Protocol
注：可诱导的LAP标记的稳定细胞株为任何感兴趣的蛋白质的产生的概述在图1中被示出和LAP标记蛋白的表达，纯化和大规模蛋白质制剂的概要分析在图3中示出。
1.克隆兴趣的基因的开放阅读框（ORF）到LAP-标签矢量
- 克隆兴趣的基因的ORF到穿梭载体。
- 使用聚合酶链反应（PCR），以扩增感兴趣的ORF用引物内的适当attB1和attB2位点对是N-端融合或C端融合。 见表1对PCR条件引物序列和表2中 。
- 凝胶通过解决这些问题，在1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。切除扩增带，它是从凝胶中的正确的大小和使用DNA得自凝胶切片提取它埃尔提取试剂盒根据制造商的说明。
- 孵育含有PCR产物与含有穿梭载体的attP位并允许PCR产物重组到载体中按照制造商的说明重组的纯化的attB位（参见主材料板表 ）。
注：空穿梭载体和LAP-标记载体包含的CCD B基因在CCD B抗性的细菌细胞中传播（见材料表 ）。然而CCDB基因重组出时的ORF插入这些载体中，从而用克隆的ORF传播矢量时使用标准的DH5α 大肠杆菌细胞。 - 转化DH5α 大肠杆菌细胞用1μl的反应产物和板转化细胞到的Luria肉汤（LB）琼脂平板上以50毫克/毫升卡那霉素的13。
- 选择卡那霉素抗性菌落。
- 生长在LB我所选择的菌落直径为50毫克/毫升卡那霉素，使的DNA小量制备和使用表3中列出的测序引物通过DNA测序确认基因整合。
- 从传送穿梭载体兴趣的基因导入LAP-标签矢量。
- 孵育含有感兴趣ORF的序列经过证明的基因与LAP-标签载体（pGLAP1对于N末端融合）和介导的目的基因的从穿梭载体转移入LAP-标签矢量按照所述重组穿梭载体制造商的说明（参见材料）。
注：一系列可根据所需的启动子，表位标签被用于LAP / TAP矢量，和N-或C-末端标记可以在表4中找到。 - 转化DH5α 大肠杆菌细胞用1μl的反应产物和板转化细胞上的LB琼脂板上，以100毫克/毫升氨苄青霉素13。
- 选择氨苄青霉素抗性结肠新兴工业化经济体。
- 生长在LB培养基将该选出的菌落用100毫克/毫升氨苄青霉素，使的DNA小量制备，并使用表5中所列的测序引物通过DNA测序确认基因整合。
- 孵育含有感兴趣ORF的序列经过证明的基因与LAP-标签载体（pGLAP1对于N末端融合）和介导的目的基因的从穿梭载体转移入LAP-标签矢量按照所述重组穿梭载体制造商的说明（参见材料）。
2.生成诱导型稳定的细胞系，表达利益的LAP标记基因
- 选择最适合于所关注的项目的细胞系。可替代地，创建从组成型表达的四面体和含有FRT位点，允许感兴趣的LAP标记基因被稳定地整合进基因组（参见材料）的任何现有的细胞系的宿主细胞系。
注意：此协议使用包含四面体和FRT位点，这是在-Tet的DMEM / F12培养基4 [用10％胎牛血清（FBS），该不含四环素（-Tet）制成]中生长的HEK293细胞系。 - 确定潮霉素的最小浓度必须在1个宿主细胞系杀死2凌晨药品加成后，KS。浓度可宿主细胞系之间变化，以100微克/毫升和800微克/毫升之间最测距。
注：在37℃和5％的CO 2将在1-2周内死亡在-Tet的DMEM / F12培养基中生长，100微克/毫升潮霉素HEK293细胞。 - 共转染表达所述翻转酶的重组酶使用转染试剂（介导的兴趣到细胞的基因组中的FRT位点的LAP标记基因的整合）与LAP标记载体导入HEK293细胞的载体按制造商的说明。使用的4比：重组酶载体的1至LAP矢量14。
注：最佳比例依赖于转染的宿主细胞系和方法，并可能需要一个滴定。 4：1的比例适用于大多数细胞系。包括一个模拟转板作为阴性对照。 - 有一天，转染后，用新鲜的介质替换-Tet DMEM / F12培养基。
