Protocol
ANMÄRKNING: En översikt av alstring av inducerbara LAP-taggade stabila cellinjer för varje protein av intresse illustreras i figur 1 och en översikt av LAP-märkt protein expression, rening och beredning för mass proteomik analyser illustreras i Figur 3.
1. Kloning den öppna läsramen (ORF) av genen av intresse in i LAP-tag vektor
- Kloning av ORF av genen av intresse in i skyttelvektorn.
- Använda polymeraskedjereaktion (PCR) för att amplifiera ORF av intresse med de lämpliga attB1 och attB2 platser inom primrarna för antingen N-terminal fusion eller C-terminal fusion. Se tabell 1 för primersekvenser och tabell 2 för PCR-betingelser.
- Gel rena PCR-produkter genom att lösa dem på en 1% agarosgel. Skära det förstärkta band som är rätt storlek från gelén och extrahera den från gel skiva med hjälp av en DNA-gel utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera det renade attB innehållande PCR-produkter med en attP innehållande skyttelvektor och rekombinaset som gör att PCR-produkterna för att rekombinera in i vektorn enligt tillverkarens instruktioner (se M aterial tabell).
NOT: Tomma skyttelvektorer och LAP-taggningsvektorerna innehåller ccdB-genen och måste förökas i ccd B-resistenta bakterieceller (se Material tabell). Den ccdB genen men rekombineras när en ORF sätts in dessa vektorer, därför använder standard DH5a E. coli-celler när föröknings vektorer med klonade ORF. - Transformera DH5a E. coli-celler med 1 | j, l av reaktionsprodukten och plattan de transformerade cellerna på en Luria-buljong (LB) agarplatta med 50 mg / ml Kanamycin 13.
- Selektera Kanamycinresistenta kolonier.
- Odla utvalda kolonier i LB migdia med 50 mg / ml Kanamycin, göra en DNA-mini-prep och bekräfta genen integration genom DNA-sekvensering med användning av de sekvenseringsprimrar som anges i tabell 3.
- Överföring av genen av intresse från skyttelvektorn i LAP-tag vektor.
- Inkubera skyttelvektorn innehållande sekvensen verifierades gen av intresse ORF med LAP-tag vektor (pGLAP1 för N-terminal fusion) och rekombinaset som medierar överföring av genen av intresse från skyttelvektorn in i LAP-tag vektor enligt tillverkarens instruktioner (se Material).
ANMÄRKNING: En serie av LAP / TAP-vektorer som kan användas baserat på den önskade promotor, epitop-tag, och N eller C-terminala taggning kan hittas i tabell 4. - Transformera DH5a E. coli-celler med 1 | j, l av reaktionsprodukten och plattan de transformerade cellerna på en LB-agarplatta med 100 mg / ml ampicillin 13.
- Välj ampicillinresistent färbolag.
- Växer de utvalda kolonierna i LB-medium med 100 mg / ml Ampicillin, göra en DNA-mini-prep, och bekräfta gen integration genom DNA-sekvensering med användning av de sekvenseringsprimrar som anges i tabell 5.
- Inkubera skyttelvektorn innehållande sekvensen verifierades gen av intresse ORF med LAP-tag vektor (pGLAP1 för N-terminal fusion) och rekombinaset som medierar överföring av genen av intresse från skyttelvektorn in i LAP-tag vektor enligt tillverkarens instruktioner (se Material).
2. Generering av en inducerbar Stabil cellinje som uttrycker LAP-märkta genen av intresse
- Välj cellinje bäst lämpad för projektet av intresse. Alternativt skapa en värdcellinje från någon existerande cell-linje som konstitutivt uttrycker TetR och innehåller ett FRT-säte som gör att LAP-märkta genen av intresse som ska integreras stabilt i genomet (se Material).
OBS: Detta protokoll använder en HEK293-cellinje som innehåller den TetR och en FRT-säte, som odlas i -Tet DMEM / F12-medium [gjord med 10% fetalt bovint serum (FBS) som saknar Tetracyklin (-Tet)] 4 . - Bestäm minsta koncentration av Hygromycin krävs för att döda värdcellen linje inom 1-2 weeks efter drogberoende. Koncentrationen kan variera mellan värdcellinjer, med de flesta i intervallet mellan 100 | j, g / ml och 800 pg / ml.
