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Biology

जांच प्रोटीन समारोह, spatiotemporal स्थानीयकरण और प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए inducible एलएपी टैग स्थिर सेल लाइन्स

Published: December 24, 2016 doi: 10.3791/54870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

Protocol

नोट: हित के किसी भी प्रोटीन के लिए inducible एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है और एलएपी टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि और बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक के लिए तैयार करने का अवलोकन विश्लेषण चित्रा 3 में सचित्र है।

1. गोद टैग वेक्टर में ब्याज की जीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) क्लोनिंग

  1. शटल वेक्टर में ब्याज की जीन की ओआरएफ क्लोनिंग।
    1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करें या तो एन टर्मिनल संलयन या सी टर्मिनल संलयन के लिए प्राइमरों के भीतर उचित attB1 और attB2 साइटों के साथ ब्याज की ओआरएफ बढ़ाना। प्राइमर दृश्यों और स्थितियों के लिए पीसीआर तालिका 2 के लिए 1 टेबल देखें।
    2. जेल एक 1% agarose जेल पर उन्हें हल करने के द्वारा पीसीआर उत्पादों शुद्ध। प्रवर्धित बैंड जेल से सही आकार है कि आबकारी एवं एक डीएनए जी का उपयोग कर जेल टुकड़ा से निकालनेनिर्माता के निर्देशों के अनुसार अल निकासी किट।
    3. एक attP शटल वेक्टर युक्त और recombinase कि पीसीआर उत्पादों के निर्माता के निर्देशों के अनुसार वेक्टर में recombine करने के लिए अनुमति देता है के साथ पीसीआर उत्पादों युक्त शुद्ध attB सेते हैं (देखें मी aterials तालिका)।
      नोट: खाली शटल वैक्टर और एलएपी-टैगिंग वैक्टर सीसीडी बी जीन होते हैं और सीसीडी बी प्रतिरोधी जीवाणु की कोशिकाओं में प्रचारित किया जाना है (देखें सामग्री तालिका)। हालांकि ccdB जीन जब क्लोन ORFs साथ वैक्टर प्रचार इसलिए मानक DH5α ई कोलाई कोशिकाओं का उपयोग बाहर recombined है जब एक ओआरएफ इन वैक्टर में डाला जाता है।
    4. एक Luria शोरबा (पौंड) 50 मिलीग्राम के साथ अगर प्लेट / मिलीलीटर Kanamycin 13 पर बदल कोशिकाओं प्रतिक्रिया उत्पाद के 1 μl के साथ DH5α ई कोलाई कोशिकाओं को बदलने और थाली।
    5. Kanamycin प्रतिरोधी कालोनियों का चयन करें।
    6. पौंड मुझ में चयनित कालोनियों बढ़ो50 मिलीग्राम / मिलीलीटर Kanamycin साथ दीया, एक डीएनए मिनी प्रस्तुत कर सकते हैं और 3 टेबल में सूचीबद्ध अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग डीएनए अनुक्रमण द्वारा जीन एकीकरण की पुष्टि करें।
  2. गोद टैग वेक्टर में शटल वेक्टर से ब्याज की जीन स्थानांतरण।
    1. शटल गोद टैग वेक्टर और recombinase कि प्रति के रूप में गोद टैग वेक्टर में शटल वेक्टर से ब्याज की जीन के हस्तांतरण मध्यस्थता (एन टर्मिनल संलयन के लिए pGLAP1) के साथ ब्याज ओआरएफ के अनुक्रम सत्यापित जीन युक्त वेक्टर सेते निर्माता के निर्देशों (सामग्री देखें)।
      नोट: गोद / नल वैक्टर कि वांछित प्रमोटर, मिलान टैग के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है की एक श्रृंखला है, और एन या सी टर्मिनल टैगिंग तालिका 4 में पाया जा सकता है।
    2. DH5α ई कोलाई कोशिकाओं प्रतिक्रिया उत्पाद के 1 μl के साथ 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन 13 के साथ एक लेग अगर थाली पर बदल कोशिकाओं को बदलने और थाली।
    3. एम्पीसिलीन प्रतिरोधी Colo का चयन करेंलोग।
    4. 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ लेग मीडिया में चयनित कालोनियों हो जाना, एक डीएनए मिनी प्रस्तुत करते हैं, और 5 तालिका में सूचीबद्ध अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग डीएनए अनुक्रमण द्वारा जीन एकीकरण की पुष्टि करें।

