Protocol
OPMERKING: Een overzicht van de vorming van induceerbare-LAP hebben stabiele cellijnen voor een eiwit van interesse is in figuur 1 en het overzicht van LAP-gemerkt eiwit expressie, zuivering en bereiding voor de massa proteomische analyses wordt weergegeven in figuur 3.
1. Klonen van het open leeskader (ORF) van het gen van belang in het LAP-tag Vector
- Het kloneren van het ORF van het gen van belang in de shuttlevector.
- Met polymerasekettingreactie (PCR) om het ORF van belang te amplificeren met de juiste attB1 en attB2 plaatsen in de primers voor zowel N-terminale fusie of C-terminale fusie. Zie Tabel 1 voor de primersequenties en tabel 2 voor PCR omstandigheden.
- Gel zuiveren de PCR producten door oplossing ervan op een 1% agarose gel. Accijnzen de versterkte band, dat is de juiste maat uit de gel en pak het uit de gel slice met behulp van een DNA-gel extractie kit volgens instructies van de fabrikant.
- Incubeer de gezuiverde attB PCR producten bevatten een attP bevattende shuttle vector en het recombinase waarmee de PCR producten om te vermengen met de vector volgens de instructies van de fabrikant (zie M ateriaal tabel).
LET OP: Lege shuttle vectoren en LAP-tagging vectoren bevatten de CCD B-gen en moeten worden gepropageerd in CCD B-resistente bacteriële cellen (zie Materials tabel). Maar de ccdB gen gerecombineerd wanneer een ORF in deze vectoren wordt geplaatst, dus gebruik maken van standaard DH5a E. coli-cellen bij het propageren van vectoren met gekloonde ORF. - Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een Luria-bouillon (LB) agarplaat met 50 mg / ml kanamycine 13.
- Selecteer de kanamycine resistente kolonies.
- Groeien de geselecteerde kolonies in LB media met 50 mg / ml kanamycine, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in tabel 3 vermeld.
- Het overbrengen van het gen van belang uit de Shuttle Vector in het LAP-tag Vector.
- Incubeer de shuttle vector die de sequentie geverifieerd gen van belang ORF met de LAP-tag vector (pGLAP1 voor N-terminale fusie) en de recombinase dat de overdracht van het gen van interesse van de shuttle vector in het LAP-tag vector volgens medieert instructies van de fabrikant (zie Materials).
OPMERKING: Een reeks LAP / TAP vectoren die kunnen worden gebruikt op basis van de gewenste promoter, epitoop-tag, en N of C-terminale tagging kan worden in tabel 4. - Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een LB agar plaat met 100 mg / ml Ampicilline 13.
- Selecteer de Ampicilline resistente coloven.
- Groeien de geselecteerde kolonies in LB-medium met 100 mg / ml Ampicilline, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in Tabel 5 opgesomd.
- Incubeer de shuttle vector die de sequentie geverifieerd gen van belang ORF met de LAP-tag vector (pGLAP1 voor N-terminale fusie) en de recombinase dat de overdracht van het gen van interesse van de shuttle vector in het LAP-tag vector volgens medieert instructies van de fabrikant (zie Materials).
2. Genereren van een induceerbare stabiele cellijn dat de LAP-tag gen van belang spreekt
- Selecteer de cellijn het best geschikt voor het project van belang zijn. Als alternatief, maak een gastheercel lijn van een bestaande cellijn die constitutief uitdrukt de TetR en bevat een FRT-plaats die het mogelijk maakt de LAP-tag gen van belang stabiel worden geïntegreerd in het genoom (zie Materials).
Opmerking: In dit protocol wordt een HEK293 cellijn dat TetR en een FRT-plaats, dat gekweekt in -Tet DMEM / F12 media [gemaakt met 10% foetaal runderserum (FBS) dat zonder tetracycline (-Tet)] 4 bevat . - Bepaal de minimumconcentratie van hygromycine vereist om de gastheercellijn binnen 1 tot 2 doden weeks na drugsverslaving. De concentratie kan variëren tussen gastheer cellijnen, met de meeste variërend tussen 100 ug / ml en 800 ug / ml.