OBS: HEK293-celler som odlats i -Tet DMEM / F12-medium med 100 | j, g / ml Hygromycin vid 37 ° C och 5% CO2 kommer att dö inom 1-2 veckor. - Co-transfektera vektorn som uttrycker flippas rekombinas (medierar integrering av LAP-märkta genen av intresse in i FRT-säte inom genomet hos cellen) med LAP-märkta vektorn i HEK293-celler med användning av ett transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar . Använda ett förhållande av 4: 1 av rekombinas-vektor för att LAP vektor 14.
OBS: Det optimala förhållandet är beroende av värdcellinje och metoden för transfektion, och kan kräva en titrering. Ett förhållande av 4: 1 fungerar bra för de flesta cellinjer. Inkluderar en mock-transfekterad platta som en negativ kontroll. - En dag efter transfektion, byt ut -Tet DMEM / F12-medium med färskt medium.
- Två dagar efter transfectipå, dela celler till 25% sammanflödet. Låt cellerna ~ 5 h för att fästa, lägg sedan till Hygromycin-innehållande -Tet DMEM / F12-medium vid koncentrationen förutbestämd i steg 2,2. För HEK293 celler använder 100 mikrogram / ml Hygromycin.
OBS: FRT innehållande HEK293-cellinje innehåller också TetR som är associerad med Blasticidin motstånd, därför 5 mikrogram / ml Blasticidin används under stabil cellinje urvalsprocess för att selektera för TetR och minimera läckande uttryck. - Byt Hygromycin-innehållande -Tet DMEM / F12 media som behövs tills distinkta cell fokus verkar som liknar ogenomskinliga fläckar mot den transparenta plattan.
- Tillsätt 20 | il av trypsin på toppen av varje cell foci och pipettera upp och ned 2 gånger med en 200 | j, l pipettspets. Placera celler i en platta med 24 brunnar och expandera cellerna genom kontinuerlig tillväxt i Hygromycin-innehållande -Tet DMEM / F12-medium.
- Skärm celler för inducerbar LAP-märkta proteinuttryck med fast cell eller live-cell fluorescensmikroskopi och / ellerWestern blotting för GFP taggen i LAP-etiketten 15.
3. Rening av LAP-märkt proteinkomplex
OBS: Följande LAP-märkt protein reningsprotokoll detaljer rekommendationer om villkor och volymer som används för en typisk LAP-märkta proteinrening baseras på tidigare erfarenheter. Dock bör försiktighet iakttas för att säkerställa att empirisk optimering genomförs för varje proteinkomplex och proteinuttryck intresset för att ge bästa resultat.
- Celltillväxt och cell Skörd.
- Expandera den validerade LAP-tagged cellinje för TAP isolering av proteinkomplex, genom att kontinuerligt passage alla HEK293-celler i större plattor och / eller rullflaskor i -Tet DMEM / F12-medium vid 37 ° C och 5% CO2.
- För Tet / Dox inducerbara cellinjer, inducerar efter 10-15 h vid en koncentration av 0,2 | ig / ml Tet / Dox när cellerna når ~ 70% konfluens, innan Harvesting celler.
OBS: Tiden och induktion bör bestämmas för varje protein, är en titrering av 0,1-1 | ig / ml Tet / Dox för 10-15 h rekommenderas. - Harvest celler genom agitation eller trypsinering och pellets celler vid 875 xg under 5-10 min.
- Koppling Anti-GFP antikropp till protein A pärlor
- Använd 40 mikrogram av antikropp för immunprecipitation från ett lysat som framställts från en 0,5 ml cellpellet, packad cellvolym (PCV).
OBS: Mängden antikropp som krävs kommer att bero på det överflöd av LAP-märkt protein, bland andra faktorer, och kommer att kräva optimering. En titrering av 10-40 mikrogram rekommenderas. - Jämvikt 160 il packad volym (PV) Protein A-kulor i PBST (PBS + 0,1% Tween-20) i ett 1,5 ml rör. Tvätta 3 gånger med 1 ml PBST.