- 两天后transfecti上分裂细胞25％汇合。允许细胞〜5小时附着，然后在2.2步一定的浓度添加含潮霉素-Tet DMEM / F12培养基。对HEK293细胞用100μg/ ml的潮霉素。
注：含有HEK293细胞系的FRT还包含与杀稻瘟抗性相关，因此在稳定细胞系的选择过程中使用5微克/毫升杀稻瘟选择用于四面体，并尽量减少渗漏表达的四面体。 - 更换含潮霉素-Tet DMEM / F12媒体直到需要不同的细胞灶出现类似于对透明板不透明的斑。
- 加入20微升胰蛋白酶对每一个细胞灶顶部和吸管上下2次用200μl枪头。位置细胞在24孔板并展开在含有潮霉素-Tet的DMEM / F12培养基的细胞不断生长。
- 屏幕细胞诱导LAP-标记的蛋白质表达固定细胞或活细胞荧光显微镜和/或Western印迹的LAP-标签15中的GFP标记。
3. LAP标记的蛋白复合物的分离纯化
注：用于基于先前的经验的典型LAP标签蛋白纯化条件和卷下LAP标签蛋白纯化协议细节的建议。然而，应谨慎行事，以确保实验优化的利息蛋白复合物及蛋白表达水平，以提供最好的结果进行。
- 细胞生长和细胞收获。
- 扩大为蛋白质复合物的TAP隔离的验证LAP标记细胞系，由所有的HEK293细胞不断传代入-Tet的DMEM / F12介质更大的板和/或滚瓶在37℃和5％的CO 2。
- 对于四环素/阿霉素诱导的细胞系，诱导10-15小时在0.2微克/毫升四环素/ DOX当细胞达到〜70％汇合的浓度harvestin前G细胞。
注：浓度和诱导时间应确定每个蛋白质，建议0.1-1微克/毫升四环素/ DOX的10-15小时的滴定。 - 收获细胞通过搅拌或胰蛋白酶消化和沉淀的细胞以875 xg离心5-10分钟。
- 耦合抗GFP抗体蛋白A珠
- 从0.5 ml细胞沉淀制备的裂解物中，红细胞压积（PCV）的使用抗体的40微克进行免疫沉淀。
注：将取决于大量的LAP-标记的蛋白质，以及其他因素的需要的抗体的量，并且将需要优化。推荐10-40微克的滴定。 - 平衡160微升填充体积（PV）的蛋白A珠成的PBST（PBS + 0.1％吐温20）在1.5ml管中。用1ml的PBST洗涤3次。
注意：本文中所有的洗涤液通过在5000 xg离心离心珠子，持续10秒进行。 - 珠悬浮在500微升PBST并加入80微克亲和力- 纯化的兔抗GFP抗体的160微升小珠每个管。混合，在室温下（RT）1小时。
- 用1ml的PBST洗涤珠2次。然后，洗涤珠子2次，用1ml的0.2M硼酸钠，pH值9（20毫升0.2M的硼酸钠+15毫升的0.2M硼酸）的。最后一次洗涤后，加入900微升硼酸0.2M的钠，pH为9，使最终体积至1ml。
- 加入100微升220毫dimethylpimelimidate（DMP）的为20毫米的最终浓度。轻轻旋转试管在室温30分钟。对于220毫米DMP，悬浮1个50毫克一瓶内容877微升0.2M的硼酸钠，pH值9，并立即加入到珠悬浮液。
- 与DMP温育后，洗涤珠子1次用1毫升的0.2M乙醇胺，0.2M NaCl的pH 8.5的灭活残留交联剂。在1ml的相同缓冲液重悬珠子旋转在RT 1小时。沉淀珠粒并在500微升的0.2M乙醇胺，0.2M NaCl的pH 8.5的悬浮珠粒。珠是Severa的稳定升个月在4℃。
- 从0.5 ml细胞沉淀制备的裂解物中，红细胞压积（PCV）的使用抗体的40微克进行免疫沉淀。
- 缓冲区的细胞裂解复杂的纯化制备方法
- 通过使pH为7.4的溶液;制备LAPX缓冲器（300毫对于细胞裂解，200mM的大多数珠粒洗涤，和100mM洗涤珠粒之前洗脱的蛋白质，其中X为所需的盐的浓度[毫米氯化钾]的LAP缓冲器的）含有50mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）中，X毫米氯化钾，1mM的乙二醇四乙酸（EGTA），1mM的MgCl 2的，和10％甘油。