OPMERKING: HEK293 cellen die in -Tet DMEM / F12 medium met 100 ug / ml hygromycine bij 37 ° C en 5% CO 2 zal sterven binnen 1-2 weken. - Co-transfecteren van de vector die uitdrukt de flippase recombinase (medieert de integratie van het LAP-gemerkte gen van belang in de FRT-plaats in het genoom van de cel) met het LAP tag vector in HEK293 cellen onder toepassing van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant . Met een verhouding van 4: 1 van recombinase vector LAP vector 14.
OPMERKING: De optimale verhouding is afhankelijk van de gastheercellijn en wijze van transfectie, en kan een titratie vereist. Een verhouding van 4: 1 werkt goed voor de meeste cellijnen. Onder meer een mock-getransfecteerde plaat als een negatieve controle. - Een dag na transfectie, vervang de -Tet DMEM / F12 media met verse media.
- Twee dagen na de transfectiop, split cellen tot 25% samenvloeiing. Laat cellen ~ 5 uur te bevestigen, voeg dan hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media bij een concentratie vooraf in stap 2.2. Voor HEK293 cellen gebruiken 100 ug / ml hygromycine.
OPMERKING: De FRT met HEK293 cellijn bevat ook de TetR die wordt geassocieerd met resistentie Blasticidine derhalve 5 ug / ml blasticidine wordt gebruikt in de stabiele cellijn selectieproces selecteren voor het TetR en lekkende expressie minimaliseren. - Vervang hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media als dat nodig is, totdat afzonderlijke cel foei erop dat ondoorzichtige vlekken tegen de transparante plaat lijken.
- Voeg 20 ul trypsine bovenop elke cel foci en pipet op en neer 2 maal met 200 pi pipet tip. Plaats cellen in een plaat met 24 putjes en de cellen door voortdurende groei van de hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media uit te breiden.
- Screen cellen voor induceerbare-LAP gelabeld eiwit expressie door vaste-cel of live-cell fluorescentie microscopie en / ofWestern blotting voor het GFP-tag in het LAP-tag 15.
3. Zuivering van LAP-tag eiwitcomplexen
LET OP: De volgende LAP-gelabelde eiwit zuivering protocol gegevens aanbevelingen over de voorwaarden en volumes gebruikt voor een typische LAP-gelabelde eiwit zuivering op basis van eerdere ervaringen. Echter, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de empirische optimalisatie uit voor een eiwit complex en eiwit expressie niveau van de rente om de beste resultaten te leveren wordt uitgevoerd.
- Celgroei en Cell Oogst.
- Vouw de gevalideerde-LAP hebben cellijn TAP isolatie van eiwitcomplexen door continu passage alle HEK293 cellen tot grotere borden en / of rolflessen in -Tet DMEM / F12-medium bij 37 ° C en 5% CO2.
- Voor Tet / Dox induceerbare cellijnen te induceren gedurende 10-15 uur bij een concentratie van 0,2 ug / ml Tet / Dox wanneer de cellen bereikt ~ 70% confluentie voordat harvesting cellen.
OPMERKING: als inductie tijd moet worden bepaald voor elk eiwit, wordt een titratie van 0,1-1 ug / ml Tet / Dox gedurende 10-15 uur aanbevolen. - Oogst cellen door agitatie of behandeling met trypsine en pellet cellen op 875 xg gedurende 5-10 min.
- Koppeling anti-GFP antilichaam aan Proteïne A kralen
- Met 40 ug antilichaam voor immunoprecipitatie van een lysaat bereid uit een 0,5 ml celpellet, gepakte celvolume (PCV).
OPMERKING: De hoeveelheid antilichaam die nodig is zal afhangen van de overvloed van het LAP-gelabeld eiwit, naast andere factoren, en optimalisatie vereisen. Een titratie van 10-40 ug aanbevolen. - Equilibreren 160 ui gepakte volume (PV) Proteïne A kralen in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in een 1,5 ml buis. Was 3 maal met 1 ml PBST.
