Abstract
Un metodo per osservare e quantificare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è stato istituito allo stereomicroscopio. Per migliorare l'efficienza di accoppiamento di B. Xylophilus e per aumentare le possibilità di osservazione accoppiamento, adulti vergini sono stati coltivati e utilizzati per l'indagine. Le uova sono stati ottenuti mantenendo i nematodi in acqua e permettendo le femmine di deporre le uova per 10 min. Le larve di secondo stadio (J2) sono stati sincronizzati incubando le uova per 24 ore a 25 ° C al buio, e il primo J4 sono stati ottenuti coltivando la J2 con muffa grigia, Botrytis cinerea, per un altro 52 h. A questo punto di tempo, la maggior parte dei nematodi J4 potrebbero essere chiaramente distinti come maschio o femmina usando la loro morfologia genitale. Il maschio e la femmina J4 sono stati raccolti e coltivate separatamente in due diverse piastre di Petri per 24 ore per ottenere nematodi adulti vergini. Un maschio e una femmina vergine vergine sono stati associati in una goccia di water nel pozzo di una diapositiva concava. Il comportamento di accoppiamento è stato girato con un videoregistratore allo stereomicroscopio. L'intera durata del processo di accoppiamento era 82,8 ± 3,91 min (media ± SE) e potrebbe essere diviso in 4 diverse fasi: ricerca, contatto, che copulano, e persistente. Il verbale medi di durata erano 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, rispettivamente. Undici sub-comportamenti sono stati descritti: crociera, si avvicina, incontrando, toccando, hoop, localizzare, allegando, eiaculazione, la separazione, quiescenza, e il roaming. È interessante notare che, evidente la concorrenza intra-sessuale è stata osservata quando una femmina è stata raggruppata con 3 maschi o un maschio con 3 femmine. Questo protocollo è utile e prezioso, non solo in indagare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus, ma anche in qualità di riferimento per studi comportamentali degli altri nematodi.
Protocol
1. Acquisizione di Virgin adulti Nematodi
- Nematode del pino isolato e condizioni di coltura
NOTA: Il B. xylophilus isolare Nxy61 è stato originariamente estratto da un malato massoniana Pinus nella zona di Ningbo della provincia di Zhejiang in Cina.- Preparare Potato Dextrose Agar (PDA, vedere la Tabella dei Materiali) piastre per la coltivazione di Botrytis cinerea.
- Per l'inoculazione, pugno un pezzo di tappeto funghi con diametro di 10 mm da un tappeto di B. cinerea e metterlo al centro di una nuova piastra PDA. Culture B. cinerea per 5 d a 25 ° C al buio.
- Cultura i nematodi pineta nella capsula di Petri preparato contenente B. cinerea a 25 ° C al buio.
- Acquisizione di B. xylophilus uova
- Posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e tenere l'imbuto preparata in un rack per montare ilApparecchio imbuto Baermann. Inserire due strati di carta filtro, invece di garza in bocca dell'imbuto.
- Trasferire le colture fungine per la messa a punto imbuto e aggiungere acqua fino a quando il tappeto fungina è immerso. Attendere 2 h, e nematodi usciranno dalla cultura fungina, attraversare la carta da filtro, e stabilirsi nella parte più bassa dell'imbuto Baermann.
- Raccogliere il primo paio di gocce di acqua dal fondo del tubo in un tubo da 15 ml e raccogliere nematodi rilasciando lentamente il morsetto sul tubo.
- Centrifugare le collezioni precedenti a 3.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere lo strato superiore di acqua con una pipetta e risospendere con 1 ml di sterile bidistillata (dd) H 2 O.
- Con una pipetta, trasferire la risospensione sopra per un piatto di Petri nuovo vetro (6 cm di diametro). Aggiungere 3 mL di soluzione sterile dd H 2 O alla piastra di Petri per garantire che i nematodi sono in grado di nuotare liberamente.