注：此缓冲区的组件用于在活细胞来近似环境。 HEPES用作在7.2-8.2的pH值愤怒的缓冲器。氯化钾是用于维持缓冲液的离子强度的盐。 EGTA是结合的钙离子，以减少相比镁钙的水平螯合剂。甘油和MgCl 2的用于提高蛋白质的稳定性。 - 通过添加0.05％壬phenoxypol准备LAPX N缓冲yethoxylethanol到LAPX缓冲区。
注：壬phenoxypolyethoxylethanol是温和的洗涤剂增溶的蛋白质，但保留蛋白质 - 蛋白质相互作用，从而在提取过程中使用较高的浓度，然后将其在结合和洗涤步骤降低。
- 通过使pH为7.4的溶液;制备LAPX缓冲器（300毫对于细胞裂解，200mM的大多数珠粒洗涤，和100mM洗涤珠粒之前洗脱的蛋白质，其中X为所需的盐的浓度[毫米氯化钾]的LAP缓冲器的）含有50mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）中，X毫米氯化钾，1mM的乙二醇四乙酸（EGTA），1mM的MgCl 2的，和10％甘油。
- 细胞裂解液的制备
- 悬浮500微升PCV成2.5毫升LAP300的用0.5mM二硫苏糖醇（DTT）和蛋白酶抑制剂。加入90微升10％壬phenoxypolyethoxylethanol（0.3％最终），并通过倒置混合。
- 在冰上放置10分钟。离心在21000 XG 10分钟。收藏本低速上清液（LSS）。就拿LSS的凝胶分析10微升的样品。
- 在4℃LSS转移到TLA100.3管旋在100,000 XG 1小时。收藏本高速上清液（HSS），在管置于冰上。就拿HSS的凝胶分析10微升的样品。
注意：避免采取最上面的脂质层的D中的底部最细胞碎片层。脂质层应由之前收集所述HSS真空抽吸除去。
- 首先亲和捕获：绑定到抗GFP珠
- 预洗脱抗体偶联的珠子（用160微升每0.5ml细胞沉淀（PCV）珠）由1毫升洗脱缓冲液[3.5米氯化镁 20毫米的Tris，pH值7.4的洗完3次摆脱解耦抗体和降低背景。快速完成。不要留在高盐珠子很长一段时间。
- 用1ml的LAP200Ñ洗涤珠粒3次。混合HSS与抗体珠提取1小时，在4℃。离心在21000 XG 10分钟。取上清的10微升样品（ 即通过（FT）的流量）进行凝胶分析。
- 用1ml的LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂洗珠子3次。用1ml的LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂的洗涤珠2次（每次5分钟）。快洗2吨输入法编辑器与用0.5mM DTT加入1ml LAP200 N和添加烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶之前没有蛋白酶抑制剂。
- TEV切割
- 稀释为10μgTEV蛋白酶在1ml LAP200 N和在4℃旋转管过夜。
注意：此步骤可以为任何LAP标记蛋白进行优化，以在几个小时内，通过调整TEV蛋白酶的浓度，这可以帮助LAP标记蛋白质复合物的保存完成。 - 粒料珠和转移上清液至新管。用160微升LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂（三重浓度）冲洗珠子两次，以除去任何残留的蛋白。取上清液进行凝胶分析的10微升样品。
- 稀释为10μgTEV蛋白酶在1ml LAP200 N和在4℃旋转管过夜。
- 二亲和捕获：绑定到的S蛋白琼脂糖
- 洗80微升S蛋白琼脂糖浆液1管（40微升填充树脂）用1ml LAP200 N 3次。