LET OP: Alle wast hierin worden uitgevoerd door centrifugeren de kralen bij 5.000 g gedurende 10 seconden uitgevoerd. - Resuspendeer kralen in 500 pi PBST en voeg 80 ug affiniteit-purified konijn anti-GFP antilichaam aan elke buis van 160 pi kralen. Meng gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Wassen kralen 2 maal met 1 ml PBST. Vervolgens wast kralen 2 maal met 1 ml 0,2 M natriumboraat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumboraat + 15 ml 0,2 M boorzuur). Na de laatste wasbeurt, voeg 900 ul van 0,2 M natriumboraat, pH 9 het uiteindelijke volume op 1 ml te brengen.
- Voeg 100 ul van 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) tot een eindconcentratie van 20 mM. Draai de buizen voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min. 220 mM DMP, resuspendeer inhoud van een 50 mg fles in 877 gl 0,2 M natriumboraat, pH 9 en voeg onmiddellijk de parelsuspensie.
- Na incubatie met DMP, wassen kralen 1 keer met 1 ml 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5 om de resterende verknopingsmiddel te inactiveren. Resuspendeer kralen in 1 ml van dezelfde buffer en draai gedurende 1 uur bij KT. Pellet kralen en resuspendeer kralen in 500 gl 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5. Kralen zijn stabiel several maanden bij 4 ° C.
- Met 40 ug antilichaam voor immunoprecipitatie van een lysaat bereid uit een 0,5 ml celpellet, gepakte celvolume (PCV).
- Bereiding van Buffers voor cellysis en zuivering Complex
- Bereid LAPX buffers (waarbij X de gewenste zoutconcentratie [mM KCl] van het LAP buffer; 300 mM voor cellysis, 200 mM meeste kralen wast, en 100 mM voor het wassen bolletjes vóór elueren proteïnen) door middel van een pH 7,4 oplossing bevattende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), X mM KCl, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 1 mM MgCl2 en 10% glycerol.
OPMERKING: De componenten van deze buffer gebruikt om het milieu te benaderen in levende cellen. HEPES wordt gebruikt als een buffer in het pH woede van 7,2-8,2. KCl een zout gebruikt om de ionsterkte van de buffer te handhaven. EGTA is een chelaatvormer die calciumionen bindt aan de niveaus van calcium ten opzichte van magnesium verminderen. Glycerol en MgCl2 worden gebruikt om de stabiliteit van eiwitten te verbeteren. - Bereid LAPX N buffer door het toevoegen van 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol de LAPX buffer.
OPMERKING: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol is een mild reinigingsmiddel dat eiwitten oplosbaar, maar handhaaft eiwit-eiwit interacties, waardoor een hogere concentratie wordt gebruikt tijdens het extractieproces en wordt dan verlaagd tijdens de binding en wasstappen.
- Bereid LAPX buffers (waarbij X de gewenste zoutconcentratie [mM KCl] van het LAP buffer; 300 mM voor cellysis, 200 mM meeste kralen wast, en 100 mM voor het wassen bolletjes vóór elueren proteïnen) door middel van een pH 7,4 oplossing bevattende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), X mM KCl, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 1 mM MgCl2 en 10% glycerol.
- Bereiding van cellysaten
- Resuspendeer 500 pl PCV in 2,5 ml LAP300 met 0,5 mM dithiothreïtol (DTT) en proteaseremmers. Voeg 90 ul van 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% eind) en meng door omkeren.
- Plaats op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Verzamel deze lage snelheid supernatant (LSS). Neem een 10 ul monster van het LSS voor gel-analyse.
- Transfer LSS een TLA100.3 buis centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Verzamel deze hoge snelheid supernatant (HSS), in een buis en plaats op ijs. Neem een 10 ul monster van de HSS voor gel-analyse.
LET OP: Vermijd het nemen van de top de meeste lipidelaag eend onderaan de meeste mobiele puin lagen. De lipidelaag worden verwijderd door afzuigen in vacuo voorafgaand aan het verzamelen van de HSS.
- Eerste Affiniteit Capture: Binding aan anti-GFP Beads
- Pre-elueren antilichaam gekoppelde korrels (gebruik 160 ul van kralen per 0,5 ml celpellet (PCV)) door ze te wassen 3 maal met 1 ml elutiebuffer [3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4] kwijt ontkoppeld antilichamen en verminderen achtergrond. Doe snel. Niet kralen in hoog zoutgehalte te verlaten voor een lange tijd.