NOTERA: Alla tvättar häri utförs genom centrifugering av pärlorna vid 5000 x g under 10 sek. - Resuspendera pärlor i 500 l PBST och tillsätt 80 mikrogram av affinitet-purified kanin-anti-GFP-antikropp till varje rör av 160 | il pärlor. Blanda under 1 h vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta pärlor 2 gånger med 1 ml PBST. Då, tvätta pärlor 2 gånger med 1 ml av 0,2 M natriumborat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumborat + 15 ml 0,2 M borsyra). Efter den slutliga tvätten, tillsätt 900 pl av 0,2 M natriumborat, pH 9 för att bringa den slutliga volymen till 1 ml.
- Tillsätt 100 pl av 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) till en slutkoncentration av 20 mM. Rotera rören försiktigt vid rumstemperatur under 30 min. För 220 mM DMP, suspendera innehållet i en 50 mg flaska i 877 pl 0,2 M natriumborat, pH 9 och lägger omedelbart till pärlsuspensionen.
- Efter inkubering med DMP, tvätta pärlor en gång med 1 ml 0,2 M etanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5 för att inaktivera det kvarvarande tvärbindningsmedel. Återsuspendera pärlorna i 1 ml av samma buffert och rotera under 1 timme vid RT. Pellets pärlor och återsuspendera pärlor i 500 pl 0,2 M etanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5. Pärlorna är stabila under several månader vid 4 ° C.
- Använd 40 mikrogram av antikropp för immunprecipitation från ett lysat som framställts från en 0,5 ml cellpellet, packad cellvolym (PCV).
- Beredning av buffertar för cellys och Complex rening
- Förbered LAPX buffertar (där X är den önskade saltkoncentrationen [mM KCl] av LAP-buffert, 300 mM för cellys, 200 mm för de flesta pärla tvättar, och 100 mm för att tvätta pärlor före eluering proteiner) genom att göra en pH 7,4 lösning innehållande 50 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), X mM KCl, 1 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), 1 mM MgCl2 och 10% glycerol.
OBS: Komponenterna i denna buffert används för att approximera den miljö i levande celler. HEPES används som en buffert i pH raseri 7,2-8,2. KCl är ett salt som används för att bibehålla jonstyrkan i bufferten. EGTA är en kelatbildare som binder kalciumjoner för att minska halterna av kalcium jämfört med magnesium. Glycerol och MgCl2 användes för att förbättra stabiliteten hos proteiner. - Förbereda LAPX N-buffert genom att tillsätta 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol till LAPX bufferten.
OBS: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol är en mild detergent som solubiliserar proteiner, men bevarar protein-proteininteraktioner, sålunda en högre koncentration används under extraktionsprocessen och det sänks sedan under de bindande och tvättstegen.
- Förbered LAPX buffertar (där X är den önskade saltkoncentrationen [mM KCl] av LAP-buffert, 300 mM för cellys, 200 mm för de flesta pärla tvättar, och 100 mm för att tvätta pärlor före eluering proteiner) genom att göra en pH 7,4 lösning innehållande 50 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), X mM KCl, 1 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), 1 mM MgCl2 och 10% glycerol.
- Framställning av cellysat
- Resuspendera 500 l av PCV i 2,5 ml LAP300 med 0,5 mM ditiotreitol (DTT) och proteashämmare. Lägg 90 pl 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% slutlig) och blanda genom inversion.
- Placera på is under 10 min. Centrifugera vid 21.000 xg under 10 minuter. Samla detta låg hastighet supernatanten (LSS). Ta ett prov 10 fil av LSS för gelanalys.
- Överföra LSS till en TLA100.3 rör och centrifugering vid 100.000 xg under 1 h vid 4 ° C. Samla denna höga hastighet supernatanten (HSS), i ett rör och placera på is. Ta ett prov 10 | al av HSS för gelanalys.
OBS: Undvik att ta den översta lipidskiktet end botten mest celldebris skiktet. Lipidskiktet bör tas bort genom vakuumsugning före uppsamling av HSS.