注：•PROTEIN结合到S-标签将重组活性RNA酶和一个替代性的第二表位标签应考虑含RNA的蛋白质的复合物。 - 添加TEV在4℃洗脱上清液S蛋白琼脂糖珠岩3小时。沉淀小珠和洗涤3次用1毫升LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂。用1毫升LAP100洗珠2次。
- 洗80微升S蛋白琼脂糖浆液1管（40微升填充树脂）用1ml LAP200 N 3次。
- 蛋白质洗脱
- 通过加入50μl4×Laemmli样品缓冲液和热的在97℃下进行10分钟的琼脂糖洗脱蛋白质关S蛋白。
注：蛋白质，也可以从用洗脱缓冲液（3.5米的MgCl 2用20mM Tris，pH 7.4）中的珠洗脱。
- 通过加入50μl4×Laemmli样品缓冲液和热的在97℃下进行10分钟的琼脂糖洗脱蛋白质关S蛋白。
4.确定通过质谱分析相互作用的蛋白质
- 通过分析通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），银染凝胶的收集的样品测试纯化的质量（见
- 以确定化学计量和亚化学计量的共同净化物种，采取最终洗脱样品并通过SDS-PAGE分离它。染色用质谱兼容蛋白染色的凝胶。切除最突出的带，并从凝胶中它们之间的空间并对其进行处理用于通过质谱法分别16分析。
注：有分离最终纯化洗脱液，并为他们准备质谱5无数的方法。例如，LAP-纯化络合物可以由S蛋白珠通过使用高盐（3.5米的MgCl 2）和整个蛋白群集体可以通过质谱法17进行分析洗脱。可替换地，最终洗脱物可以1毫米×SDS-PAGE和一个1 mm表带能电子被分离xcised和分析。这将清除的任何珠粒或颗粒物质，将干扰分析的复杂混合物。
Representative Results
为了突出本系统的效用，牛头微管结合蛋白的开放读框（ORF）通过用含有attB1和attB2位点的引物扩增头的ORF（ 表1）和温育PCR产物与克隆入穿梭载体穿梭载体和介导的PCR产物插入到穿梭载体中的重组酶。反应产物被用来从卡那霉素抗性菌落变换DH5α菌13和质粒DNA进行测序，以确保头插入。然后，序列进行验证穿梭头载体使用时，通过与pGLAP1矢量孵育穿梭头载体的头的ORF转移到pGLAP1载体，其稠合头在帧与LAP（EGFP-TEV-S蛋白）标记和介导的ORF从穿梭载体来pGLAP1转印重组酶。该反应产物用于转化DH5α细菌从氨苄青霉素抗性菌落13和质粒DNA进行测序，以确保LAP-头融合在框架上。序列验证pGLAP1-LAP-头，然后共转染用表达所述翻转酶的重组酶入HEK293细胞含有单一的翻转酶识别目标的基因组中（FRT）位点，其是集成为LAP标记基因的位点的载体14。该细胞系还表示，结合春节运营商LAP-标记基因的上游和沉默在没有四环素/ DOX其表达四面体。稳定整合体选择具有-Tet的DMEM / F12培养基用100微克/毫升潮霉素5天。个别潮霉素耐药细胞灶加顶部20微升胰蛋白酶和上下吹打2次收获。细胞置于24孔板并在-Tet的DMEM / F12培养基持续增长扩大。
要验证潮霉素耐药细胞小号是能够表达LAP-头的，HEK293 LAP-头细胞用0.1微克/毫升阿霉素诱导的15小时和蛋白质提取物从非诱导和阿霉素诱导的细胞制备。这些提取物用SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜，并进行免疫印迹对GFP和微管蛋白作为上样对照。如在图4A中 ，LAP-头看到（可视化与抗GFP抗体）仅在霉素的存在下表达。以验证LAP-头被正确地定位于有丝分裂过程中的有丝分裂的微管纺锤体，如先前已示出为内源性头18，HEK293 LAP-头细胞用0.1微克/毫升阿霉素诱导的15小时和固定细胞，用4％多聚甲醛和共染色的DNA（赫斯特33342）和微管（抗微管蛋白抗体）。一致，LAP-头被有丝分裂的中期（ 图4B）中定位于有丝分裂纺锤体。要验证LAP-头及其相互作用的蛋白质可能与此SYS提纯统，HEK293 LAP-头细胞滚瓶至〜70％汇合生长，用0.1微克/毫升阿霉素诱导的15小时，通过搅拌收获，用LAP300缓冲液裂解，并使用上述协议纯化LAP-头。从LAP-头纯化洗脱液用SDS-PAGE分离和将凝胶银染色。 图4C显示了LAP-头净化，标有星号是LAP-头和其他几个乐队指示头相互作用的蛋白质可以看出。