- Was beads 3 maal met 1 ml LAP200 N. Mengen HSS extraheer met antilichaam kralen voor 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Pipetteer 10 ul monster van de supernatant (dat wil zeggen de stroom door (FT)) voor gelanalyse.
- Was beads 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal (5 min elk) met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Was snel 2 times met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers geen voordat u de tabak etch virus (TEV) protease.
- TEV Splitsing
- Verdun 10 ug TEV protease in 1 ml N LAP200 en roteren buizen bij 4 ° C overnacht.
Opmerking: Deze stap kan worden geoptimaliseerd voor LAP-gelabeld proteïne enkele uren te vullen door het aanpassen van de concentratie van TEV protease, die het behoud van LAP-gemerkt eiwit complexen kunnen helpen. - Pellet kralen en overdracht supernatant naar een nieuwe buis. Spoel kralen tweemaal met 160 ul LAP200 N met 0,5 mM DTT en proteaseremmers (triple concentratie) om het resterende eiwit te verwijderen. Pipetteer 10 ul monster van de bovenstaande voor gelanalyse.
- Verdun 10 ug TEV protease in 1 ml N LAP200 en roteren buizen bij 4 ° C overnacht.
- Tweede Affiniteit Capture: Binding aan S Protein Agarose
- Was 1 tube 80 ul proteïne S agarose suspensie (40 pl gepakte hars) 3 maal met 1 ml LAP200 N.
LET OP: S protein binding aan de S-tag zal een actieve RNase reconstitueren en een alternatief tweede epitooplabel moet worden overwogen voor RNA-bevattende eiwitcomplexen. - TEV toevoegen geëlueerd supernatant S eiwit agarose korrels en Rock voor 3 uur bij 4 ° C. Pellet kralen en was 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal met 1 ml LAP100.
- Was 1 tube 80 ul proteïne S agarose suspensie (40 pl gepakte hars) 3 maal met 1 ml LAP200 N.
- eiwit Elutie
- Elueer eiwitten uit S proteïne-agarose door toevoeging van 50 ul van 4x Laemmli monsterbuffer en verwarm bij 97 ° C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Eiwitten kunnen ook worden geëlueerd van de bolletjes met elutiebuffer (3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4).
- Elueer eiwitten uit S proteïne-agarose door toevoeging van 50 ul van 4x Laemmli monsterbuffer en verwarm bij 97 ° C gedurende 10 minuten.
4. Identificeer interacterende eiwitten door massaspectrometrie Analyse
- Test de kwaliteit van de zuivering door het analyseren van de verzamelde monsters van natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE), zilverkleuring de gel (zie
- Stoechiometrische en substoichiometrische medezuiverende species identificeren, neemt de uiteindelijke elutie monster en gescheiden door SDS-PAGE. Vlekken op de gel met een massaspectrometrie compatibel eiwit vlek. Uitsnijden de duidelijke banden en de ruimte tussen de gel en verwerken voor analyse met massaspectrometrie afzonderlijk 16.
LET OP: Er zijn tal van manieren voor het scheiden van de uiteindelijke zuivering eluaten en hen voor te bereiden massaspectrometrie 5. Zo kan LAP-gezuiverde complexen worden geëlueerd van S-eiwit korrels met hoog zoutgehalte (3,5 M MgCl2) en het gehele eiwitpopulatie massaal kunnen worden geanalyseerd door massaspectrometrie 17. Alternatief kan definitieve eluaten worden gescheiden door 1 mm SDS-PAGE en een 1 mm band kan excised en geanalyseerd. Dit wist het complex mengsel van korrels of deeltjes die interfereren met de analyse.