- Tenere i nematodi nel bicchieres Petri per 10 min a 25 ° C al buio. Le uova saranno deposte da femmine gravide. A causa della loro superficie glicoproteina, le uova si attacchi al fondo del piatto di vetro Petri.
- Rimuovere l'acqua e vermi con attenzione, senza disturbare le uova. Aggiungere 3 ml di sterile dd H 2 O per il piatto di vetro Petri immediatamente per evitare che le uova si secchi.
- Ripetere il passaggio 1.2.8 3x per rimuovere tutte le larve e gli adulti, e di ottenere le uova puri. Aggiungere un supplemento di 2 ml (5 ml in totale) di sterile dd H 2 O alla piastra di Petri.
- Acquisizione dei giovani quarto stadio (larve J4)
- Hatch le uova raccolte per 24 ore al buio a 25 ° C per ottenere J2 larve.
- Trasferire le larve J2 con una pipetta in una provetta 15 mL, centrifugare a 3000 xg per 2 minuti, e rimuovere lo strato superiore di acqua.
- Risospendere le larve J2 con 200 ml di sterile dd H 2 O, e poi trasferirlila piastra PDA contenente B. cinerea.
- Cultura larve J2 per 52 ore a 25 ° C al buio. A questo punto di tempo, la maggior parte delle larve J2 avrà sviluppato nella fase iniziale della J4 larve.
- Acquisizione di nematodi Adulto Vergine
- Preparare un ago per la raccolta di nematodi disegnando un capillare di vetro dopo il riscaldamento sopra un bruciatore di alcol.
NOTA: La punta di questo ago capillare di solito deve essere di 50 micron di diametro, circa la larghezza del corpo di un nematode adulti, in modo che possa essere utilizzata come strumento per prelevare un singolo nematode. - Assemblare un imbuto Baermann ed estrarre nematodi delle culture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3.
- Trasferire il J4 con acqua in un piatto pulito Petri.
- Osservare i nematodi allo stereomicroscopio e distinguere tra maschi e femmine per la morfologia dei genitali, come descritto da Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 NOTA: Non ci sono più donne che uomini, con la percentuale di femmine a 60 - 70%. La vulva femminile è ovviamente diversa dalla spicule maschile. Rispetto al l'adulto, il spicule o vulva in fase iniziale J4 è più piccolo, ma possono ancora essere facilmente visibile e distinto. Il nematode è sempre in movimento nell'acqua, che a volte aumenta la difficoltà di distinguere maschi e femmine.
- Cultura larve J4 per altre 24 ore a 25 ° C al buio.
NOTA: Tutte le nematodi dovrebbero sviluppare in adulti, ma dal momento che sono disaccoppiati, essi sono considerati come adulti vergini. - Assemblare due Baermann imbuti ed estrarre i adulti vergini dalle colture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3, e trasferire i maschi adulti e femmine vergini in due piatti separati puliti Petri.
2. Osservazione e registrazione video di comportamento di accoppiamento
- Preparare diverse diapositive concave e aggiungere 200 ml di sterile dd H 2 O a ciascuno dei loro pozzi.
- Sollevare il preparato maschio adulto vergini o femminile e con un ago capillare e mettere solo un nematode nell'acqua di ogni diapositiva concava.
- Mantenere le vergini adulti all'interno del pozzo per 1 ora per far loro adattarsi al nuovo ambiente acquoso.
- Associare un maschio e femmina vergine trasferendo uno di loro da un bene ad un altro con una pipetta.
- Osservare il comportamento di accoppiamento del 1♀ + 1♂ combinazione nella diapositiva concava allo stereomicroscopio.
- Per analizzare l'efficienza di accoppiamento degli adulti vergini, calcolare il loro tasso di successo di accoppiamento (R) e confrontarlo con quello delle coppie di adulti selezionati in modo casuale. Calcolare R come la percentuale di repliche in cui si è osservata copulazione rispetto al numero totale di repliche studiati.
