere parring effektiviteten af jomfruelige voksne, beregne deres parring succesrate (R) og sammenligne den med den af tilfældigt udvalgte voksne par. Beregn R som procentdelen af replikater, hvor blev observeret parring forhold til det samlede antal gentagelser undersøgt.
- For at indsamle data for kvalitativ og kvantitativ analyse, filme parring adfærd ved hjælp af video mikroskopi. Normalt er hele parring processen, fra det tidspunkt, hvor nematoderne er placeret i brønden af den konkave dias til det øjeblik, hvor de bevæger sig væk efter samleje, afsluttes inden 2 timer. Derfor optage parring proces uafbrudt i mindst 2 timer som en gentagelse. Komplet mindst 30 replikater i alt for hver kombination.
BEMÆRK: Læg mere steril dd H2O (normalt 50 uL) hver 0,5 time til brønden for at kompensere for fordampning under optagelsen.
3. Dataindsamling
- Se alle videoklip omhyggeligt på en computerskærm og karakterisere de sub-adfærd kvalitativt.
- Mål varigheden af parring ved hjælp the frame-by-frame funktion af videobåndoptageren. Manuelt trække starttidspunktet fra slutpunktet.
- For 1♀ + 1♂ kombination, analysere hver enkelt videooptagelse og måler varigheden af følgende begivenheder:
- Måler varigheden af søgningen (dvs. tiden fra når den kvindelige og mandlige indføres i brønden af den konkave slide til det øjeblik de støder og kontakte hinanden).
- Måler varigheden af kontakt mellem (dvs. tiden fra den første kontakt til det øjeblik, hvor den mandlige er præcist placeret ved hunnens vulva for første parring).
- Måler varigheden af kopulerende (dvs. tiden fra når hannen er præcist placeret ved hunnens vulva indtil han glider ned fra hunnens krop efter ejakulation). Bemærk: Nogle nematoder kan parre sig flere gange i 2 timer. I sådanne tilfælde måler varigheden af samleje fra det første samleje til slutningen af last én, inklusive den tid i mellem.
- Måler varigheden af dvælende (dvs. perioden efter parringen indtil den mandlige og kvindelige svømme bort fra hinanden og er adskilt af en afstand på mere end nematoderne 'kropslængde (sædvanligvis 1 mm)).
- Tæl parring hyppigheden og varigheden af hver samleje og den gennemsnitlige varighed af alle parringer i 2 timer for hver af de forskellige kombinationer (dvs. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, og 1♀ + 3♂).
- Beregn parring succesraten for den første kontakt (P) for de forskellige kombinationer som succesraten for parring efter den første kontakt, som foretages straks og uden afbrydelse. I kontakt fase, måske flere kontakter skal overholdes, før egentlige samleje.
- Når afstanden mellem to individer er mere end kroppen længde, overveje en kontaktperson til at være overstået. For én gentagelse, optage P som 100%, når samleje is observeret umiddelbart efter den første kontakt, uden pause, eller 0,00%, hvis ikke blev observeret nogen samleje, eller hvis der var samleje, men efter to eller flere kontakter.
BEMÆRK: Der var 30 gentagelser for hver kombination beskrevet her.
- Når afstanden mellem to individer er mere end kroppen længde, overveje en kontaktperson til at være overstået. For én gentagelse, optage P som 100%, når samleje is observeret umiddelbart efter den første kontakt, uden pause, eller 0,00%, hvis ikke blev observeret nogen samleje, eller hvis der var samleje, men efter to eller flere kontakter.
- Forbered en nål til at afhente nematoder ved at tegne et glas kapillarrør efter opvarmning det over en alkohol brænder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den parring succesrate (R) af ubrugte voksne var 86,67% i gennemsnit, hvilket var betydeligt højere end de tilfældigt udvalgte voksne: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figur 2). Dette fund tyder på, at det er lettere at observere parring adfærd B. xylophilus med jomfruelige voksne end med tilfældigt udvalgte voksne.
