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Biology

Stabile Zelllinien zur Untersuchung von Proteinfunktionen, Spatiotemporal Lokalisierung und Protein Interaction Networks induzierbare LAP-getaggt

Published: December 24, 2016 doi: 10.3791/54870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

Protocol

HINWEIS: Ein Überblick über die Erzeugung von induzierbaren LAP-markierten stabilen Zelllinien für jedes interessierende Protein ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Übersicht von LAP-tagged Protein Expression, Reinigung und Vorbereitung für die Massen Proteom - Analysen ist in Abbildung 3 dargestellt.

1. Klonierung des offenen Leserahmens (ORF) des Gens in der LAP-Tag Vector

  1. Klonierung des ORF des Gens von Interesse in den Shuttle-Vektor.
    1. Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) entweder N-terminale Fusion oder C-terminale Fusion des ORF von Interesse mit den entsprechenden attB1 und attB2 Stellen innerhalb den Primern zu amplifizieren. Siehe Tabelle 1 für die Primersequenzen und Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen.
    2. Gel reinigt die PCR-Produkte, indem sie auf einem 1% Agarose-Gel-Lösung. Excise das verstärkte Band, die die richtige Größe aus dem Gel ist und extrahieren sie aus dem Gelstück eine DNA-g unter Verwendung vonel-Extraktions-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. Inkubieren des gereinigten attB enthält PCR - Produkte mit einem attP enthaltenden Shuttle - Vektor und die Rekombinase , die die PCR - Produkte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu rekombinieren in den Vektor erlaubt (siehe M aterialien Tabelle).
      HINWEIS: Leere Shuttle - Vektoren und LAP-Tagging - Vektoren , welche die ccd - B - Gen enthalten und in ccd B resistenten Bakterienzellen vermehrt werden (siehe Materialien Tabelle). Jedoch wird das ccdB Gen rekombiniert, wenn sich ein ORF in diese Vektoren eingeführt wird, damit Standard DH5a E. coli - Zellen verwenden , wenn Vektoren mit geklonten ORFs ausbreitet.
    4. Trans DH5 E. coli - Zellen mit 1 & mgr; l des Reaktionsprodukts und die Platte , die die transformierten Zellen auf eine Luria - Brühe (LB) Agar - Platte mit 50 mg / ml Kanamycin 13.
    5. Wählen Sie die Kanamycin-resistente Kolonien.
    6. Wachsen die ausgewählten Kolonien in LB mirdia mit 50 mg / ml Kanamycin, machen Sie eine Mini-Prep - DNA und Gen - Integration bestätigen durch DNA - Sequenzierung der Sequenzierungsprimer in Tabelle 3 aufgeführt werden.
  2. Die Übertragung des Gens von Interesse aus dem Shuttle-Vektor in das LAP-Tag Vector.
    1. Inkubieren Sie die Shuttle-Vektor, der die Sequenz überprüft Gen von Interesse ORF mit dem LAP-Tag-Vektor (pGLAP1 für N-terminale Fusion) und die Rekombinase, die die Übertragung des Gens von Interesse aus dem Shuttle-Vektor in das LAP-Tag Vektor vermittelt als enthält pro Anweisungen des Herstellers (siehe Materialien).
      HINWEIS: Eine Reihe von LAP / TAP - Vektoren , die basierend auf dem gewünschten Promotor verwendet werden können, Epitop-tag und N oder C-terminalen Markierungs können in Tabelle 4 gefunden werden.
    2. Transformation DH5 E. coli Zellen mit 1 & mgr; l des Reaktionsprodukts und die Platte , die die transformierten Zellen auf einer LB - Agarplatte mit 100 mg / ml Ampicillin 13.
    3. Wählen Sie das Ampicillin-resistente colonehmen.
    4. Wachsen die ausgewählten Kolonien in LB - Medium mit 100 mg / ml Ampicillin, ein DNA - Mini-Prep machen, und bestätigen Gen Integration durch DNA - Sequenzierung der Sequenzierung unter Verwendung von Primern , die in Tabelle 5.