- Första Affinity Capture: Bindning till Anti-GFP Pärlor
- Pre-eluerade antikroppskopplade pärlor (använd 160 | il pärlor per 0,5 ml cellpellet (PCV)) genom att tvätta dem 3 gånger med 1 ml elueringsbuffert [3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4] för att bli av med okopplad antikroppar och minska bakgrunden. Gör snabbt. Lämna inte pärlor i hög salthalt under en lång tid.
- Tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml LAP200 N. Blanda HSS extrahera med pärlor antikropp under 1 h vid 4 ° C. Centrifugera vid 21.000 xg under 10 minuter. Ta ett prov 10 | al av supernatanten (dvs., flödet genom (FT)) för gelanalys.
- Tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT och proteasinhibitorer. Tvätta pärlor 2 gånger (5 min vardera) med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT och proteasinhibitorer. Tvätta snabbt två tIME med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT och inga proteasinhibitorer innan du lägger tobaksetsningsvirus (TEV) proteas.
- TEV Klyvning
- Späd 10 | ig TEV-proteas i 1 ml LAP200 N och rotera rören vid 4 ° C över natten.
Anmärkning: Detta steg kan optimeras för varje LAP-taggat protein som skall fyllas i på några timmar genom att justera koncentrationen av TEV-proteas, som kan underlätta bevarandet av LAP-märkt proteinkomplex. - Pellets pärlor och överföra supernatanten till ett nytt rör. Skölja pärlorna två gånger med 160 | il LAP200 N med 0,5 mM DTT och proteasinhibitorer (trippel koncentration) för att avlägsna eventuellt kvarvarande protein. Ta ett prov av supernatanten för gelanalys 10 | il.
- Späd 10 | ig TEV-proteas i 1 ml LAP200 N och rotera rören vid 4 ° C över natten.
- Andra Affinity Capture: Bindning till S Protein Agarose
- Tvätta en tub av 80 | il S-protein-agaros uppslamning (40 pl packade harts) 3 gånger med 1 ml LAP200 N.
OBS: S protein bindning till S-taggen rekonstruera en aktiv RNas och en alternativ andra epitopmarkör bör övervägas för RNA innehållande proteinkomplex. - Lägg TEV eluerade supernatanten till S-protein agaroskulor och rock under 3 h vid 4 ° C. Pellets pärlor och tvätta 3 gånger med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT och proteasinhibitorer. Tvätta pärlor 2 gånger med 1 ml LAP100.
- Tvätta en tub av 80 | il S-protein-agaros uppslamning (40 pl packade harts) 3 gånger med 1 ml LAP200 N.
- protein Eluering
- Eluera proteiner från S-protein-agaros genom tillsats av 50 | il av 4x Laemmli-provbuffert och värm vid 97 ° C under 10 min.
OBS: Proteiner kan också elueras från pärlorna med elueringsbuffert (3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4).
- Eluera proteiner från S-protein-agaros genom tillsats av 50 | il av 4x Laemmli-provbuffert och värm vid 97 ° C under 10 min.
4. Identifiera interagerande proteiner med masspektrometri Analys
- Testa kvaliteten på reningen genom att analysera de insamlade proven genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), silverfärgning av gelén (se
- Att identifiera stökiometriska och understökiometriska co-rening arter, ta det slutliga elueringen provet och separera den genom SDS-PAGE. Färga gelén med en masspektrometri kompatibel protein fläck. Skära de mest framstående band och utrymmet mellan dem från gelén och bearbeta dem för analys med masspektrometri separat 16.
OBS: Det finns många metoder för att separera den slutliga reningen eluaten och förbereda dem för masspektrometri 5. Till exempel, kan komplexen LAP renade elueras från S-protein-pärlor genom användning av hög salthalt (3,5 M MgCl2) och hela proteinpopulationen en masse kan analyseras genom masspektrometri 17. Alternativt kan slut eluat separeras för en mm genom SDS-PAGE och en enda 1 mm band kan vara excised och analyseras. Detta raderar den komplexa blandning av några pärlor eller partiklar som kommer att interferera med analysen.