कि ब्याज की गोद टैग जीन एक्सप्रेस एक inducible स्थिर सेल लाइन की 2. जनरेशन

  1. सेल लाइन सर्वोत्तम हित की परियोजना के लिए उपयुक्त का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, किसी भी मौजूदा सेल लाइन है कि अनिवार्यता से tetr व्यक्त किया और एक FRT साइट (सामग्री देखें) ब्याज की गोद टैग जीन स्थिरतापूर्वक जीनोम में एकीकृत करने की अनुमति देता है कि होता है से एक मेजबान सेल लाइन बनाने के लिए।
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक HEK293 सेल लाइन है कि tetr और एक FRT साइट है, जो -Tet DMEM / F12 मीडिया 4 [10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) कि टेट्रासाइक्लिन (-Tet) से रहित है के साथ बनाया] में उगाया जाता है शामिल हैं का उपयोग करता है ।
  2. Hygromycin की न्यूनतम एकाग्रता का निर्धारण 2 मूत के लिए 1 के भीतर मेजबान सेल लाइन मारने के लिए आवश्यकदवा इसके बाद एस। एकाग्रता सबसे अधिक 100 माइक्रोग्राम / एमएल और 800 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच लेकर साथ, मेजबान सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के 1-2 सप्ताह के भीतर मर जाएगा पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin साथ -Tet DMEM / F12 मीडिया में उगाई HEK293 कोशिकाओं।
  3. निर्माता के निर्देशों सह transfect प्रति के रूप में वेक्टर कि व्यक्त flippase recombinase एक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग HEK293 कोशिकाओं में एलएपी टैग वेक्टर के साथ (सेल के जीनोम के भीतर FRT साइट में ब्याज की गोद टैग जीन के एकीकरण मध्यस्थता) । एलएपी वेक्टर से 14 recombinase वेक्टर की 1: 4 के अनुपात का उपयोग।
    ध्यान दें: इष्टतम अनुपात मेजबान सेल लाइन और अभिकर्मक की विधि पर निर्भर है, और एक अनुमापन आवश्यकता हो सकती है। 4 के एक अनुपात: 1 सबसे सेल लाइनों के लिए अच्छी तरह से काम करता है। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक नकली ट्रांसफ़ेक्ट थाली में शामिल हैं।
  4. एक दिन बाद अभिकर्मक, ताजा मीडिया के साथ -Tet DMEM / F12 मीडिया की जगह।
  5. दो दिनों के बाद transfecti25% संगम, विभाजन कोशिकाओं पर। कोशिकाओं ~ 5 घंटा देते हैं, तो एकाग्रता 2.2 चरण में पूर्व निर्धारित पर hygromycin युक्त -Tet DMEM / F12 मीडिया को जोड़ने की अनुमति दें। HEK293 के लिए कोशिकाओं 100 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin का उपयोग करें।
    नोट: FRT HEK293 सेल लाइन युक्त भी tetr कि, Blasticidin प्रतिरोध के साथ जुड़ा हुआ है इसलिए 5 माइक्रोग्राम / एमएल Blasticidin tetr के लिए चयन करने के लिए और टपकाया अभिव्यक्ति को कम से कम करने के लिए स्थिर सेल लाइन चयन प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है शामिल हैं।
  6. जरूरत के रूप में जब तक अलग सेल foci दिखाई कि पारदर्शी थाली के खिलाफ अपारदर्शी धब्बे के समान hygromycin युक्त -Tet DMEM / F12 मीडिया बदलें।
  7. एक 200 μl pipet टिप के साथ प्रत्येक कोशिका foci के शीर्ष पर trypsin के 20 μl जोड़ें और pipet और नीचे 2 बार। एक 24 अच्छी तरह से थाली में रखें कोशिकाओं और hygromycin युक्त -Tet DMEM / F12 मीडिया में लगातार वृद्धि से कोशिकाओं का विस्तार।
  8. निश्चित सेल या लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा inducible गोद टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति देने के लिए स्क्रीन कोशिकाओं और / यागोद टैग 15 के भीतर GFP टैग के लिए पश्चिमी सोख्ता।

3. एलएपी टैग प्रोटीन परिसरों की शुद्धि

नोट: स्थिति और मात्रा में पिछले अनुभव के आधार पर एक विशिष्ट एलएपी टैग प्रोटीन शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया पर निम्नलिखित एलएपी टैग प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल विवरण सिफारिशें की हैं। हालांकि, सतर्कता सुनिश्चित करने के लिए कि अनुभवजन्य अनुकूलन हित के किसी भी प्रोटीन जटिल और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करने के लिए किया जाता है प्रयोग किया जाना चाहिए।