2. Erzeugung eines induzierbaren stabilen Zelllinie, die das LAP-getaggt bekundet Gen von Interesse

  1. Wählen Sie die Zelllinie am besten geeignet für das Projekt von Interesse. Alternativ können Sie eine Wirtszelllinie aus den bestehenden Zelllinie erstellen, die konstitutiv das TetR exprimiert und enthält eine FRT-Stelle, die das LAP-markierte Gen von Interesse ermöglicht, stabil in das Genom integriert werden (siehe Materialien).
    Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine HEK293 - Zelllinie, die den TetR und einer FRT - Stelle enthält, die in -tet DMEM / F12 - Medium gezüchtet [hergestellt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , die von Tetracycline (-tet) frei ist] 4 .
  2. Bestimmen Sie die Mindestkonzentration von Hygromycin erforderlich, um die Wirtszelllinie innerhalb 1 bis 2 wee zu tötenks nach Wirkstoffzugabe. Die Konzentration kann zwischen Wirtszelllinien, variieren mit den meisten im Bereich zwischen 100 & mgr; g / ml und 800 & mgr; g / ml.
    HINWEIS: HEK293 gezüchteten Zellen in -tet DMEM / F12 - Medium mit 100 ug / ml Hygromycin bei 37 ° C und 5% CO 2 werden in 1-2 Wochen absterben.
  3. Co-Transfizieren des Vektors, die der Flippase Rekombinase exprimiert (vermittelt die Integration des LAP-tagged Gen von Interesse in die FRT-Stelle innerhalb des Genoms der Zelle) mit dem LAP-markierten Vektor in HEK293 Zellen, die ein Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers . Verwenden Sie ein Verhältnis von 4: 1 von Rekombinase Vektor zu Vektor LAP 14.
    HINWEIS: Das optimale Verhältnis auf der Wirtszelllinie und Verfahren der Transfektion abhängig ist, und kann eine Titration erfordern. Ein Verhältnis von 4: 1 funktioniert gut für die meisten Zelllinien. Fügen Sie ein Mock-transfizierten Platte als Negativkontrolle.
  4. Eines Tages nach der Transfektion, ersetzen Sie die -tet DMEM / F12-Medium mit frischem Medium.
  5. Zwei Tage nach der transfectiauf, geteilte Zellen auf 25% Konfluenz. Lassen Zellen ~ 5 Stunden zu befestigen, dann Hygromycin enthaltenden -tet DMEM / F12-Medium bei der in Schritt 2.2 vorbestimmten Konzentration hinzuzufügen. Für HEK293 verwenden Zellen 100 ug / ml Hygromycin.
    HINWEIS: Die FRT HEK293-Zellinie enthält, enthält auch das TetR, die mit Blasticidin Widerstand verbunden ist, damit 5 & mgr; g / ml Blasticidin wird während der stabilen Zelllinie Auswahlprozess verwendet zur Auswahl für den TetR und leaky Expression zu minimieren.
  6. Ersetzen Hygromycin-haltigen -tet DMEM / F12-Medium wie nötig, bis deutliche Zellfoci erscheinen, die undurchsichtige Flecken gegen die transparente Platte ähneln.
  7. In 20 ul von Trypsin auf der jeweils Zellfoci und pipettieren auf und ab 2 mal mit einem 200 ul Pipettenspitze. Platz Zellen in einer 24-Well-Platte und erweitern Sie die Zellen durch kontinuierliches Wachstum in Hygromycin enthaltenden -tet DMEM / F12-Medium.
  8. Screen-Zellen für die induzierbare LAP-markierten Proteinexpression durch Fest Zelle oder Live-Zell-Fluoreszenzmikroskopie und / oderWestern - Blot für das GFP - Tag innerhalb des LAP-tag 15.

3. Reinigung von LAP-markierten Proteinkomplexe

HINWEIS: Die folgenden LAP-markierte Protein Reinigungsprotokoll Details Empfehlungen über die Bedingungen und für einen typischen LAP-markierten Proteinreinigung auf früheren Erfahrungen basiert, verwendet Bände. Vorsicht sollte jedoch ausgeübt werden, um sicherzustellen, dass empirische Optimierung für jede Proteinkomplex und Proteinexpressionsniveau von Interesse, die besten Ergebnisse liefern durchgeführt.