Representative Results
Om de bruikbaarheid van dit systeem te benadrukken, het open leeskader (ORF) van de Tau microtubuli bindende eiwit werd gekloneerd in de shuttle vector door het amplificeren Tau ORF met primers die attB1 en attB2 sites (Tabel 1) en incuberen van de PCR-producten met de shuttlevector en een recombinase dat de insertie van de PCR- producten bemiddelt in de shuttle vector. De reactieproducten werden gebruikt voor DH5a bacteriën 13 en plasmide-DNA transformeren van kanamycine resistente kolonies werd gesequenced Tau worden aangebracht. Een sequentie gevalideerde shuttle-tau vector werd vervolgens gebruikt om de Tau ORF zetten in de pGLAP1 vector, die Tau in frame gefuseerd met het LAP (EGFP-TEV-S-eiwit) tag door incuberen van de shuttle-Tau vector met pGLAP1 vector en het recombinase dat de overdracht van de ORF van de shuttlevector te pGLAP1 medieert. De reactieproducten werden gebruikt voor het transformeren van DH5a bacteriën13 en plasmide DNA van ampicilline resistente kolonies werd de sequentie bepaald om te garanderen dat de LAP-Tau-fusie was in frame. Sequentie gevalideerde pGLAP1-LAP-tau werd daarna gecotransfecteerd met een vector die de flippase recombinatie enzym in HEK293 cellen die één flippase herkenning target (FRT) plaats in hun genoom, die de plaats van integratie voor LAP hebben genen die tot expressie 14. Deze cellijn was ook van TetR die aan tet-operators bindt stroomopwaarts van het LAP hebben genen en stiltes hun expressie in de afwezigheid van Tet / Dox. Stabiele integranten werden geselecteerd -Tet DMEM / F12 medium met 100 ug / ml hygromycine gedurende 5 dagen. Individuele Hygromycine resistente cel foci werden geoogst door toevoeging van 20 ul trypsine geplaatst en op en neer pipetteren 2 maal. De cellen werden in een plaat met 24 putjes geplaatst en uitgebreid door voortdurende groei in -Tet DMEM / F12 media.
Om te controleren of de Hygromycine resistente cels konden tot expressie LAP-Tau, werden HEK293 LAP-Tau cellen geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox gedurende 15 uur en proteïne extracten werden bereid uit niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen Dox. Deze extracten werden gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar een PVDF membraan en aan immunoblotting voor GFP en tubuline als ladingcontrole. Zoals blijkt uit figuur 4A, LAP-Tau (zichtbaar gemaakt met anti-GFP antilichamen) voldeden werd enkel in aanwezigheid van Dox. Te valideren dat LAP-tau goed was gelokaliseerd aan de mitotische microtubuli spindle tijdens mitose, zoals eerder aangetoond voor endogene Tau 18 werden HEK293 LAP-Tau cellen geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox 15 uur en de cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en co-gekleurd voor DNA (Hoechst 33342) en microtubuli (anti-tubuline antilichamen). Consequent werd LAP-Tau gelokaliseerd in het mitotische spindle tijdens metafase van mitose (figuur 4B). Om te controleren of LAP-Tau en de interactie eiwitten kunnen worden gezuiverd met dit system, HEK293 LAP-Tau-cellen werden gekweekt in rolflessen tot ~ 70% confluentie, geïnduceerd met 0,1 ug / ml Dox gedurende 15 uur, door roeren geoogst, gelyseerd met LAP300 buffer, en LAP-tau werd gezuiverd met behulp van het bovenstaande protocol. Eluaten van de LAP-Tau zuivering werden gescheiden door SDS-PAGE en de gel werd met zilver gekleurd. Figuur 4C toont het LAP-Tau zuivering, gemarkeerd met een asterisk is LAP-Tau en diverse andere bands indicatief Tau interactie eiwitten kunnen worden gezien.