- Al fine di raccogliere dati per l'analisi qualitativa e quantitativa, filmare il comportamento di accoppiamento con il video microscopia. Normalmente, l'intero processo di accoppiamento, dal momento in cui i nematodi sono posti nel pozzo della slitta concava al momento in cui si allontanano dopo l'accoppiamento, viene completata entro 2 ore. Pertanto, registrare il processo di accoppiamento continuo per almeno 2 ore come una replica. Completa almeno 30 replicati in totale per ciascuna combinazione.
NOTA: Aggiungere più sterile dd H 2 O (di solito 50 mL) ogni 0,5 h al pozzo per compensare l'evaporazione durante il processo di registrazione.
3. Raccolta dati
- Guarda tutti i video accuratamente sullo schermo del computer e caratterizzare i sub-comportamenti qualitativamente.
- Misurare la durata di accoppiamento utilizzando thfunzione e frame-by-frame del videoregistratore. sottrarre manualmente il tempo a partire dal punto finale.
- Per la combinazione 1♀ + 1♂, analizzare ogni registrazione video e misurare la durata dei seguenti eventi:
- Misurare la durata di ricerca (cioè, il tempo da quando la femmina e maschio sono introdotti nel pozzo del vetrino concava al momento incontrano e contatto tra loro).
- Misurare la durata del contatto (cioè, il tempo dal primo contatto al momento in cui il maschio è esattamente posizionato vulva della femmina del primo accoppiamento).
- Misurare la durata di copulare (cioè, il tempo da quando il maschio è posizionata precisamente vulva della femmina fino a che scivola dal corpo della femmina dopo l'eiaculazione). Nota: alcuni nematodi possono copulare più volte in 2 ore. In tali casi, misurare la durata di copulazione dalla prima copulazione alla fine del last uno, compreso il tempo in mezzo.
- Misurare la durata di persistente (cioè, il periodo successivo accoppiamento finché il nuoto maschio e femmina distanti l'uno dall'altro e sono separati da una distanza di più di lunghezza del corpo dei nematodi '(di solito 1 mm)).
- Contare la frequenza copulazione e la durata di ogni accoppiamento e la durata media di tutti copulazioni in 2 h per ciascuna delle diverse combinazioni (cioè, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂).
- Calcolare il tasso di successo di accoppiamento per il primo contatto (P) per le diverse combinazioni come il tasso di successo di accoppiamento dopo il primo contatto, che è condotto immediatamente e senza alcuna interruzione. Nella fase a contatto, più contatti possono essere osservati prima copula reale.
- Quando la distanza tra due individui è superiore alla lunghezza del corpo, si consideri un contatto essere finita. Per una replica, record di P come il 100% quando l'accoppiamento is osserva immediatamente dopo il primo contatto, senza interruzione, o 0,00% se è stata osservata alcuna copulazione o se c'era copulazione ma dopo due o più contatti.
NOTA: Ci sono stati 30 repliche per ogni combinazione qui descritta.
- Quando la distanza tra due individui è superiore alla lunghezza del corpo, si consideri un contatto essere finita. Per una replica, record di P come il 100% quando l'accoppiamento is osserva immediatamente dopo il primo contatto, senza interruzione, o 0,00% se è stata osservata alcuna copulazione o se c'era copulazione ma dopo due o più contatti.
- Preparare un ago per la raccolta di nematodi disegnando un capillare di vetro dopo il riscaldamento sopra un bruciatore di alcol.
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Representative Results
Il tasso di successo di accoppiamento (R) degli adulti vergini era 86,67% in media, che era significativamente più elevata di quella degli adulti selezionati casualmente: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figura 2). Questa scoperta suggerisce che è più facile osservare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus con gli adulti vergini che con gli adulti selezionati casualmente.
Quando un maschio è stato accoppiato con una femmina, l'intero processo di accoppiamento durato 82,8 min in media. L'intero processo potrebbe essere descritto da quattro diverse fasi: ricerca, contattando, copulare, e persistente. La durata di queste quattro fasi era 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 min, 25,8 ± 0,7 min, e 7,2 ± 0,5 min, rispettivamente (Figura 3). In una recente pubblicazione, abbiamo descritto i 11 sotto-comportamenti, come la crociera, si avvicina, encountering, toccante, hoop, localizzare, allegando, eiaculazione, la separazione, quiescenza, e il roaming 9.