Når en mand blev parret med en kvindelig, hele parring processen varede 82,8 min i gennemsnit. Hele processen kan beskrives ved fire forskellige faser: søgning, kontakter, kopulerende og dvælende. Varigheden for disse fire faser var 21,8 ± 2,0 minutter, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 minutter og 7,2 ± 0,5 min, henholdsvis (figur 3). I en nylig publikation, beskrev vi de 11 sub-adfærd som cruising, nærmer sig, encountering, rørende, hooping, lokalisering, fastgørelse, sædafgang, adskillelse, ubevægelighed, og roaming 9.
Når en han mødte to eller flere hunner på samme tid, den mandlige syntes at parre tilfældigt med en af dem, uden udvælgelse. Dog blev der observeret oplagt parring valg for kvindelige B. xylophilus. Når en kvindelig kontaktet en mandlig, den kvindelige tendens til at røre ved mandens hoved, krop, hale, og genital region forsigtigt med hovedet og syntes at være at evaluere hendes potentiel partner. Hvis kvinden ikke accepterede den mandlige, hunnen forlod ham hurtigt og svømmede til en anden mand til den næste evaluering. En af hannerne blev derefter udvalgt af hunnen til parring. Parring succesrate efter den første kontakt (P) af det 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, og 1♀ + 3♂ kombinationer var 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, og 23,4 ± 7,4%, og forskellene mellem dem were signifikant (F = 8,21, df = 2, p = 0,0124) (figur 4).
Intrasexual konkurrence blev observeret i både hanner og hunner. Når en jomfru kvinde blev blandet med 3 jomfruelige hanner, hannerne forsøgte at nærme og kontakt hunnen så meget som muligt at få chancen for at passe sammen med hende. Da vulva var besat af en mandlig, de andre hanner forsøgte at forstyrre parring mandlige ved at bruge voldelige krop gynger eller trække for at adskille dem. Kvindelige intrasexual konkurrence blev set at være mere eller mindre ligner mandlige intrasexual konkurrence.
Parring succes primært afhang af det kvindelige. Når en kvindelig accepteret en mandlig, hannen bevægede sig langsommere og krøllede eller endda dannet en bøjle, og hunnen flyttet frem aktivt for at gøre det lettere for den mandlige at finde hende vulva og for at undgå interferens fra andre hanner. Hvis en kvindelig ikke accepterede en mandlig,hunnen forsøgte at ryste ham af, selv om mandlige havde monteret og placeret sig ved hendes vulva. På grund af den intrasexual konkurrence, samleje frekvenser af 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ og 1♀ + 3♂ kombinationer var 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 og 1,83 ± 0,074 henholdsvis og forskellene mellem dem var signifikant (F = 14,50, df = 2, p = 0,0001) (figur 5).
I vores undersøgelse, parring varighed varierede meget, med et minimum på 20 s og højst 42 min. Ifølge vores data, kan varigheden af samleje være naturligvis differentieret i to grupper: kortsigtede parringer, der varede mindre end 5 min, og langsigtede parringer, som varede længere end 10 min. Blev observeret tydelige forskelle mellem de forskellige grupper for den gennemsnitlige varighed af kortvarige samleje (F = 3,81, df = 2, P (F = 179,52, df = 2, p = 0,0001), og alle parringer (F = 2,93, df = 2, P = 0,0367) (figur 6).
Figur 1: genitalier Male og Female B. Xylophilus. (A) spicule af mandlige (blå pil). (B) vulva af kvindelige (rød pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Parring Succes Rate of Virgin voksne par og tilfældigt udvalgte voksne par af B. xylophilus. De beregnede middelværdier er fra 30 replikater. Den lodrette bar shows standard fejl. De forskellige små bogstaver angiver signifikante forskelle ved p <0,05 sammenlignet med Tukey test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Varighed af de 4 faser i Parring Processen med B. xylophilus. De beregnede middelværdier er fra 30 replikater. Den lodrette linje viser standardafvigelsen. De forskellige små bogstaver angiver signifikante forskelle ved p <0,05 sammenlignet med Tukey test. Den gennemsnitlige varighed af kopulere fase er 25,80 ± 0,71 min, hvilket er 31,17% af hele parring processen. Klik her for at se en større version af denne figenure.