Figuur 1: Overzicht van de generatie-LAP hebben induceerbare stabiele cellijnen voor een eiwit van interesse. Het open leeskader (ORF) van genen van belang worden geamplificeerd met attB1 en attB2 locaties aan weerszijden van de 5 'en 3' uiteinde sequenties, respectievelijk (primer sequenties worden in Tabel 1) en gekloneerd in de shuttle vector. De sequentie geverifieerd shuttlevectoren met het gen van belang worden vervolgens gebruikt om het gen van belang dragen in de pGLAP1 vector. De sequentie geverifieerd pGLAP1 vector met het gen van belang dan gecotransfecteerd met de vector die het flippase recombinase in de gewenste cellijn die één flippase herkenning target (FRT) plaats in hun genoom, die de plaats van integratie LAP bevat gemerkte genen. Deze cellijnen ook drukken de Tet-repressor (TetR), die bindt aan tet-operators (TetO 2) stroomopwaarts van het LAP hebben genen en stiltes hun expressie in de afwezigheid van Tet / Dox. De LAP-tag gen van belang wordt vervolgens gerecombineerd in de FRT-plaats en stabiele integranten worden geselecteerd met hygromycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Figuur 2: Overzicht van de aanvragen voor-LAP tag stabiele cellijnen. -LAP hebben induceerbare stabiele cellijnen worden geïnduceerd om de LAP-gemerkt eiwit plaats door Dox toevoeging expressie brengen en kunnen worden gesynchroniseerd in verschillende stadia van de celcyclus of kunnen worden gestimuleerd met chemicaliën of liganden elke gewenste signaalroute activeren. De subcellulaire lokalisatie van het LAP-gemerkt eiwit van belang kan worden geanalyseerd door levende cel of vaste cell imaging. LAP-gemerkte eiwitten kunnen ook tandem affiniteit gezuiverd en hun interagerende eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door middel van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS). Tenslotte kan Cytoscape worden gebruikt om een eiwit-eiwit interactie netwerk van het aas eiwit te genereren. Dox geeft Doxycycline, IP geeft immunoprecipitaat, EGFP geeft verbeterde groen fluorescerend eiwit, Tev geeft TEV protease-splitsingsplaats, en S geeft S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Overzicht van LAP tag Protein Expression, zuivering en voorbereiding voor massaspectrometrie. Het protocol heeft 9 stappen: 1) de groei en inductie van LAP-gemerkt eiwit-expressie, 2) verzamelen van cellen en lysis, 3) de bereiding van lysaten, 4) de binding van lysaten anti-GFP beads, 5) TEV protease klieving van het GFP-tag, 6) de binding van lysaten naar S-eiwit kralen, 7) het uitwassen van het aas eiwit en interactie eiwitten en 8-9) de voorbereiding van de monsters voor de massa-spectrometrie gebaseerde proteomics analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4: Controle van de LAP-Tau expressie. (A) Western blot (WB) analyse van eiwit monsters van niet-geïnduceerde en Dox geïnduceerde LAP-Tau HEK293 cellen afgetast met anti-GFP en anti-tubuline antilichamen tegen het LAP hebben tau-eiwit en de tubuline laadcontrole sporen, respectievelijk. Merk op dat LAP-Tau wordt alleen tot uitdrukking wanneer de cellen worden geïnduceerd met Dox. (B) mitotische cellen die LAP-Tau werden gefixeerd en gekleurd voor co-DNA (Hoechst 33342) en Tubuline (bad) met anti-tubuline antilichamen en de subcellulaire lokalisatie van LAP-tau werd geanalyseerd door fluorescentie microkopie. Merk op dat LAP-Tau lokaliseert aan de mitotische spindle en spindle polen tijdens de mitose. (C) zilver gekleurde gel van het LAP-Tau zuivering. MW geeft moleculair gewicht, CL geeft ontruimd lysaten en E indicates uiteindelijke eluaten. Monsters werden op een 4-20% SDS-PAGE en de gel werd met zilver gekleurd om de gezuiverde eiwitten te visualiseren. Merk op dat een band die overeenkomt met LAP-Tau wordt gemarkeerd met een asterisk en diverse andere bands die overeenkomt met co-zuiveren van eiwitten kunnen worden gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| N-terminale fusie | |
| vooruit | 5'GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 ' |
| Omgekeerde | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 ' |
| C-terminale fusie | |
| vooruit | 5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 ' |
| Omgekeerde | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 ' |
Tabel 1: Vooruit en achteruit primers voor het versterken ORF's of Interest voor het inbrengen in de Shuttle Vector. De attB locaties zijn vetgedrukt letters, GSN geeft aan dat meer dan 18 gen-specifieke nucleotiden worden toegevoegd aan de primer.
| Stap | Temperatuur | Tijd | |
| initiële denaturatie | 94 ° C | 2 min | |
| PCR amplificatiecycli (35) | denatureren | 94 ° C | 30 sec |
| temperen | 55 ° C (afhankelijk van de primer Tm) | 30 sec | |
| Uitbreiden | 72 ° C | 1 min / kb | |
| Greep | 4 ° C | onbepaalde tijd | |
Tabel 2: PCR Voorwaarden voor versterking van de ORF's of Interest.