  1. सेल के विकास और सेल कटाई।
    1. प्रोटीन परिसरों के नल अलगाव के लिए मान्य एलएपी टैग सेल लाइन का विस्तार, लगातार 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 बड़े प्लेटों और / या -Tet DMEM / F12 मीडिया में रोलर बोतलों में सभी HEK293 कोशिकाओं passaging द्वारा।
    2. Tet / Dox inducible सेल लाइनों के लिए, 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल Tet / Dox जब कोशिकाओं तक पहुँचने ~ 70% confluency की एकाग्रता में 10-15 घंटे के लिए प्रेरित, harvestin पहलेजी कोशिकाओं।
      नोट: एकाग्रता और प्रेरण समय प्रत्येक प्रोटीन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए, 10-15 घंटे के लिए 0.1-1 माइक्रोग्राम / एमएल Tet / Dox की एक अनुमापन की सिफारिश की है।
    3. आंदोलन या 5-10 मिनट के लिए 875 XG पर trypsinization और गोली कोशिकाओं द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  2. युग्मन विरोधी GFP एंटीबॉडी प्रोटीन मोती
    1. एक lysate एक 0.5 मिलीलीटर सेल गोली से तैयार है, पैक सेल मात्रा (PCV) से immunoprecipitation के लिए एंटीबॉडी के 40 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें।
      नोट: गोद टैग प्रोटीन, अन्य कारकों के बीच की बहुतायत पर निर्भर करेगा की जरूरत एंटीबॉडी की राशि, और अनुकूलन की आवश्यकता होगी। 10-40 माइक्रोग्राम का अनुमापन की सिफारिश की है।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में PBST (पीबीएस + 0.1% बीच 20) में 160 μl पैक मात्रा (पीवी) एक प्रोटीन मोती संतुलित करना। PBST के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: इस के साथ साथ सभी washes 10 सेकंड के लिए 5000 XG पर मोती centrifuging द्वारा किया जाता है।
    3. 500 μl PBST में और आत्मीयता के 80 माइक्रोग्राम जोड़ने Resuspend मोती160 μl मोतियों की प्रत्येक ट्यूब -purified खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी। (आरटी) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिक्स।
    4. मोती PBST के 1 मिलीलीटर के साथ 2 बार धोएं। फिर, मोती 0.2 एम सोडियम borate, पीएच 9 (20 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम borate + 15 मिलीलीटर 0.2 एम बोरिक एसिड) के 1 मिलीलीटर के साथ 2 बार धो लें। अंतिम धोने के बाद, 1 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए 0.2 एम सोडियम borate के 900 μl, पीएच 9 जोड़ें।
    5. 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 220 मिमी dimethylpimelimidate (DMP) के 100 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए आरटी पर धीरे ट्यूबों घुमाएँ। के लिए 220 मिमी DMP, 0.2 एम सोडियम borate, पीएच 9 के 877 μl में एक 50 मिलीग्राम बोतल की सामग्री resuspend और मनका निलंबन के लिए तुरंत जोड़ें।
    6. DMP साथ ऊष्मायन के बाद, मोती 0.2 एम ethanolamine, 0.2 एम NaCl पीएच 8.5 से 1 मिलीलीटर के साथ 1 बार धोने अवशिष्ट crosslinker निष्क्रिय करने के लिए। एक ही बफर के 1 मिलीलीटर और में Resuspend मोती आरटी पर 1 घंटे के लिए बारी बारी से। गोली माला और 0.2 एम ethanolamine, 0.2 एम NaCl पीएच 8.5 के 500 μl में resuspend मोती। मोती severa के लिए स्थिर रहे4 डिग्री सेल्सियस पर एल महीने।
  3. सेल और परिसर शोधन के लिए बफ़र की तैयारी
    1. एक पीएच 7.4 समाधान बनाकर; LAPX बफ़र्स (सेल के लिए 300 मिमी, सबसे मनका washes के लिए 200 मिमी, और कपड़े धोने मोती के लिए 100 मिमी एल्यूटिंग करने से पहले प्रोटीन जहां एक्स वांछित नमक एकाग्रता एलएपी बफर के [मिमी KCl] है) तैयार 50 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), एक्स मिमी KCl, 1 मिमी एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड (EGTA), 1 मिमी 2 MgCl, और 10% ग्लिसरॉल युक्त।
      नोट: इस बफर के घटकों को जीवित कोशिकाओं में पर्यावरण लगभग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। HEPES 7.2-8.2 के पीएच गुस्से में एक बफर के रूप में प्रयोग किया जाता है। KCl बफर के ईओण ताकत बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है एक नमक है। EGTA एक ​​chelating एजेंट है कि कैल्शियम आयनों बांधता मैग्नीशियम की तुलना में कैल्शियम के स्तर को कम करने के लिए है। ग्लिसरॉल और 2 MgCl प्रोटीन की स्थिरता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
    2. 0.05% Nonyl phenoxypol जोड़कर LAPX एन बफर तैयारLAPX बफर करने के लिए yethoxylethanol।
      नोट: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol एक हल्के साबुन है कि प्रोटीन solubilizes है, लेकिन प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, इस प्रकार एक उच्च एकाग्रता निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है को बरकरार रखता है और यह तो बाध्यकारी और वाशिंग चरणों के दौरान उतारा है।
  4. सेल lysates की तैयारी
    1. 0.5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) और प्रोटीज अवरोधकों के साथ LAP300 के 2.5 मिलीलीटर में PCV के 500 μl Resuspend। 10% Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0.3% अंतिम) के 90 μl जोड़ें और उलटा द्वारा मिश्रण।
    2. बर्फ पर 10 मिनट के लिए रखें। 10 मिनट के लिए 21,000 XG पर अपकेंद्रित्र। इस कम गति सतह पर तैरनेवाला (LSS) ले लीजिए। जेल के विश्लेषण के लिए LSS की एक 10 μl नमूना ले लो।
    3. LSS 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100,000 XG पर एक TLA100.3 ट्यूब और स्पिन करने के लिए स्थानांतरण। एक ट्यूब में इस उच्च गति सतह पर तैरनेवाला (एचएसएस) लीजिए, और बर्फ पर जगह है। जेल के विश्लेषण के लिए एचएसएस की एक 10 μl नमूना ले लो।
      नोट: ऊपर सबसे लिपिड परत एक लेने से बचेंडी नीचे सबसे सेल मलबे परत। लिपिड परत वैक्यूम आकांक्षा एचएसएस इकट्ठा करने के लिए पहले से हटाया जाना चाहिए।
  5. प्रथम संबंध कब्जा: विरोधी GFP मोती के लिए बाइंडिंग
    1. पूर्व Elute एंटीबॉडी मिलकर मोती उन्हें क्षालन बफर [20 मिमी Tris, पीएच 7.4 से 3.5 मीटर MgCl 2] के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोने से (प्रति 0.5 मिलीलीटर सेल गोली (PCV) मोतियों की 160 μl का उपयोग करें) uncoupled से छुटकारा पाने के लिए एंटीबॉडी और पृष्ठभूमि को कम। जल्दी करो। एक लंबे समय के लिए उच्च नमक में मोती मत छोड़ो।
    2. मोती LAP200 एन के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं। मिक्स एचएसएस 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी मोतियों के साथ निकाल सकते हैं। 10 मिनट के लिए 21,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की एक 10 μl नमूना ले लो (यानी, (एफटी) के माध्यम से प्रवाह) जेल के विश्लेषण के लिए।
    3. मोती 0.5 मिमी डीटीटी और प्रोटीज अवरोधकों के साथ LAP200 एन के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं। मोती 2 बार (5 मिनट प्रत्येक) 0.5 मिमी डीटीटी और प्रोटीज अवरोधकों के साथ LAP200 एन के 1 मिलीलीटर के साथ धोएं। जल्दी से धो 2 टी0.5 मिमी डीटीटी के साथ LAP200 एन के 1 मिलीलीटर और तंबाकू खोदना वायरस (TEV) प्रोटीज जोड़ने से पहले कोई प्रोटीज अवरोधकों के साथ IME में।
  6. TEV विखंडन
    1. LAP200 एन के 1 मिलीलीटर में 10 माइक्रोग्राम TEV प्रोटीज पतला और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर नलियों को घुमाएगी।
      नोट: यह कदम किसी भी गोद टैग प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता कुछ ही घंटों में TEV प्रोटीज की एकाग्रता, जो एलएपी टैग प्रोटीन परिसरों के संरक्षण सहायता कर सकते हैं समायोजन करके पूरा किया जाना है।
    2. गोली माला और एक ताजा ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। साथ 0.5 मिमी डीटीटी के साथ 160 μl LAP200 एन और प्रोटीज अवरोधकों (ट्रिपल एकाग्रता) दो बार मोती कुल्ला किसी भी अवशिष्ट प्रोटीन को हटाने के लिए। जेल के विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला की एक 10 μl नमूना ले लो।
  7. दूसरा संबंध कब्जा: एस प्रोटीन Agarose के लिए बाइंडिंग
    1. 80 μl एस प्रोटीन agarose घोल का 1 ट्यूब (40 μl पैक राल) LAP200 एन के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: एस protein एस-टैग के लिए बाध्य एक सक्रिय RNase पुनर्गठन होगा और एक वैकल्पिक दूसरे मिलान टैग आरएनए युक्त प्रोटीन परिसरों के लिए विचार किया जाना चाहिए।
    2. TEV जोड़े 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एस प्रोटीन agarose मोती और रॉक करने के लिए सतह पर तैरनेवाला eluted। गोली माला और 0.5 मिमी डीटीटी और प्रोटीज अवरोधकों के साथ LAP200 एन के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं। मोती LAP100 के 1 मिलीलीटर के साथ 2 बार धोएं।
  8. प्रोटीन क्षालन
    1. 10 मिनट के लिए 97 डिग्री सेल्सियस पर 4x Laemmli नमूना बफर और गर्मी के 50 μl जोड़कर agarose बंद प्रोटीन elute एस प्रोटीन।
      नोट: प्रोटीन भी क्षालन बफर (20 मिमी Tris, पीएच 7.4 से 3.5 मीटर MgCl 2) के साथ मोती से eluted जा सकता है।