  1. Zellwachstum und die Zellernte.
    1. Erweitern des validierten LAP-markierten Zelllinie für die TAP Isolierung von Proteinkomplexen durch kontinuierlich Passagierung alle HEK293 - Zellen in größeren Platten und / oder Rollflaschen in -tet DMEM / F12 - Medium bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. Für Tet / Dox induzierbare Zelllinien induzieren für 10-15 h bei einer Konzentration von 0,2 ug / ml Tet / Dox, wenn die Zellen erreichen ~ 70% Konfluenz vor Harg Zellen.
      HINWEIS: Die Konzentration und die Induktionszeit sollte für jedes Protein eine Titration von 0,1-1 ug / ml Tet / Dox für 10-15 h bestimmt werden empfohlen.
    3. Ernten Sie die Zellen durch Rühren oder Trypsinierung und Pellet-Zellen bei 875 × g für 5 bis 10 min.
  2. Kupplung Anti-GFP Antikörper an Protein A Beads
    1. Verwenden Sie 40 ug Antikörper für die Immunpräzipitation von einem aus einer 0,5 ml Zellpellet hergestellt Lysat, Hämatokrit (PCV).
      HINWEIS: Die Menge des Antikörpers auf die Abundanz abhängig von der LAP-tagged Protein unter anderem benötigt wird, und wird die Optimierung erfordern. Eine Titration von 10 bis 40 & mgr; g empfohlen.
    2. Äquilibrieren 160 ul gepacktes Volumen (PV) Protein A-Kügelchen in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in einem 1,5 ml Röhrchen. Wasche 3mal mit je 1 ml PBST.
      HINWEIS: Alle Waschungen hierin durchgeführt werden, indem die Kügelchen bei 5,000 xg Zentrifugation für 10 sec.
    3. Resuspendieren Perlen in 500 ul PBST und fügen Sie 80 ug Affinität-purified Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper in jedes Röhrchen 160 & mgr; l Kügelchen. Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT).
    4. Waschen Sie Perlen 2 mal mit 1 ml PBST. Dann waschen beads 2 mal mit 1 ml 0,2 M Natriumborat, pH 9 (20 ml 0,2 M Natriumborat + 15 ml 0,2 M Borsäure). Nach dem letzten Waschen, fügen 900 ul der 0,2 M Natriumborat, pH 9, um das Endvolumen auf 1 ml zu bringen.
    5. Füge 100 & mgr; l von 220 mM Dimethylpimelimidat (DMP) in einer Endkonzentration von 20 mM. Drehen Sie die Rohre vorsichtig bei RT für 30 min. Für 220 mM DMP resuspendieren Inhalt einer 50 mg-Flasche in 877 ul 0,2 M Natriumborat, pH 9 und sofort auf die Beadsuspension hinzuzufügen.
    6. Nach Inkubation mit DMP, wasche beads 1 Mal mit 1 ml 0,2 M Ethanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8,5, die restlichen Vernetzer zu inaktivieren. Resuspendieren Kügelchen in 1 ml des gleichen Puffers und drehen 1 h bei RT. Pellet Perlen und resuspendieren Perlen in 500 ul 0,2 M Ethanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5. Perlen sind stabil für several Monate bei 4 ° C.
  3. Herstellung der Puffer für Zellyse und Komplexe Reinigung
    1. Bereiten Sie LAPX Puffer (wobei X die gewünschte Salzkonzentration [mM KCl] des LAP-Puffer, 300 mM für Zell-Lyse, 200 mM für die meisten Perle wäscht und 100 mM zum Waschen Perlen vor Proteine ​​eluting) durch einen pH-Wert 7,4 Lösung machen enthaltend 50 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), X mM KCl, 1 mM Ethylenglykol - tetraessigsäure (EGTA), 1 mM MgCl 2 und 10% Glycerin.
      HINWEIS: Die Komponenten dieses Puffers werden verwendet, um die Umgebung in lebenden Zellen zu approximieren. HEPES als Puffer im pH-Wut von 7,2-8,2 verwendet. KCl ist ein Salz verwendet, um die Ionenstärke des Puffers zu halten. EGTA ist ein chelatbildendes Mittel, das Calciumionen bindet die Mengen an Calcium gegenüber Magnesium zu reduzieren. Glycerol und MgCl 2 verwendet , um die Stabilität von Proteinen zu verbessern.
    2. Bereiten Sie LAPX N Puffer durch Zugabe von 0,05% Nonylphenol phenoxypolyethoxylethanol zum LAPX Puffer.