Figur 4: Parring Succes for den første kontakt af B. xylophilus. De beregnede middelværdier er fra 30 gentagelser ± SE. Midler med det samme lille bogstav i hver kolonne er ikke signifikant forskellige ved P <0,05 sammenlignet med Tukeys Ærlig signifikant forskel test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: samleje Hyppigheden af B. xylophilus i forskellige grupper. De beregnede middelværdier er fra 30 gentagelser ± SE. Midler med det samme lille bogstav er ikke signifikant forskellige ved P <0,05, når compared af Tukeys Ærlig signifikant forskel test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: samleje varighed B. xylophilus. Midler med det samme lille bogstav inden for hvert sæt kolonner er ikke signifikant forskellige ved P <0,05 sammenlignet med Tukeys Ærlig signifikant forskel test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adfærdsmæssige tests er et grundlæggende aspekt af kemisk økologi, neurobiologi, molekylærbiologi og genetik. Nematoder og især C. elegans, er flittigt brugt til undersøgelser på disse områder. Parringsadfærden af C. elegans er tidligere 10-11 blevet undersøgt. Men B. xylophilus er gonochoristic og forskellig fra de hermafroditiske C. elegans, og dens dertil passende proces har forskellige adfærdsmæssige funktioner 9. For nylig blev parringsadfærd af Bursaphelenchus okinawaensis, en tvekønnede søster arter af B. xylophilus, rapporterede 12. Selvom forskellige eksperimentelle metoder blev anvendt, viste denne tvekønnede arter ligner sex tiltrækning til B. xylophilus, og mellem arterne tiltrækning mellem dem blev observeret. Denne tvekønnede søster arter kan anvendes som en model til at foretage yderligere undersøgelser på biologi Bursaphelenchus.
Denne protokol giver en vejledning om, hvordan man observere og undersøge adfærdsmæssige funktioner i B. xylophilus under parring. Vores resultater viste, at anvendelse af jomfruelige voksne nematoder er kritisk for at øge chancen for succes observere parring proces (figur 1). Indhentning J4 larver og præcist at skelne deres køn er to vigtige grundlæggende trin for erhvervelse af jomfruelige voksne. Under vores eksperimentelle betingelser (dvs. ved 25 ° C i mørke), den periode på 52 h er det rette tidspunkt til at få J4 fra J2 larver. Men der skelnes sex på det tidlige J4 scenen det meste afhænger af personlig erfaring. For at sikre nøjagtighed, er det nødvendigt for forskellige mennesker at dobbelttjekke tildelingen køn.
De adfærdsmæssige træk ved B. xylophilus under parring proces kan beskrives kvalitativt og analyseret kvantitativt ved at registrere varighederne af de fire forskelligeent faser, procentdelen af parring succes efter første kontakt, den parring frekvens, og parring varigheden af forskellige kombinationer. Interessant, for første gang, vi observerede parring valg af kvinder og stærke intra-seksuel konkurrence i både hanner og hunner. Ingen promiskuitet blev observeret; imidlertid kunne dette skyldes, at det begrænsede antal nematoder, der anvendes i vores undersøgelse. Denne protokol kan ikke kun anvendes til undersøgelse af parring adfærd B. xylophilus, men det kan også være nyttige og værdifulde som reference for andre nematoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Zhu og Liqun Bai bidrog ligeligt til dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af den særlige fond for skovbrug Videnskabelige Undersøgelser i den offentlige velfærd (201204501) og National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688, og 31.570.638). Vi takker Dr. Holighaus Gerrit og Dr. Danielle Hickford for deres nyttige forslag på engelsk skriftligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