图1：LAP- 标记诱导稳定细胞系的利息的任何蛋白的生成概述。感兴趣的基因的开放阅读框（ORF）的扩增与attB1和attB2位点侧翼的5'和3'末端序列，（引物序列在给定的 表1），并克隆到穿梭载体。与感兴趣的基因序列已验证穿梭载体然后用于感兴趣的基因转移到pGLAP1载体。验证pGLAP1载体用感兴趣的基因序列是然后共转染用含有翻转重组到一个包含单一翻转酶识别目标的基因组中（FRT）位点，其是集成为LAP的部位所需要的细胞系中的矢量-tagged基因。这些细胞系也表达了四环素阻遏（四面体）结合春节运营商（TETO 2）LAP-标记基因的上游和沉默在没有四环素/阿霉素的表达。然后感兴趣的LAP标记基因被重组到FRT位点和稳定的整合与潮霉素选择。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2： 对申请LAP标记的稳定细胞系概述。 LAP标记诱导的稳定细胞株被诱导表达的由阿霉素加成感兴趣LAP标签蛋白，并且可以在细胞周期的不同阶段进行同步，或者可以与化学品或配体刺激以激活任何所需的信号传导途径。感兴趣的LAP标签蛋白的亚细胞定位可以通过活细胞或固定细胞成像进行分析。 LAP标签的蛋白质也可以是串联亲和纯化，和它们的相互作用的蛋白质可以通过液相色谱串联质谱法（LC-MS / MS）来鉴定。最后，Cytoscape中可用于产生诱饵蛋白的蛋白 - 蛋白相互作用网络。 DOX表示强力霉素，IP表示免疫沉淀，EGFP表示增强型绿色荧光蛋白，Tev来表示TEV蛋白酶切割位点，S表示S标签。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：LAP- 标记蛋白的表达，纯化和制备质谱的概述。该协议具有9个步骤：1）LAP标记蛋白表达的生长和诱导，2）细胞收获和裂解，3）制备的裂解物的，4）以抗GFP珠裂解物的结合，5）TEV蛋白酶裂解将GFP标签，6）的裂解物的至S蛋白珠结合，7）诱饵蛋白和相互作用蛋白，以及8-9）对于基于质谱的蛋白质组分析的样品的制备的洗脱。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图4：LAP- 头表达的验证。 （A）中Western印迹（WB）从用抗GFP和抗微管蛋白抗体探测以检测LAP标记Tau蛋白和微管蛋白上样对照，分别未诱导和阿霉素诱导的LAP-头HEK293细胞蛋白质样品的分析。请注意，当细胞与阿霉素诱导的LAP-头只表述。表达LAP-头（B）的有丝分裂细胞固定并共染色用抗微管蛋白抗体和LAP-tau蛋白的亚细胞定位进行DNA（赫斯特33342）和微管蛋白（浴缸）通过荧光显微术进行分析。注意，LAP-头有丝分裂过程中定位于有丝分裂纺锤体和纺锤体极。 （C）银染色LAP-头净化凝胶。 MW表示分子量，CL表示清除裂解液和E印度语阿泰最终洗脱液。样品在4-20％SDS-PAGE上运行，并将凝胶银染以显现纯化的蛋白质。注意，对应于LAP-头的频带被标有星号和对应于共同纯化的蛋白质可以看出其他几个频带。 请点击此处查看该图的放大版本。
| N-末端融合 | |
| 前锋 | 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - （> 18gsn）-3' |