Representative Results
För att belysa användbarheten av detta system, var den öppna läsramen (ORF) av Tau mikrotubuli-bindande protein klonades in i skyttelvektorn genom amplifiering av Tau ORF med primrar innehållande attB1 och attB2-ställen (tabell 1) och inkubering av PCR-produkter med den skyttelvektor och ett rekombinas som medierar insättning av PCR-produkter in i skyttelvektorn. Reaktionsprodukterna användes för att trans DH5a-bakterier 13 och plasmid-DNA från Kanamycinresistenta kolonier sekvenserades för att säkerställa Tau införing. En sekvens validerad shuttle-Tau vektorn användes sedan för att överföra Tau ORF in i pGLAP1 vektor, vilken sammansmält Tau i ram med LAP (EGFP-TEV-S-protein) tag, genom inkubering skytteln-Tau vektorn med pGLAP1 vektorn och rekombinas som förmedlar överföringen av ORF från skyttelvektorn till pGLAP1. Reaktionsprodukterna användes för att transformera DH5a bakterier13 och plasmid-DNA från ampicillinresistenta kolonier sekvenserades för att säkerställa att den LAP-Tau-fusions var i ram. Sekvens validerade pGLAP1-LAP-Tau ades sedan samtransfekteras med en vektor som uttrycker flippas rekombination enzymet i HEK293-celler som innehöll en enda flippas igenkännings mål (FRT) site inom deras genom, som är platsen för integrationen för LAP-taggade gener 14. Denna cellinje uttryckte också TetR som binder till Tet operatörer uppströms om LAP-märkta gener och tystar deras uttryck i frånvaro av Tet / Dox. Stabila integranter selekterades med -Tet DMEM / F12-medium med 100 | j, g / ml Hygromycin i 5 dagar. Individuella hygromycin resistenta cell foci skördades genom tillsats av 20 | il av trypsin på topp och pipettera upp och ned 2 gånger. Cellerna placerades i en 24-brunnsplatta och expanderas genom kontinuerlig tillväxt i -Tet DMEM / F12-medium.
För att verifiera att Hygromycin resistenta cells var i stånd att uttrycka LAP-Tau, var HEK293 LAP-Tau-celler inducerades med 0,1 | j, g / ml Dox under 15 timmar och proteinextrakt framställdes från icke-inducerade och Dox-inducerade celler. Dessa extrakt separerades med SDS-PAGE, överfördes till ett PVDF-membran, och immunblott för GFP och tubulin som laddningskontroll. Såsom framgår av fig 4A, LAP-Tau (visualiseras med anti-GFP-antikroppar) var endast uttrycks i närvaro av Dox. Att validera att LAP-Tau var korrekt lokaliserad till mitotiska mikrotubuli spindel under mitos, som hade tidigare visats för endogen Tau 18, var HEK293 LAP-Tau celler inducerade med 0,1 mikrogram / ml Dox under 15 timmar och cellerna fixerades med 4% paraformaldehyd och co-färgades för DNA (Hoechst 33342) och mikrotubuli (anti-tubulin antikroppar). Konsekvent, var LAP-Tau lokaliserad till den mitotiska spolen under metafas av mitos (figur 4B). För att verifiera att LAP-Tau och dess interagerande proteiner kan renas med detta system, HEK293 LAP-Tau-celler odlades i rullflaskor till ~ 70% konfluens, inducerades med 0,1 | j, g / ml Dox i 15 h, skördades genom omrörning, lyserades med LAP300-buffert, och LAP-Tau renades med användning av ovanstående protokoll. Eluaten från LAP-Tau rening upplöstes genom SDS-PAGE och gelén silverfärgades. Figur 4C visar den LAP-Tau rening, markerade med en asterisk är LAP-Tau och flera andra band som indikerar Tau interagerande proteiner kan ses.