Quando un maschio incontrato due o più femmine simultaneamente, il maschio sembrava accoppiarsi casualmente con uno di essi, senza alcuna selezione. Tuttavia, la scelta di accoppiamento ovvia è stata osservata per le femmine B. xylophilus. Quando una donna ha contattato un maschio, la femmina tende a toccare la testa del maschio, corpo, coda e regione genitale delicatamente con la testa e sembrava essere valutare il suo potenziale partner. Se la femmina non ha accettato il maschio, la femmina lo ha lasciato in fretta e nuotò ad un altro maschio per la prossima valutazione. Uno dei maschi è stato poi scelto dalla femmina per l'accoppiamento. Accoppiamento tassi di successo dopo il primo contatto (P) del 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, e 1♀ + 3♂ combinazioni erano 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, e il 23,4 ± 7,4%, rispettivamente, e le differenze tra loro Were significativa (F = 8.21, df = 2, p = 0,0124) (Figura 4).
concorrenza intrasessuale è stata osservata sia nei maschi che nelle femmine. Quando una femmina vergine è stato mescolato con 3 maschi vergini, i maschi hanno cercato di avvicinarsi e contattare la femmina più possibile di avere la possibilità di accoppiarsi con lei. Quando la vulva era occupata da un maschio, gli altri maschi cercato di disturbare il maschio di accoppiamento utilizzando altalene corpo violenti o trascinando separarle. Female concorrenza intrasessuale è stato visto ad essere più o meno simile alla concorrenza intrasessuale maschile.
successo accoppiamento dipendeva principalmente sulla femmina. Quando una donna ha accettato un maschio, il maschio si mosse più lentamente e arricciato o anche formato un cerchio, e la femmina spostato in avanti attivamente per rendere più facile per il maschio per individuare la vulva e per evitare interferenze da altri maschi. Se una donna non ha accettato un maschio,la femmina ha cercato di scrollarsi di dosso, anche se il maschio aveva montato e si è posizionato con la sua vulva. A causa della concorrenza intrasessuale, frequenze copula del 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, e 1♀ + 3♂ combinazioni erano 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 e 1,83 ± 0,074, rispettivamente, e le differenze tra loro erano significativa (F = 14.50, df = 2, p = 0,0001) (Figura 5).
Nella nostra ricerca, la durata copulazione varia notevolmente, con un minimo di 20 s e un massimo di 42 min. Secondo i nostri dati, la durata della copulazione potrebbe essere ovviamente differenziato in due gruppi: accoppiamenti a breve termine, che è durato meno di 5 minuti, e accoppiamenti a lungo termine, che è durato più di 10 min. Sono state osservate differenze evidenti tra i diversi gruppi per la durata media di copulazione a breve termine (F = 3,81, df = 2, P (F = 179.52, df = 2, p = 0,0001), e tutti gli accoppiamenti (F = 2,93, df = 2, p = 0,0367) (Figura 6).
Figura 1: genitali maschile e femminile B. Xylophilus. (A) spicule di sesso maschile (freccia blu). (B) la vulva di sesso femminile (freccia rossa). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: accoppiamento tasso di successo di Coppie Virgin adulti e coppie di adulti selezionati in modo casuale di B. xylophilus. I valori medi calcolati sono da 30 ripetizioni. Lo spettacolo barra verticales l'errore standard. Le diverse lettere minuscole indicano differenze significative con p <0.05 rispetto per il test di Tukey. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Durata delle 4 fasi del processo di accoppiamento di B. xylophilus. I valori medi calcolati sono da 30 ripetizioni. La barra verticale mostra l'errore standard. Le diverse lettere minuscole indicano differenze significative con p <0.05 rispetto per il test di Tukey. La durata media della fase di accoppiarsi è 25.80 ± 0,71 min, che è 31,17% di tutto il processo di accoppiamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figure.