4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा प्रोटीन बातचीत को पहचानें

  1. सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ), चांदी धुंधला जेल से एकत्र नमूनों का विश्लेषण करके शुद्धि की गुणवत्ता का परीक्षण (देखें 16 काम किया, चित्रा 4 देखें द्वारा।
  2. stoichiometric और substoichiometric सह-सफ़ाई प्रजातियों की पहचान करने के लिए, अंतिम क्षालन नमूना लेने के लिए और एसडीएस पृष्ठ से अलग। एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री संगत प्रोटीन दाग के साथ जेल दाग। सबसे प्रमुख बैंड और जेल से उन दोनों के बीच में अंतरिक्ष आबकारी एवं मास स्पेक्ट्रोमेट्री अलग से 16 से विश्लेषण के लिए उन्हें प्रक्रिया।
    नोट: अंतिम शुद्धि eluates को अलग करने और उन्हें मास स्पेक्ट्रोमेट्री 5 के लिए तैयार करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं। उदाहरण के लिए, गोद शुद्ध परिसरों उच्च नमक (3.5 मीटर MgCl 2) और पूरे प्रोटीन आबादी सामूहिक रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री 17 से विश्लेषण किया जा सकता का उपयोग करके एस प्रोटीन मोतियों से eluted जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, अंतिम eluates एसडीएस पृष्ठ से 1 मिमी और एक भी 1 मिमी बैंड ई हो सकता है के लिए अलग किया जा सकताxcised और विश्लेषण किया। यह किसी भी मोती या बात कण है कि विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेगा की जटिल मिश्रण को साफ करता है।