| 相反 | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTŧTTATCA - （> 18gsn）-3' |
| C-末端融合 | |
| 前锋 | 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - （> 18gsn）-3' |
| 相反 | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT摹- （> 18gsn）-3' |
表1：正向和反向放大的ORF或利息插入穿梭载体引物。的attB位点以粗体字母突出显示，GSN表示超过18的基因特异性核苷酸加入到引物。
| 步 | 温度 | 时间 | |
| 初始变性 | 94℃ | 2分钟 | |
| PCR扩增循环（35） | 变性 | 94℃ | 30秒 |
| 退火 | 55℃（取决于引物的Tm） | 30秒 | |
| 延伸 | 72℃ | 1分钟/ kb | |
| 保持 | 4℃ | 无限期 | |
表2：PCR条件利息的ORF的扩增。
| 向量 | 正向测序引物 | 反向测序引物 |
| 穿梭载体 | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' |
表3：正向和反向测序引物的穿梭载体。
| ID | 结构体 | 父母 | 促进者 | 北RES | 马姆RES | 春节章？ |
| pGLAP1 | N-末端EGFP-TEV-S肽 | 的pcDNA5 / FRT / TO | CMV | 安培 | HYG | 是 |
| pGLAP2 | N-末端旗TEV-S肽 | 的pcDNA5 / FRT / TO | CMV | 安培 | HYG | 是 |
| pGLAP3 | N-末端EGFP-TEV-S肽; C-V5长期 | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | 安培 | HYG | 没有 |
| pGLAP4 | N-末端旗TEV-S肽; ; C-V5长期 | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | HYG | 没有 | |
| pGLAP5 | C-相S肽PreProt X2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | 安培 | HYG | 没有 |
表4：具有可变促销员，表位标记，对于N霉素诱导表达能力或C端蛋白标记可用LAP / TAP向量列表。载体是市售的。北RES表明细菌耐药标记，MAM RES表明哺乳动物细胞抗性标记，春节章？指示表达式是否为春节/ DOX调控。
| 向量 | 正向测序引物 | 反向测序引物 |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3' |
表5：正向和反向测序引物为载体pGLAP。
Discussion
概述的协议描述了感兴趣的基因的克隆到LAP标记向量，生成诱导LAP标记的稳定细胞株，以及LAP标记蛋白质复合物的蛋白质组分析的纯化。对于其他LAP / TAP标记的方法，该协议已被简化为与高通量方法的细胞通路中映射蛋白定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用兼容。这种方法已被广泛应用到为细胞周期进程，有丝分裂纺锤体组装，纺锤体极稳态，和ciliogenesis临界仅举几蛋白质的功能特性，并且辅助的这些蛋白质的误调节如何能导致人类疾病15的理解， 16,19,20。例如，我们的小组最近利用这个系统来定义纺锤体组装15,21的中STARD9丝分裂驱动蛋白的功能和调节（候选癌症的目标），定义在Tctex1d2动力蛋白轻链之间的新型分子联系 和短肋多指畸形综合征（SRPS）19，并确定了新的分子联系，以了解MID2泛素连接酶突变如何导致X-连锁智力残疾16。其他实验室还成功地应用这个方法，其中包括一个确定Tctn1，小鼠Hedgehog信号的调节，是一个ciliopathy相关蛋白复合物，的一部分以依赖组织方式22,23稳压睫状膜组成和ciliogenesis。因此，此协议可以广泛地应用到任何细胞途径的解剖。