Figur 1: Översikt över Generation av LAP-märkta Inducerbara stabila cellinjer för varje protein av intresse. Den öppna läsramen (ORF) av gener av intresse amplifieras med attB1 och attB2 ställen som flankerar 5 'och 3' ändsekvensema, respektive (primersekvenser ges i Tabell 1) och klonas in i skyttelvektorn. Sekvensverifierades skyttelvektorer med genen av intresse används sedan för att överföra genen av intresse in i pGLAP1 vektorn. Sekvensen verifierades pGLAP1 vektorn med genen av intresse är samtransfekterades sedan med vektorn som innehåller den flippas rekombinas till den önskade cellinje som innehåller en enda flippas igenkännings mål (FRT) site inom deras genom, som är platsen för integrationen för LAP -märkt gener. Dessa cellinjer uttrycker också Tet-repressorn (TetR) som binder till Tet operatörer (TetO 2) uppströms om LAP-märkta gener och tystar deras uttryck i frånvaro av Tet / Dox. LAP-märkta genen av intresse därefter rekombineras in i FRT-säte och stabila integranter väljs med hygromycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2 "src =" / filer / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Figur 2: Översikt över ansökningar om LAP-märkta stabila cellinjer. LAP-taggade inducerbara stabila cellinjer induceras för att uttrycka LAP-märkt protein av intresse genom Dox tillsats och kan synkroniseras i olika stadier av cellcykeln eller kan stimuleras med kemikalier eller ligander för att aktivera vilken som helst önskad signaleringsvägen. Subcellulära lokalisering av den LAP-taggade protein av intresse kan analyseras med levande cell eller fast cell imaging. LAP-märkta proteiner kan också vara tandem affinitetsrenad och deras interagerande proteiner kan identifieras genom vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS). Slutligen kan Cytoscape användas för att generera ett protein-proteininteraktion nätverk av betet proteinet. Dox visar doxycyklin, IP indikerar immunoprecipitat, EGFP indikerar förbättrade grönt fluorescerande protein, Tev indikerar TEV proteas klyvningsställe, och S anger S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Översikt över LAP-märkt Protein Expression, Purification och förberedelse för masspektrometri. Protokollet har 9 steg: 1) tillväxt och induktion av LAP-märkta proteinuttryck, 2) cell skörd och lys, 3) förberedelse av lysat, 4) bindning av lysat till anti-GFP pärlor, 5) TEV proteas klyvning av GFP-taggen, 6) bindning av lysat till S-protein pärlor, 7) eluering av betet protein och interagerande proteiner, och 8-9) beredning av prover för masspektrometri-baserad proteomik analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4: Kontroll av LAP-Tau-expression. (A) Western blot (WB) analys av proteinprover från icke-inducerade och Dox inducerad LAP-Tau HEK293-celler sonderades med anti-GFP-och anti-tubulin-antikroppar för att detektera LAP-taggade Tau-protein och tubulin laddningskontroll, respektive. Notera att LAP-Tau uttrycks endast när cellerna inducerades med Dox. (B) Mitotiska celler som uttrycker LAP-Tau fixerades och co-färgades för DNA (Hoechst 33342) och tubulin (Tub) med anti-tubulin-antikroppar och subcellulära lokalisering av LAP-tau analyserades genom fluorescens microcopy. Observera att LAP-Tau lokaliseras till de mitotiska spindel och spindel stolpar under mitos. (C) Silver färgad gel av LAP-Tau rening. MW indikerar molekylvikt, CL indikerar rensas lysat, och E indicrar slutliga eluat. Prover kördes på en 4-20% SDS-PAGE och gelén silverfärgades för att visualisera de renade proteinerna. Notera att ett band motsvarande LAP-Tau är markerad med en asterisk och flera andra band som motsvarar samar rening av proteiner kan ses. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| N-terminal fusion | |
| Framåt | 5'GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 ' |
| Omvänd | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 ' |
| C-terminal fusion | |
| Framåt | 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 ' |
| Omvänd | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 ' |
Tabell 1: Framåt och bakåt Primers för att förstärka ORF eller Intresset för Insättning i skyttelvektorn. AttB-ställena är markerade med fet stil betecknar GSN att mer än 18 genspecifika nukleotider läggs till primern.