| Vector | Forward Sequencing Primer | Reverse Sequencing Primer |
| shuttle Vector | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
Tabel 3: Forward en Reverse Sequencing Primers voor de Shuttle Vector.
| ID | Structuur | ouderlijk | promotor | Bac Res | Mam Res | Tet reg? |
| pGLAP1 | N-term EGFP-TEV-S peptide | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | amp | Hyg | Ja |
| pGLAP2 | N-term vlag-TEV-S peptide | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | amp | Hyg | Ja |
| pGLAP3 | N-term EGFP-TEV-S peptide; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | Hyg | Nee |
| pGLAP4 | N-term vlag-TEV-S peptide; ; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Hyg | Nee | |
| pGLAP5 | C-term S peptide-PreProt x2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | Hyg | Nee |
Tabel 4: Lijst van beschikbare LAP / TAP vectoren met Variable Promotors, Epitoop-labels en Dox Induceerbare Expression Mogelijkheden voor N of C-terminale Protein Tagging. Vectoren zijn commercieel verkrijgbaar. Bac Res geeft aan bacteriële resistentie marker, Mam Res geeft zoogdiercellijnen weerstand marker, Tet reg? geeft aan of de expressie is Tet / Dox regelbaar.
| Vector | Forward Sequencing Primer | Reverse Sequencing Primer |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
Tabel 5: Forward en Reverse Sequencing Primers voor pGLAP vectoren.
Discussion
De geschetste protocol beschrijft de klonering van genen van belang in het LAP-tagging vector, het genereren van induceerbare-LAP hebben stabiele cellijnen en de zuivering van LAP-eiwitcomplexen geïdentificeerd voor proteomische analyse. Met betrekking tot andere LAP / TAP-tagging benaderingen, is dit protocol gestroomlijnd geschikt is voor high-throughput benaderingen eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties in kaart binnen een cellulaire rol zijn. Deze aanpak wordt algemeen toegepast op de functionele karakterisatie van eiwitten essentieel voor voortgang van de celcyclus, mitotische spoel montage spindle pole homeostase en ciliogenese te noemen en heeft begrijpen hoe misregulation van deze eiwitten kan leiden tot menselijke ziekten 15 geholpen, 16,19,20. Bijvoorbeeld, de groep onlangs gebruikt dit systeem om de functie en regulatie van de STARD9 mitotische kinesine (een kandidaat kanker doel) in de assemblage van de spoel 15,21 definiëren, om een te definiërennieuwe moleculaire verbinding tussen de Tctex1d2 dynein lichte keten en korte rib polydactyly syndromen (SRPS) 19, en een nieuwe moleculaire verbinding te definiëren om te begrijpen hoe mutatie van het Mid2 ubiquitine ligase kan leiden tot X-gebonden verstandelijke handicap 16. Andere laboratoria hebben ook met succes toegepast deze methode, waaronder een die vastgesteld dat Tctn1, een regulator van muis Hedgehog signalering, maakte deel uit van een ciliopathie geassocieerd eiwitcomplex dat gereglementeerde ciliaire membraansamenstelling en ciliogenese in een weefsel-afhankelijke manier 22,23. Daarom kan dit protocol breed worden toegepast op de dissectie van elke cellulaire rol.