Representative Results

इस प्रणाली की उपयोगिता पर प्रकाश डाला करने के लिए, खुला पढ़ने फ्रेम ताउ microtubule बाध्यकारी प्रोटीन की (ओआरएफ) (तालिका 1) attB1 और attB2 साइटों युक्त प्राइमरों के साथ ताउ ओआरएफ amplifying और साथ पीसीआर उत्पादों incubating द्वारा शटल वेक्टर में क्लोन किया गया था शटल वेक्टर और एक recombinase कि शटल वेक्टर में पीसीआर उत्पादों की प्रविष्टि मध्यस्थता करता है। प्रतिक्रिया उत्पादों Kanamycin प्रतिरोधी कालोनियों से DH5α बैक्टीरिया 13 और प्लास्मिड डीएनए को बदलने के लिए ताउ प्रविष्टि सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रम था इस्तेमाल किया गया। एक दृश्य मान्य शटल-ताऊ वेक्टर तो pGLAP1 वेक्टर, जो गोद (EGFP-TEV-S-प्रोटीन) टैग के साथ फ्रेम में ताऊ जुड़े हुए में ताऊ ओआरएफ हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, pGLAP1 वेक्टर के साथ शटल-ताऊ वेक्टर incubating द्वारा और recombinase कि pGLAP1 के लिए शटल वेक्टर से ओआरएफ के हस्तांतरण मध्यस्थता करता है। प्रतिक्रिया उत्पादों DH5α बैक्टीरिया को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गयाएम्पीसिलीन प्रतिरोधी कालोनियों से 13 और प्लास्मिड डीएनए सुनिश्चित करने के लिए कि गोद ताउ संलयन फ्रेम में था अनुक्रम था। अनुक्रम मान्य pGLAP1 गोद-ताऊ तो ​​एक वेक्टर कि HEK293 कोशिकाओं में flippase पुनर्संयोजन एंजाइम है कि एक भी flippase मान्यता लक्ष्य (FRT) उनके जीनोम के भीतर साइट है, जो गोद टैग जीनों के लिए एकीकरण की साइट है निहित व्यक्त के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट गया था 14। यह सेल लाइन भी tetr कि गोद टैग जीन के अपस्ट्रीम Tet ऑपरेटरों को बांधता है और Tet / Dox की अनुपस्थिति में उनकी अभिव्यक्ति चुप्पी व्यक्त किया। स्थिर integrants 5 दिनों के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin साथ -Tet DMEM / F12 मीडिया के साथ चयन किया गया था। व्यक्तिगत hygromycin प्रतिरोधी सेल foci शीर्ष पर trypsin के 20 μl जोड़ने और नीचे 2 बार अप pipetting द्वारा काटा गया। प्रकोष्ठों एक 24 अच्छी तरह से थाली में रखा गया है और -Tet DMEM / F12 मीडिया में लगातार वृद्धि से विस्तार किया गया।

कि hygromycin प्रतिरोधी सेल सत्यापित करने के लिएगोद-ताऊ व्यक्त करने में सक्षम थे, HEK293 गोद ताउ कोशिकाओं 15 घंटा और प्रोटीन के अर्क के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल Dox के साथ प्रेरित किया गया गैर-प्रेरित और Dox प्रेरित कोशिकाओं से तैयार किए गए थे। इन निष्कर्षों एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे, एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित, और GFP और ट्यूबिलिन लोडिंग नियंत्रण के रूप के लिए immunoblotted। जैसा कि चित्र -4 ए, गोद ताउ में देखा (विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ कल्पना) केवल Dox की उपस्थिति में व्यक्त की गई थी। कि गोद ताउ ठीक से, बँटवारा दौरान mitotic microtubule धुरी के लिए स्थानीयकृत किया गया था के रूप में पहले अंतर्जात ताउ 18 के लिए दिखाया गया था मान्य करने के लिए, HEK293 गोद ताउ कोशिकाओं 15 घंटे के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल Dox के साथ प्रेरित कर रहे थे और कोशिकाओं 4% के साथ तय किया गया paraformaldehyde और सह दाग डीएनए (Hoechst 33342) और सूक्ष्मनलिकाएं (विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी) के लिए। लगातार, गोद ताउ बँटवारा के metaphase (चित्रा 4 बी) के दौरान mitotic धुरा के लिए स्थानीय दिया गया था। कि गोद ताउ और अपनी बातचीत प्रोटीन सत्यापित करने के लिए इस व्यवस्था के साथ शुद्ध किया जा सकता हैमंदिर, HEK293 गोद ताउ कोशिकाओं, रोलर की बोतलों के लिए ~ 70% confluency में बड़े हो रहे थे 15 घंटे के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल Dox के साथ प्रेरित, आंदोलन द्वारा काटा LAP300 बफर के साथ lysed, और गोद ताउ ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर शुद्ध किया गया था। गोद ताउ शुद्धि से eluates एसडीएस पृष्ठ से सुलझाया गया और जेल चांदी सना हुआ था। चित्रा 4C चलता गोद ताउ शुद्धि, एक तारक से चिह्नित गोद ताउ और कई अन्य बैंड ताउ बातचीत प्रोटीन का संकेत देखा जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: हित के किसी भी प्रोटीन के लिए गोद टैग inducible स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी का अवलोकन। ब्याज की जीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) attB1 और attB2 साइटों 5 'और 3' अंत दृश्यों, flanking क्रमशः के साथ परिलक्षित कर रहे हैं (प्राइमर दृश्यों में दिए गए हैं 1 टेबल) और में क्लोन शटल वेक्टर। ब्याज की जीन के साथ दृश्य सत्यापित शटल वैक्टर तो pGLAP1 वेक्टर में ब्याज की जीन स्थानांतरण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। अनुक्रम ब्याज की जीन के साथ सत्यापित pGLAP1 वेक्टर फिर वांछित सेल लाइन एक भी flippase मान्यता लक्ष्य (FRT) उनके जीनोम के भीतर साइट है, जो गोद लिए एकीकरण की साइट है जिसमें में flippase recombinase युक्त वेक्टर के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट है -tagged जीनों। ये सेल लाइनों को भी गोद टैग जीन के अपस्ट्रीम Tet repressor (tetr) कि Tet ऑपरेटरों को बांधता (teto 2) को व्यक्त करने और Tet / Dox की अनुपस्थिति में उनकी अभिव्यक्ति चुप्पी। ब्याज की गोद टैग जीन तो FRT साइट में recombined है और स्थिर integrants hygromycin साथ चुना जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों के लिए आवेदन का अवलोकन। एलएपी टैग inducible स्थिर सेल लाइनों Dox अलावा द्वारा ब्याज की गोद टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं और कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों में सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है या किसी भी वांछित संकेतन मार्ग सक्रिय करने के लिए रसायन या ligands के साथ प्रेरित किया जा सकता है। ब्याज की गोद टैग प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण जीवित कोशिका या निश्चित सेल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। एलएपी टैग प्रोटीन भी मिलकर आत्मीयता शुद्ध और उनकी बातचीत प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) द्वारा पहचाना जा सकता है हो सकता है। अंत में, Cytoscape चारा प्रोटीन का एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Dox डॉक्सीसाइक्लिन इंगित करता है, आईपी immunoprecipitate इंगित करता है, EGFP हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन बढ़ाया इंगित करता है, TeV TEV प्रोटीज दरार साइट को इंगित करता है, और एस एस इंगित करता है टैग।http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एलएपी टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति, शोधन और तैयारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए का अवलोकन। 1) विकास और एलएपी टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण, 2) सेल कटाई और सेल, 3) lysates की तैयारी, 4) विरोधी GFP मोती lysates के बंधन, 5) TEV प्रोटीज की दरार: प्रोटोकॉल 9 कदम है GFP टैग, 6) एस प्रोटीन मोती lysates के बंधन, 7) चारा प्रोटीन और बातचीत प्रोटीन, और 8-9) मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी की क्षालन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4
चित्रा 4: गोद ताउ अभिव्यक्ति का सत्यापन। (ए) पश्चिमी धब्बा (पश्चिम बंगाल) गैर-प्रेरित और Dox प्रेरित गोद ताउ HEK293 एलएपी टैग ताउ प्रोटीन और ट्यूबिलिन लोडिंग नियंत्रण क्रमश: पता लगाने के लिए विरोधी GFP और विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ जांच की कोशिकाओं से प्रोटीन के नमूने के विश्लेषण। नोट जब कोशिकाओं Dox के साथ प्रेरित कर रहे हैं कि गोद ताउ ही व्यक्त की है। व्यक्त गोद ताउ (बी) mitotic कोशिकाओं तय किया गया और सह दाग विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी और एलएपी-ताऊ की subcellular स्थानीयकरण के साथ डीएनए (Hoechst 33342) और ट्यूबिलिन (टब) के लिए प्रतिदीप्ति microcopy द्वारा विश्लेषण किया गया था। ध्यान दें कि गोद ताउ बँटवारा दौरान mitotic धुरा और धुरी डंडे लिए localizes। (सी) चांदी गोद ताउ शुद्धि की जेल दाग। मेगावाट आणविक वजन को इंगित करता है, सीएल को मंजूरी दे दी lysates, और ई Indic इंगित करता हैAtes अंतिम eluates। नमूने एक 4-20% एसडीएस पृष्ठ पर चलाए जा रहे थे और जेल चांदी शुद्ध प्रोटीन कल्पना करने के लिए सना हुआ था। ध्यान दें कि एक बैंड गोद ताउ के लिए इसी एक तारांकित और कई अन्य बैंड इसी सह-सफ़ाई के लिए प्रोटीन देखा जा सकता है के साथ चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एन टर्मिनल संलयन
आगे 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
रिवर्स 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT टी TTATCA - (> 18gsn) -3 '
सी टर्मिनल संलयन
आगे 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
रिवर्स 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT जी - (> 18gsn) -3 '