| Steg | Temperatur | Tid | |
| initial denaturering | 94 ° C | 2 min | |
| PCR amplifieringscykler (35) | Denaturera | 94 ° C | 30 sek |
| Glödga | 55 ° C (beroende på primern Tm) | 30 sek | |
| Förlänga | 72 ° C | 1 min / kb | |
| Håll | 4 ° C | obegränsat | |
Tabell 2: PCR-betingelser för amplifiering av ORF av intresse.
| Vektor | Forward sekvenseringsprimer | Omvänd sekvenseringsprimer |
| skyttelvektor | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
Tabell 3: framåt och bakåt sekvenseringsprimrar för skyttelvektorn.
| ID | Strukturera | Parental | Promotor | bac Res | Mam Res | Tet reg? |
| pGLAP1 | N-term EGFP-TEV-S-peptiden | pcDNA5 / FRT / TILL | CMV | amp | hyg | Ja |
| pGLAP2 | N-term Flag-TEV-S-peptiden | pcDNA5 / FRT / TILL | CMV | amp | hyg | Ja |
| pGLAP3 | N-term EGFP-TEV-S-peptid; C-term V5 | PEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | hyg | Nej |
| pGLAP4 | N-term Flag-TEV-S-peptid; ; C-term V5 | PEF5 / FRT-V5 | EF1a | hyg | Nej | |
| pGLAP5 | C-term S-peptid-PreProt x2-EGFP | PEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | hyg | Nej |
Tabell 4: Lista över tillgängliga LAP / TAP vektorer med variabla Promotorer epitop-taggar och Dox inducerbart uttryck resurser för N eller C-terminal protein märkning. Vektorer är kommersiellt tillgängliga. Bac Res indikerar resistensmarkör, Mam Res indikerar däggdjursceller resistensmarkör, Tet reg? anger om uttrycket är Tet / Dox reglerbar.
| Vektor | Forward sekvenseringsprimer | Omvänd sekvenseringsprimer |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
Tabell 5: framåt och bakåt sekvenseringsprimrama för pGLAP vektorer.
Discussion
Den skisserade protokoll beskriver kloningen av gener av intresse in i LAP-tagging vektor, generering av inducerbara LAP-taggade stabila cellinjer, och rening av LAP-märkt proteinkomplex för proteomik analyser. När det gäller andra LAP / TAP-märkning metoder, har detta protokoll effektiviserats för att vara kompatibel med hög genomströmning metoder för att kartlägga proteinlokaliserings och protein-proteininteraktioner inom någon cellulär väg. Detta tillvägagångssätt har i stor utsträckning till den funktionella karakteriseringen av proteiner kritiska för cellcykelprogression, mitotiska spindelenhet, spindel pol homeostas, och ciliogenesis för att nämna några och har hjälpt att förstå hur felaktig reglering av dessa proteiner kan leda till sjukdomar hos människor 15, 16,19,20. Till exempel, vår grupp nyligen utnyttjade detta system för att definiera funktionen och reglering av STARD9 mitotiska kinesin (en kandidat cancer mål) i spindelenheten 15,21, för att definiera ennytt molekylärt samband mellan Tctex1d2 dynein lätta kedjan och korta revben Polydactyly syndrom (SRP: n) 19, och att definiera en ny molekylär länk för att förstå hur mutation av Mid2 ubiquitin ligas kan leda till X-bundna intellektuella funktionsnedsättningar 16. Andra laboratorier har också framgångsrikt tillämpat denna metod, inklusive en som fastställt att Tctn1, en regulator av mus Hedgehog-signalering, var en del av en ciliopathy associerade proteinkomplex som reglerade ciliär membransammansättningen och ciliogenesis i en vävnadsberoende sätt 22,23. Därför kan detta protokoll tillämpas i stort sett dissektion av någon cellulär väg.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är valet av LAP-märkta stabila cellinjer som är Hygromycin resistenta. Särskild försiktighet bör vidtas för att säkerställa att alla celler i kontrollplattan är död innan du väljer fokus i den experimentella plattan för förstärkning. Hygromycin kan också added under rutin cellodling av LAP-märkta stabil cellinjer att ytterligare säkerställa att alla celler upprätthålla LAP-märkta genen av intresse vid FRT platsen. Vi varnar för att inte alla LAP-märkta proteiner kommer att vara funktionella och att det är viktigt att ha analyser på plats som kan användas för att testa proteiners funktion. Exempel på analyser används för att testa proteiners funktion inkluderar räddningen av siRNA-inducerad fenotyper och in vitro aktivitetsanalyser. För att hantera eventuella potentiella problem med tillsats av en stor LAP-tag, har vi tidigare genererat TAP-tag vektorer som är kompatibla med detta system som innehåller mindre taggar, såsom FLAG, som är mindre benägna att inhibera funktionen och lokaliseringen av proteinet