Een cruciale stap in dit protocol is de selectie van LAP-tag stabiele cellijnen die resistent tegen hygromycine. Speciale aandacht moet worden genomen om ervoor te zorgen dat alle cellen in de controle plaat dood voordat het selecteren van brandpunten in de experimentele plaat voor amplificatie zijn. Hygromycine kan ook worden Added tijdens routinematige celkweek of-LAP tag stabiele cellijnen om verder te zorgen dat alle cellen handhaven van de LAP-tag gen van belang op de FRT-plaats. Wij waarschuwen dat niet alle LAP-gemerkte eiwitten functioneel zal zijn en dat het belangrijk is om assays plaats die kan worden gebruikt om eiwitfunctie te testen. Voorbeelden van assays gebruikt om eiwit functie te testen omvatten de redding van siRNA-geïnduceerde fenotypes en in vitro activiteit assays. Om eventuele problemen de toevoeging van een grote LAP-tag te pakken, hebben we eerder gegenereerde TAP-tag vectoren compatibel met het systeem dat kleinere labels, zoals FLAG, die minder waarschijnlijk een functie en lokalisatie van het eiwit van interesse te remmen bevatten 4. Bovendien-LAP tagging vectoren aanwezig voor het genereren van C-eindstandige-LAP-gemerkte eiwitten of C-eindstandige TAP-gemerkte eiwitten die compatibel zijn met dit systeem, dat kan worden gebruikt wanneer een LAP / TAP tag niet ten N worden geduld terminus van een eiwit. Bovendien the zout en afwasmiddel concentraties van de zuivering buffers (LAPX N) kan worden gewijzigd te verhogen of de zuivering striktheid te verlagen als er geen of te veel interacties worden waargenomen. Ook de tandem affiniteitszuivering procedure is strenger dan één zuiveringswerkwijzen en zwakke interactors kunnen verloren gaan, waardoor een zuiveringsschema kan worden gebruikt als er weinig of geen interactoren geïdentificeerd.
Het is belangrijk op te merken dat andere GFP epitoop tagging benaderingen bestaan die op grote schaal GFP-eiwit laten labelen voor eiwit lokalisatie en zuivering studies 24,25. Deze omvatten de BAC TransgenOmics aanpak die bacteriële kunstmatige chromosomen gebruikt om GFP-tag genen van interesse te tonen uit hun eigen omgeving dat alle regulerende elementen, die nabootst endogene genexpressie 24 bevat. Recenter zijn CAS9 / single-geleide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïne complexen (RNP's) gebruikt om eindeogenously taggen genen van belang met een split-GFP-systeem dat de expressie van GFP-gelabeld genen maakt het mogelijk uit hun endogene genomische loci 25. Hoewel beide benaderingen de expressie van endogene gemerkte eiwitten onder omstandigheden, in vergelijking met het LAP-tagging protocol beschreven staat, zij niet zorgen voor induceerbare en afstembare expressie van de genen van belang hebben. Daarnaast hebben ze nog worden toegepast tandem epitoop labelen voor TAP. Het is ook belangrijk op te merken dat andere tagging systemen ook kunnen worden gemodificeerd verenigbaar met de hier beschreven voor het genereren induceerbare epitoop-gemerkte stabiele cellijnen systeem te worden. Zo heeft nabijheid biotine afhankelijke identificatie (BioID) veel aandacht getrokken vanwege zijn vermogen om ruimtelijke en temporele relaties tussen interagerende eiwitten 26 definiëren. Deze techniek maakt gebruik van proteïnefusies een promiscue stam van de Escherichia coli biotineligase BirA, die biotinylerenTussen elk eiwit in een ~ 10 nm straal van het enzym. De gebiotinyleerde eiwitten worden vervolgens affiniteit gezuiverd onder toepassing van biotine-affiniteitsinvangmiddel en geanalyseerd op samenstelling door massaspectrometrie. BirA zal elk eiwit biotinyleren dicht, zelfs tijdelijk, waardoor het bijzonder geschikt voor het detecteren van zwakke interactie partners binnen een complex 27 maakt. Bovendien wordt de zuivering regeling niet noodzakelijk dat endogeen eiwit-eiwit interacties intact blijven en kan onder denaturerende omstandigheden worden uitgevoerd, waardoor het aantal valse meldingen verminderen. In onze huidige protocol, zou de substitutie van de pGLAP1 vector een vector BirA-tagging dit systeem transformeren van identificeren eiwit-eiwit interacties op basis van affiniteit voor het detecteren van hen op basis van de nabijheid. Een dergelijk systeem zou voordelig zijn voor het detecteren van voorbijgaande proteïne interacties zoals het geval tussen verschillende enzym-substraat interacties en voor het afbeelden van de spatiotemporele eiwit-eiwit interactions binnen gedefinieerde structuren heeft uit voor de centrosome en cilia 26,28 uitgevoerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
- Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
- LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
- ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
- Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
- Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
- Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
- Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
- Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
- Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
- Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
- Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
- Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
- Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
- Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
- Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
- Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
- Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
- Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