तालिका 1: फॉरवर्ड और शटल वेक्टर में सम्मिलन के लिए ORFs या ब्याज amplifying के लिए प्राइमर उल्टा। attB साइटों बोल्ड अक्षरों में डाला जाता है, GSN अर्थ है कि अधिक से अधिक 18 जीन विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड प्राइमर के लिए जोड़ रहे हैं।

चरण तापमान पहर
प्रारंभिक विकृतीकरण 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
पीसीआर प्रवर्धन चक्र (35) denature 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
पानी रखना 55 डिग्री सेल्सियस (प्राइमर टीएम के आधार पर) 30 सेकंड
बढ़ाएँ 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट / केबी
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के लिए

तालिका 2: ब्याज की ORFs के प्रवर्धन के लिए पीसीआर स्थितियों।

वेक्टर फॉरवर्ड अनुक्रमण प्राइमर रिवर्स अनुक्रमण प्राइमर
शटल वेक्टर 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT -3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC -3 '

तालिका 3: फॉरवर्ड और शटल वेक्टर के लिए रिवर्स अनुक्रमण प्राइमरों।

आईडी संरचना पैतृक प्रमोटर बीएसी रेस Mam रेस Tet reg?
pGLAP1 एन अवधि EGFP-TEV-एस पेप्टाइड pcDNA5 / FRT / करने के लिए सीएमवी एम्प HYG हाँ
pGLAP2 एन अवधि के ध्वज-TEV-एस पेप्टाइड pcDNA5 / FRT / करने के लिए सीएमवी एम्प HYG हाँ
pGLAP3 एन अवधि EGFP-TEV-एस पेप्टाइड; सी अवधि V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a एम्प HYG नहीं
pGLAP4 एन अवधि के ध्वज-TEV-एस पेप्टाइड; ; सी अवधि V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a HYG नहीं
pGLAP5 सी अवधि एस पेप्टाइड PreProt X2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a एम्प HYG नहीं