      HINWEIS: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol ist ein mildes Detergens, das Proteine ​​solubilisiert, aber bewahrt Protein-Protein-Wechselwirkungen, wodurch eine höhere Konzentration während des Extraktionsverfahrens verwendet wird, und es wird dann während des Bindungs- und Waschschritte verringert.
  4. Herstellung von Zelllysaten
    1. Resuspendieren 500 ul PCV in 2,5 ml LAP300 mit 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und Protease-Inhibitoren. In 90 ul 10% Nonylphenol phenoxypolyethoxylethanol (0,3% final) und mischen durch Umdrehen.
    2. Auf Eis für 10 min. Zentrifuge bei 21.000 g für 10 min. Sammeln Sie diese niedriger Geschwindigkeit Überstand (LSS). Nehmen Sie eine 10 ul Probe des LSS für Gel-Analyse.
    3. LSS übertragen auf eine TLA100.3 Rohr und Spin bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C. Sammeln Sie diese Hochgeschwindigkeitsüberstand (HSS), in einem Rohr und auf Eis. Nehmen Sie eine 10 ul Probe des HSS für Gel-Analyse.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die oberste Lipidschicht eine Einnahmed die unterste Zelltrümmer Schicht. Die Lipidschicht sollte vor dem Sammeln der HSS durch Vakuum abgesaugt werden.
  5. Erste Affinity-Capture: Die Bindung an Anti-GFP-Beads
    1. Pre-eluieren Antikörper gekoppelten Kügelchen (Verwendung 160 & mgr; l Kügelchen pro 0,5 ml Zellpellet (PCV)) , indem sie 3 - mal mit 1 ml Elutionspuffer [3,5 M MgCl 2 mit 20 mM Tris, pH 7,4] Waschen von ungekoppelten loszuwerden Antikörper und reduzieren Hintergrund. Haben schnell. Sie nicht für eine lange Zeit Perlen in hohen Salz verlassen.
    2. Waschen Perlen 3 - mal mit 1 ml LAP200 N. Mischungs HSS mit Antikörper-Perlen für 1 h Extrakts bei 4 ° C. Zentrifuge bei 21.000 g für 10 min. Nehmen Sie eine 10 ul - Probe des Überstandes ( das heißt die Strömung durch (FT)) für Gelanalyse.
    3. Waschen Perlen 3mal mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen beads 2 mal (jeweils 5 min) mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen Sie schnell 2 times mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und keine Protease - Inhibitoren vor der Tabakätzvirus (TEV) Protease - Zugabe.
  6. TEV-Spaltung
    1. Verdünne 10 & mgr; g TEV Protease in 1 ml N LAP200 und drehen Röhrchen bei 4 ° C über Nacht.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann für jede LAP-tagged Protein optimiert werden, in wenigen Stunden abgeschlossen werden, indem die Konzentration der TEV-Protease Einstellung, die die Erhaltung der LAP-tagged Protein-Komplexe unterstützen kann.
    2. Pellet Perlen und Überstand in ein frisches Röhrchen. Spülen Sie Perlen zweimal mit 160 & mgr; l LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren (triple - Konzentration) restliche Protein zu entfernen. Nehmen Sie eine 10 ul-Probe des Überstandes für Gel-Analyse.
  7. Zweite Affinity Aufnahme: Die Bindung an S-Protein-Agarose
    1. Waschen 1 Röhrchen von 80 & mgr; l S - Protein - Agarose - Aufschlämmung (40 & mgr; l gepackte Harz) 3 - mal mit 1 ml N LAP200.
      HINWEIS: S Protein Bindung an den S-tag eine aktive RNase und einer alternativen zweiten Epitopmarkierung rekonstituieren sollte für RNA enthaltende Proteinkomplexe angesehen werden.
    2. In TEV eluiert Überstand S-Protein-Agarose-Perlen und Rock für 3 Stunden bei 4 ° C. Pellet Perlen und waschen 3 Mal mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen Sie Perlen 2 mal mit 1 ml LAP100.
  8. Proteinelution
    1. Eluieren Proteinen aus S-Protein-Agarose durch 50 ul 4x Laemmli-Probenpuffer und Wärme Zugabe für 10 min bei 97 ° C.
      HINWEIS: Die Proteine können auch aus den Kügelchen mit Elutionspuffer (3,5 M MgCl 2 mit 20 mM Tris, pH 7,4) eluiert werden.

