Protocol
MERK: En oversikt over genereringen av induserbare LAP-merket stabile cellelinjer for hvilket som helst protein av interesse er illustrert i figur 1, og oversikten over LAP-merket protein ekspresjon, rensing og klargjøring for masse proteomikk analyser er vist i figur 3.
1. Kloning den åpne leseramme (ORF) av genet av interesse i den LAP-tag Vector
- Kloning av ORF for genet av interesse inn i Shuttle vektor.
- Bruke polymerase kjedereaksjon (PCR) for å amplifisere ORF av interesse med de passende attB1 og attB2 områder innenfor primere for enten N-terminal fusjon eller C-terminal fusjon. Se tabell 1 for primersekvenser og tabell 2 for PCR-betingelser.
- Gelen renser PCR produktene ved å løse dem på en 1% agarosegel. Eksisere forsterket band som er riktig størrelse fra gelen og trekke det fra gelen skive ved hjelp av en DNA-gel utvinning kit i henhold til produsentens anvisninger.
- Inkuber renset attB inneholder PCR-produkter med en attP inneholder shuttle vektor og rekombinase som gjør PCR produktene til rekombinerer i vektoren som per produsentens instruksjoner (se M aterials tabell).
MERK: Tomme shuttle vektorer og LAP-tagging vektorer inneholde ccd B genet og må spres i CCD B resistente bakterieceller (se Materialer tabell). Men CCDB genet blir rekombinert ut når en ORF settes inn i disse vektorer, og dermed bruke standard DH5a E. coli-celler når det forplanter seg vektorer med klonet ORF. - Transformere DH5a E. coli-celler med 1 pl av reaksjonsproduktet og porsjon de transformerte celler på et Luria-buljong (LB) agar-plate med 50 mg / ml Kanamycin 13.
- Velg kanamycin resistente kolonier.
- Grow de utvalgte kolonier i LB megdia med 50 mg / ml kanamycin, foreta en DNA mini-prep og bekreft gen integrering av DNA-sekvensering ved hjelp av sekvenseringsprimere er oppført i tabell 3.
- Overføre genet av interesse fra Shuttle Vector inn i LAP-tag Vector.
- Inkuber shuttle vektor som inneholder sekvensen verifisert genet av interesse ORF med LAP-tag vektor (pGLAP1 for N-terminal fusjon) og rekombinase som formidler overføring av genet av interesse fra romfergen vektoren inn i LAP-tag vektor som per produsentens instruksjoner (se Materials).
MERK: En rekke LAP / TAP vektorer som kan brukes basert på ønsket arrangøren, epitop-tag, og N eller C-terminal merking kan finnes i tabell 4. - Transformere DH5a E. coli-celler med 1 pl av reaksjonsproduktet og porsjon de transformerte celler på en LB-agarplate med 100 mg / ml Ampicillin 13.
- Velge den Ampicillin resistente coloskapene.
- Dyrke utvalgte kolonier på LB-medium med 100 mg / ml Ampicillin, foreta en DNA mini-prep, og bekreft gen integrering av DNA-sekvensering ved hjelp av sekvenseringsprimere er oppført i tabell 5.
- Inkuber shuttle vektor som inneholder sekvensen verifisert genet av interesse ORF med LAP-tag vektor (pGLAP1 for N-terminal fusjon) og rekombinase som formidler overføring av genet av interesse fra romfergen vektoren inn i LAP-tag vektor som per produsentens instruksjoner (se Materials).
2. Generering av en induserbar stabile cellelinje som uttrykker LAP-merket Gene Interesse
- Velg cellelinje best egnet for prosjektet er av interesse. Alternativt kan skape en vertscellelinje fra en hvilken som helst eksisterende cellelinje som konstitutivt uttrykker tetra og inneholder et område som tillater FRT LAP-merkede genet av interesse å bli stabilt integrert i genomet (se Materials).
MERK: Denne protokollen bruker en HEK293-cellelinje som inneholder tetR og en FRT området, som er dyrket i -Tet DMEM / F12 media [tatt opp med 10% føtalt bovint serum (FBS), som er blottet for Tetracycline (-Tet)] 4 . - Bestem den minimale konsentrasjon av Hygromycin kreves for å drepe vertscellelinjen i løpet av 1 til 2 tissks etter narkotika tillegg. Konsentrasjonen kan variere mellom vertscellelinjer, med mest varierende mellom 100 pg / ml og 800 ug / ml.