तालिका 4: चर प्रमोटरों, मिलान टैग, और एन के लिए Dox inducible अभिव्यक्ति क्षमताओं या सी टर्मिनल प्रोटीन टैगिंग के साथ उपलब्ध गोद / नल वैक्टर की सूची। वैक्टर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। बीएसी रेस बैक्टीरियल प्रतिरोध मार्कर इंगित करता है, Mam रेस स्तनधारी सेल प्रतिरोध मार्कर, Tet reg इंगित करता है? यह इंगित करता है कि क्या अभिव्यक्ति Tet / Dox regulatable है।

वेक्टर फॉरवर्ड अनुक्रमण प्राइमर रिवर्स अनुक्रमण प्राइमर
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG -3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC -3 '
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG -3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC -3 '
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA -3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG -3 '
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC -3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG -3 '
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG -3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG -3 '

तालिका 5: फॉरवर्ड और pGLAP वैक्टर के लिए रिवर्स अनुक्रमण प्राइमरों।

Discussion

उल्लिखित प्रोटोकॉल एलएपी-टैगिंग वेक्टर में ब्याज की जीन की क्लोनिंग का वर्णन है, inducible एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी है, और एलएपी टैग प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन परिसरों की शुद्धि। अन्य गोद / नल-टैगिंग दृष्टिकोण के लिए सम्मान के साथ, इस प्रोटोकॉल उच्च throughput दृष्टिकोण किसी भी सेलुलर मार्ग के भीतर प्रोटीन स्थानीयकरण और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नक्शा करने के साथ संगत होना करने के लिए सुव्यवस्थित किया गया है। यह दृष्टिकोण व्यापक रूप से कोशिका चक्र प्रगति, mitotic धुरा विधानसभा, धुरी पोल homeostasis, और ciliogenesis के लिए महत्वपूर्ण कुछ ही नाम के प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया गया है और कैसे इन प्रोटीनों की misregulation मानव रोगों 15 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की समझ सहायता प्राप्त है, 16,19,20। उदाहरण के लिए, हमारे समूह ने हाल ही धुरी विधानसभा 15,21 में समारोह और STARD9 mitotic kinesin के विनियमन (एक उम्मीदवार कैंसर लक्ष्य) को परिभाषित करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है, एक परिभाषित करने के लिएTctex1d2 dynein प्रकाश श्रृंखला के बीच नए आणविक लिंक और कम पसली polydactyly सिंड्रोम (SRPS) 19, और समझ कैसे Mid2 यूबीक्यूटिन ligase का उत्परिवर्तन एक्स से जुड़े बौद्धिक रूप से विकलांग 16 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के लिए एक नया आणविक लिंक को परिभाषित करने के लिए। अन्य प्रयोगशालाओं भी सफलतापूर्वक इस पद्धति लागू की गई है, एक है कि निर्धारित किया है कि Tctn1, माउस का हाथी संकेतन का एक रेगुलेटर, एक ciliopathy जुड़े प्रोटीन जटिल है कि का एक हिस्सा था सहित विनियमित सिलिअरी झिल्ली संरचना और एक ऊतक निर्भर तरीके 22,23 में ciliogenesis। इसलिए, इस प्रोटोकॉल मोटे तौर पर किसी भी सेलुलर मार्ग के विच्छेदन के लिए लागू किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों है कि hygromycin प्रतिरोधी रहे हैं का चयन है। विशेष देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि नियंत्रण थाली में सभी कोशिकाओं प्रवर्धन के लिए प्रयोगात्मक थाली में foci चयन करने से पहले मर चुके हैं लिया जाना चाहिए। Hygromycin भी adde जा सकती हैडी एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों की दिनचर्या सेल संवर्धन के दौरान आगे सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं FRT स्थल पर ब्याज की गोद टैग जीन बनाए रखें। हम चेतावनी देते हैं कि नहीं सभी एलएपी टैग प्रोटीन कार्यात्मक हो जाएगा और यह जगह में assays कि प्रोटीन समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है महत्वपूर्ण है कि। प्रोटीन समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया assays के उदाहरण siRNA प्रेरित phenotypes के और इन विट्रो गतिविधि assays में बचाव शामिल हैं। एक बड़ी गोद टैग के अलावा के साथ किसी भी संभावित समस्याओं का समाधान करने के लिए, हम पहले इस प्रणाली है कि छोटे टैग, ध्वज की तरह है, जो कम समारोह और ब्याज की प्रोटीन का स्थानीयकरण बाधित होने की संभावना है को रोकने के साथ संगत नल-टैग वैक्टर उत्पन्न किया है 4। इसके अलावा, गोद टैगिंग वैक्टर सी टर्मिनल एलएपी टैग प्रोटीन या सी टर्मिनल नल टैग प्रोटीन है कि इस प्रणाली है, जो मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां एक गोद / नल टैग एन पर सहन नहीं किया है के साथ संगत कर रहे हैं पैदा करने के लिए मौजूद हैं एक प्रोटीन की -terminus। इसके अतिरिक्त, धशुद्धि बफ़र्स (LAPX एन) के ई नमक और डिटर्जेंट सांद्रता बढ़ाने या कोई भी या बहुत अधिक बातचीत मनाया जाता है शुद्धि तंगी कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, मिलकर आत्मीयता शुद्धि प्रक्रिया इस प्रकार एक भी शुद्धि योजना जब कुछ या कोई interactors पहचान कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है, एकल शुद्धि प्रक्रियाओं और कमजोर interactors की तुलना में अधिक कड़े खो दिया जा सकता है।