4. Identifizieren Proteine ​​durch Massenspektrometrie-Analyse Interacting

  1. Testen der Qualität der Reinigung durch die gesammelten Proben durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, Silberfärbung des Gels (siehe 16 gearbeitet, siehe Figur 4.
  2. Zur Identifizierung von stöchiometrischen und unterstöchiometrischen Co-Reinigung von Spezies, um die endgültige Elution Probe und trennen es durch SDS-PAGE. Stain das Gel mit einem Massenspektrometrie kompatibel Protein Fleck. Auszuschneiden die prominentesten Bands und den Raum zwischen ihnen von dem Gel und verarbeiten sie für die Analyse durch Massenspektrometrie getrennt 16.
    HINWEIS: Es gibt zahlreiche Ansätze für die abschließende Reinigung Eluate abgetrennt und für die Massenspektrometrie 5 vorbereitet. Zum Beispiel LAP-gereinigten Komplexe können durch Verwendung von Hochsalz (3,5 M MgCl 2) und der gesamten Proteinpopulation aus S-Protein - Kügelchen eluiert werden en masse durch Massenspektrometrie 17 analysiert werden kann. Alternativ können endgültige Eluate für 1 mm durch SDS-PAGE und einer einzigen 1 mm Band kann e getrennt werden seinxcised und analysiert. Dies löscht die komplexe Mischung aus jeder Perlen oder Partikeln, die mit der Analyse stören.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flp-In T-REx Core Kit Invitrogen K6500-01 Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5x Nunc, Inc.  73520-734 Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5x Nunc, Inc.  73520-420 Roller bottle for growing cells
Cell stackers Corning CellSTACK 3271 Cell stacker for growing cells
500 ml conical centrifuge tubes Corning  431123 Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody Invitrogen A11122 Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads Biorad 156-0006 Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP) ThermoFisher Scientific 21667 Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes Beckman 349622 Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease Invitrogen 12575-015 Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease GE Healthcare 27-0843-01 Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose Novagen 69704 Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit Qiagen 28704/28706 For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II Invitrogen 11789020 Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II Invitrogen 11791020 Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli Invitrogen A10460 Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6 Promega E2691 Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline Invitrogen Q100-19 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Doxycycline Clontech 631311 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Hygromycin B Invitrogen 10687010 Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin Corning 61-176-RG Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin Fisher BP1760-5 Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels Biorad 4561094 Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit Biorad 1610449 Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process 
Coomassie Blue stain Invitrogen LC6060 Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221 Invitrogen 12536017 Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44 Invitrogen V600520 Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10966018 Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4x Laemmli sample buffer Biorad 1610747 Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media Fisher BP9723-2 Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit Promega A1222 Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media Hyclone SH30023.01 For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet Altanta Biologicals S10350 Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin Hyclone SH30042.01 For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets Roche 11836170001 Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol  Roche 11332473001 Used for making protocol buffers
PBS Corning 21-040-CM Used for making protocol buffers
Tween-20 Fisher BP337-500 Used for making protocol buffers
Sodium Borate Fisher S249-500 Used for making protocol buffers
Boric Acid Fisher A78-500 Used for making protocol buffers
Ethanolamine Calbiochem 34115 Used for making protocol buffers
NaCl Fisher P217-3 Used for making protocol buffers
KCl Fisher BP358-10 Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172-25 Used for making protocol buffers
MgCl2 Fisher M33-500 Used for making protocol buffers
Tris base Fisher BP152-5 Used for making protocol buffers

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References

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  3. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
  4. Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
  5. LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
  6. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
  7. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
  8. ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
  9. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
  10. Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
  11. Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
  12. Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
  14. Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
  15. Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
  16. Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
  17. Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
  18. Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
  19. Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
  20. Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
  21. Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
  22. Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
  23. Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
  24. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
  25. Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
  26. Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
  27. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
  28. Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
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Bradley, M., Ramirez, I., Cheung,… More

Bradley, M., Ramirez, I., Cheung, K., Gholkar, A. A., Torres, J. Z. Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (118), e54870, doi:10.3791/54870 (2016).

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