Figura 4: Il successo di accoppiamento per il primo contatto di B. xylophilus. I valori medi calcolati sono da 30 repliche ± SE. Mezzi con la stessa lettera minuscola all'interno di ciascuna colonna non sono significativamente diversi a P <0.05 rispetto da prova significativa differenza di Honest di Tukey. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Accoppiamento Frequenza di B. xylophilus in diversi gruppi. I valori medi calcolati sono da 30 repliche ± SE. Mezzi con la stessa lettera minuscola non sono significativamente diversi a P <0.05 quando bozzettoared dalla prova significativa differenza di Honest di Tukey. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Accoppiamento Durata di B. xylophilus. Mezzi con la stessa lettera minuscola all'interno di ogni set di colonne non sono significativamente diversi a P <0.05 rispetto da prova significativa differenza di Honest di Tukey. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
test comportamentali sono un aspetto fondamentale di ecologia chimica, la neurobiologia, la biologia molecolare e la genetica. Nematodi, e in particolare C. elegans, sono ampiamente utilizzati per gli studi in questi settori. Il comportamento di accoppiamento di C. elegans è stato studiato in precedenza 10-11. Tuttavia, B. xylophilus è gonochoristic e diverso dagli ermafroditi C. elegans, e il suo processo di accoppiamento ha diverse caratteristiche comportamentali 9. Recentemente, il comportamento di accoppiamento di Bursaphelenchus okinawaensis, una specie ermafrodita sorella di B. xylophilus, è stato segnalato 12. Anche se sono stati utilizzati diversi metodi sperimentali, questa specie ermafrodita mostrato attrazione sessuale simile a B. xylophilus, ed è stato osservato attrazione interspecifica tra loro. Questa specie sorelle ermafrodite potrebbero essere utilizzati come modello per condurre ulteriori indagini sulla biologia di Bursaphelenchus.
Questo protocollo fornisce una linea guida su come osservare e studiare le caratteristiche comportamentali di B. xylophilus durante l'accoppiamento. I nostri risultati hanno dimostrato che l'utilizzo di nematodi Adulto Vergine è fondamentale per aumentare la probabilità di osservare con successo il processo di accoppiamento (Figura 1). Ottenere J4 larve e distinguere con precisione i loro sessi sono due importanti passaggi fondamentali per l'acquisizione di adulti vergini. Nelle nostre condizioni sperimentali (cioè, a 25 ° C al buio), il periodo di 52 h è il momento corretto per ottenere J4 J2 da larve. Tuttavia, distinguendo il sesso nella fase J4 precoce dipende in gran parte l'esperienza personale. Per garantire la precisione, è necessario che le persone diverse per controllare due volte l'assegnazione del sesso.
Le caratteristiche comportamentali di B. xylophilus durante il processo di accoppiamento possono essere descritte qualitativamente e quantitativamente analizzati registrando le durate dei quattro differirefasi ent, la percentuale di successo dell'accoppiamento dopo il primo contatto, la frequenza copulazione, e la durata copulazione di combinazioni diverse. È interessante notare che, per la prima volta, abbiamo osservato scelta accoppiamento con femmine e forte concorrenza intra-sessuale in maschi e femmine. Non è stata osservata la promiscuità; tuttavia, questo potrebbe essere dovuto al numero limitato di nematodi utilizzati nella nostra indagine. Questo protocollo non può essere utilizzato solo per indagare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus, ma può anche essere utile e prezioso come riferimento per altri nematodi.
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Acknowledgments
Najie Zhu e Liqun Bai contribuito in maniera uguale a questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Fondo speciale per la ricerca scientifica forestale nel benessere pubblico (201.204.501) e la National Science Foundation naturale della Cina (31.170.604, 31.270.688 e 31.570.638). Ringraziamo il Dott Holighaus Gerrit e il Dr. Danielle Hickford per i loro utili suggerimenti sulla scrittura inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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