यह ध्यान रखें कि अन्य GFP मिलान टैगिंग दृष्टिकोण मौजूद है कि बड़े पैमाने पर GFP प्रोटीन प्रोटीन स्थानीयकरण और शुद्धि के अध्ययन के लिए 24,25 टैगिंग की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। ये बीएसी TransgenOmics दृष्टिकोण है कि जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों का इस्तेमाल उनके पैतृक वातावरण से ब्याज की GFP टैग जीन व्यक्त करने के लिए कि सभी नियामक तत्व है, जो mimics अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति 24 शामिल शामिल हैं। हाल ही में, CAS9 / एकल निर्देशित आरएनए (sgRNA) ribonucleoprotein परिसरों (RNPs) अंत इस्तेमाल किया गया हैogenously एक विभाजन GFP प्रणाली है कि उनके अंतर्जात जीनोमिक loci 25 से GFP टैग जीनों की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के साथ ब्याज की जीन को टैग। इन तरीकों के दोनों एलएपी-टैगिंग यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में अंतर्जात की शर्तों के तहत टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सक्षम हालांकि, वे ब्याज की टैग किए गए जीन की inducible और ट्यून करने योग्य अभिव्यक्ति के लिए अनुमति नहीं है। इसके अतिरिक्त, वे अभी तक मिलकर मिलान नल के लिए टैगिंग के लिए लागू किया जाना है। यह भी ध्यान दें कि अन्य टैगिंग सिस्टम भी सिस्टम यहां inducible मिलान टैग स्थिर सेल लाइनों पैदा करने के लिए वर्णित के साथ संगत बनने के लिए संशोधित किया जा सकता है महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, निकटता पर निर्भर बायोटिन पहचान (BioID) बातचीत प्रोटीन 26 के बीच स्थानिक और लौकिक संबंधों को परिभाषित करने की क्षमता के कारण काफी ध्यान हुई। इस तकनीक कोलाई बायोटिन ligase बीरा के एक अनेक तनाव है, जो biotinylate के लिए प्रोटीन fusions कारनामेएक ~ 10 एनएम एंजाइम के दायरे में किसी भी प्रोटीन है। biotinylated प्रोटीन तो आत्मीयता के बायोटिन संबंध कब्जा का उपयोग कर शुद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा रचना के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। बीरा करीब निकटता में किसी भी प्रोटीन biotinylate होगा, भले क्षणिक है, जो इसे विशेष रूप से एक जटिल 27 के भीतर कमजोर बातचीत भागीदारों पता लगाने के लिए अनुकूल बनाता है। इसके अतिरिक्त, शुद्धि योजना की जरूरत नहीं है कि अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बरकरार रहेगा और इस तरह झूठी सकारात्मक की दर को कम करने denaturing शर्तों के तहत बाहर किया जा सकता है। हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर, एक बीरा-टैगिंग वेक्टर द्वारा pGLAP1 वेक्टर के प्रतिस्थापन उन्हें निकटता के आधार पर पता लगाने के लिए समानता के आधार पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने से इस प्रणाली को बदल सकता है। इस तरह की एक प्रणाली क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए बेहद फायदेमंद होगा कई एंजाइम सब्सट्रेट के बीच बातचीत और spatiotemporal प्रोटीन, प्रोटीन inte मानचित्रण के लिए मामला हैपरिभाषित संरचनाओं के रूप में केंद्रपिंड और सिलिया 26,28 के लिए बाहर किया गया है भीतर ractions।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flp-In T-REx Core Kit Invitrogen K6500-01 Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5x Nunc, Inc.  73520-734 Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5x Nunc, Inc.  73520-420 Roller bottle for growing cells
Cell stackers Corning CellSTACK 3271 Cell stacker for growing cells
500 ml conical centrifuge tubes Corning  431123 Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody Invitrogen A11122 Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads Biorad 156-0006 Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP) ThermoFisher Scientific 21667 Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes Beckman 349622 Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease Invitrogen 12575-015 Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease GE Healthcare 27-0843-01 Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose Novagen 69704 Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit Qiagen 28704/28706 For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II Invitrogen 11789020 Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II Invitrogen 11791020 Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli Invitrogen A10460 Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6 Promega E2691 Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline Invitrogen Q100-19 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Doxycycline Clontech 631311 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Hygromycin B Invitrogen 10687010 Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin Corning 61-176-RG Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin Fisher BP1760-5 Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels Biorad 4561094 Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit Biorad 1610449 Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process 
Coomassie Blue stain Invitrogen LC6060 Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221 Invitrogen 12536017 Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44 Invitrogen V600520 Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10966018 Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4x Laemmli sample buffer Biorad 1610747 Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media Fisher BP9723-2 Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit Promega A1222 Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media Hyclone SH30023.01 For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet Altanta Biologicals S10350 Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin Hyclone SH30042.01 For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets Roche 11836170001 Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol  Roche 11332473001 Used for making protocol buffers
PBS Corning 21-040-CM Used for making protocol buffers
Tween-20 Fisher BP337-500 Used for making protocol buffers
Sodium Borate Fisher S249-500 Used for making protocol buffers
Boric Acid Fisher A78-500 Used for making protocol buffers
Ethanolamine Calbiochem 34115 Used for making protocol buffers
NaCl Fisher P217-3 Used for making protocol buffers
KCl Fisher BP358-10 Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172-25 Used for making protocol buffers
MgCl2 Fisher M33-500 Used for making protocol buffers
Tris base Fisher BP152-5 Used for making protocol buffers

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References

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Bradley, M., Ramirez, I., Cheung, K., Gholkar, A. A., Torres, J. Z. Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (118), e54870, doi:10.3791/54870 (2016).

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