av intresse 4. Dessutom finns det LAP märkning vektorer för generering av C-terminal LAP-märkta proteiner eller C-terminala TAP-taggade proteiner som är kompatibla med detta system, som kan användas i de fall där en LAP / TAP taggen inte tolereras vid N -terminalen av ett protein. Dessutom, the salt och tvättmedel koncentrationer av reningsbuffertar (LAPX N) kan modifieras för att öka eller minska renings stringens om ingen eller alltför många interaktioner observerats. På liknande sätt är strängare än enda reningsprocedurer och svaga Interactmedlemmar kan förloras tandem affinitetsreningsförfarande, således en enda reningsschema kan användas när några eller inga Interactmedlemmar identifieras.
Det är viktigt att notera att andra GFP epitop taggning metoder finns som tillåter storskalig GFP protein märkning för protein lokalisering och reningsstudier 24,25. Dessa inkluderar BAC TransgenOmics strategi som utnyttjar bakteriella artificiella kromosomer att uttrycka GFP-märkta gener av intresse från sin ursprungliga miljö som innehåller alla de regulatoriska elementen, som efterliknar endogena genuttryck 24. På senare tid har CAS9 / single-guided RNA (sgRNA) ribonukleoprotein-komplex (RNP) använts för att avslutaogenously märka gener av intresse med en delad GFP system som tillåter uttryck av GFP-märkta gener från sin endogena genomiska loci 25. Även om båda dessa tillvägagångssätt möjliggöra expression av märkta proteiner under endogena förhållanden, jämfört med LAP-märkningsprotokoll som beskrivs här, tillåter de inte för inducerbar och avstämbar expression av de taggade gener av intresse. Dessutom har de ännu inte tillämpas på tandem epitop märkning för TAP. Det är också viktigt att notera att andra taggsystem också kan modifieras för att bli kompatibel med det system som beskrivs här för att generera inducerbara epitopmärkta stabila cellinjer. Till exempel har närhet beroende biotin identifiering (BioID) rönt stor uppmärksamhet på grund av dess förmåga att definiera rumsliga och tidsmässiga relationer mellan interagerande proteiner 26. Denna teknik utnyttjar proteinfusioner till en promiskuös stam av Escherichia coli biotin-ligas BirA som biotinyleras varje protein i en ~ 10 nm radie av enzymet. De biotinylerade proteinerna är därefter affinitetsrenas med användning av biotin-affinitetsinfångning och analyserades beträffande sammansättningen med masspektrometri. BirA kommer biotinylera något protein i omedelbar närhet, till och med övergående, vilket gör den särskilt lämpad för att detektera svagare interagerande partners i en komplex 27. Dessutom gör reningsschemat inte nödvändigt att endogena protein-proteininteraktioner förbli intakt och kan utföras under denatureringsbetingelser, vilket minskar graden av falsklarm. Inom vår nuvarande protokollet, skulle ersättas av pGLAP1 vektorn genom en BirA-märkning vektor omvandla detta system från att identifiera protein-proteininteraktioner baseras på affinitet till att upptäcka dem bygger på närhet. Ett sådant system skulle vara mycket fördelaktigt för att detektera transienta proteininteraktioner som är fallet mellan många enzymsubstratinteraktioner och för att kartlägga Spatiotemporal protein-protein Interactions inom definierade strukturer som har genomförts för centrosom och cilier 26,28.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
- Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
- LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
- ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
- Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
- Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
- Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
- Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
- Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
- Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
- Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
- Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
- Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
- Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
- Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
- Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
- Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
- Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
- Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