在本协议中的一个关键步骤是那些潮霉素抗性LAP-标记的稳定细胞系的选择。特别应注意，以确保在控制板上的所有细胞是在实验板上放大选择灶之前死亡。潮霉素也可以ADDE的LAP标记的稳定细胞株常规细胞培养期间d，来进一步确保所有细胞维持感兴趣的LAP-标记基因在FRT位点。我们告诫，并非所有的LAP标记的蛋白质将是正常，并且它具有在位置测定可用于测试蛋白质的功能是重要的。用于测试蛋白质的功能测定法的实例包括siRNA的诱导表型和体外活性测定法救援。为了解决与另外一个大LAP-标签的任何潜在的问题，我们先前已经产生与该系统包含小的标记，如FLAG，这是不太可能抑制所感兴趣的蛋白的功能和定位兼容的TAP标记的载体4。此外，用于产生C-末端LAP标记蛋白或C末端的TAP标记的蛋白质与本系统，可以在的情况下使用，其中一个LAP / TAP标记不在在N耐受兼容存在LAP标记矢量蛋白质的-terminus。此外，日纯化缓冲器（LAPX N）的电子盐和洗涤剂浓度可以被修饰以提高或如果观察到无或过多的相互作用降低纯化严格性。类似地，串联亲和纯化过程比单一纯化步骤和弱相互作用物更严格的可能丢失，从而可以在很少或没有相互作用物被识别用于一个单一的纯化方案。
要注意的是其他的GFP的表位标记的方法存在允许大规模的GFP蛋白标记的蛋白质的定位和纯化研究24,25是重要的。这些包括上述BAC TransgenOmics方法，利用细菌人工染色体从其天然环境表达感兴趣GFP标记基因包含所有调节元件，该模拟内源基因表达24。最近，CAS9 /单引导RNA（因组）核糖核蛋白复合物（的RNP）已经被用于结束ogenously标记的有分流-GFP系统，使从它们的内源基因位点25的GFP标记基因的表达感兴趣的基因。虽然这两种方法使标记的蛋白质的内源性的条件下，表达相比，这里描述的LAP标记协议，它们不允许针对感兴趣的标记基因的诱导和可调表达。此外，他们还没有被应用到串联表位标记的TAP。同样重要的是要注意，其他标签系统也可以被修改以成为与在此描述用于产生诱导的表位标记的稳定细胞株的系统兼容。例如，接近度依赖生物素标识（BioID）已经获得相当多的关注，因为它能够相互作用蛋白26之间限定的空间和时间关系的能力。这种技术利用蛋白质融合到大肠杆菌生物素连接酶生物素化酶BirA的混杂菌株，其中生物素化S中的酶的〜10nm的范围内的任何蛋白质。生物素化的蛋白，然后亲和使用生物素亲和捕获纯化和通过质谱法的组合物进行分析。生物素化酶BirA将生物素化的任何蛋白质在接近，甚至短暂，这使得它特别适合于复杂的27内检测弱相互作用伙伴。此外，纯化方案并不需要内源性蛋白质 - 蛋白质相互作用保持不变，并可以在变性条件下进行，从而降低假阳性率。在我们目前的协议，通过生物素化酶BirA标记矢量的pGLAP1向量的置换可以从确定基于亲和力基于接近检测它们的蛋白质 - 蛋白质相互作用变换这个系统。因为是许多酶 - 底物的相互作用之间并用于映射时空蛋白质INTE的情况下这样的系统将是，用于检测瞬时蛋白质相互作用是非常有利的作为中心体和纤毛26,28已进行了限定的结构内ractions。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
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