MERK: HEK293 celler dyrket i -Tet DMEM / F12 medium med 100 ug / ml Hygromycin ved 37 ° C og 5% CO2 vil dø i løpet av 1-2 uker. - Co-transfektere vektoren som uttrykker flippase recombinase (formidler integrering av LAP-merket genet inn i FRT nettsted innen genomet av cellen) med LAP-merket vektor i HEK293 celler ved hjelp av en transfeksjon reagens som per produsentens instruksjoner . Bruker et forhold på 4: 1 av rekombinase vektor til LAP vektor 14.
MERK: Det optimale forholdet er avhengig av vertscellelinje og fremgangsmåte for transfeksjon, og kan kreve en titrering. Et forhold på 4: 1 fungerer godt for de fleste cellelinjer. Inkluder en mock-transfektert plate som en negativ kontroll. - En dag etter transfeksjon, erstatte -Tet DMEM / F12 media med friske media.
- To dager etter transfectipå, dele celler til 25% samløpet. Tillat celler ~ 5 timer for å feste, og deretter legge Hygromycin holdig -Tet DMEM / F12 media på konsentrasjonen bestemt i trinn 2.2. For HEK293 celler bruke 100 ug / ml Hygromycin.
MERK: FRT innehold HEK293-cellelinje inneholder også tetR som er forbundet med Blasticidin motstand, og derfor 5 ug / ml Blasticidin brukes under stabil cellelinje utvelgelsesprosess for å velge for Tetr, og for å minimalisere utett uttrykk. - Bytt Hygromycin holdig -Tet DMEM / F12 media etter behov til forskjellige celle foci virke som ligner ugjennomsiktig flekker mot den gjennomsiktige platen.
- Tilsett 20 ul av trypsin på toppen av hver celle foci og pipetter opp og ned 2 ganger med 200 ul pipettespiss. Plasser cellene i en 24 brønners plate og utvide cellene ved kontinuerlig vekst i Hygromycin holdig -Tet DMEM / F12 media.
- Skjerm celler for induserbar LAP-tagget protein uttrykk av fast-celle eller lever-celle fluorescens mikroskopi og / ellerWestern blotting for GFP tag i LAP-tag 15.
3. Rensing av LAP-merket protein komplekser
MERK: Følgende LAP-tagget protein rensing protokoll detaljer anbefalinger om forhold og volumer som brukes for en typisk LAP-tagget protein rensing basert på tidligere erfaring. Imidlertid bør det utvises forsiktighet for å sikre at empirisk optimalisering utføres for alle protein kompleks og protein uttrykk nivå av interesse å gi de beste resultatene.
- Cellevekst og celle høsting.
- Utvid validert LAP-merket cellelinje for TAP isolasjon av protein komplekser, ved stadig aging alle HEK293 celler i større plater og / eller rulleflasker i -Tet DMEM / F12 media ved 37 ° C og 5% CO 2.
- For Tet / Dox induserbar cellelinjer, induserer i 10-15 timer ved en konsentrasjon på 0,2 ug / ml Tet / Dox når cellene når ~ 70% konfluens, før harvesting celler.
MERK: konsentrasjon og induksjonstiden bør bestemmes for hver enkelt protein, blir en titrering av 0,1-1 pg / ml Tet / Dox i 10-15 timer anbefalt. - Høste celler ved omrøring eller trypsinering og pellets cellene ved 875 xg i 5-10 min.
- Kopling Anti-GFP antistoff til protein A Perler
- Bruk 40 ug antistoff for immunopresipitering fra et lysat fremstilt fra en 0,5 ml cellepellet, pakket cellevolum (PCV).
MERK: Mengden av antistoff som trengs vil avhenge av overflod av LAP-tagget protein, blant andre faktorer, og vil kreve optimalisering. En titrering av 10-40 ug anbefales. - Ekvilibrere 160 pl pakket volum (PV) Protein A-kuler inn i PBST (PBS + 0,1% Tween-20) i et 1,5 ml rør. Vask 3 ganger med 1 ml PBST.
MERK: Alle vasker heri utføres ved sentrifugering perlene ved 5000 xg i 10 sek. - Resuspender perler i 500 ul PBST og legge 80 mikrogram av tilhørighet-purified kanin anti-GFP-antistoff til hvert rør 160 pl perler. Bland i 1 time ved romtemperatur (RT).
- Vask kulene 2 ganger med 1 ml PBST. Deretter vaskes kulene 2 ganger med 1 ml 0,2 M natriumborat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumborat + 15 ml 0,2 M borsyre). Etter den siste vask, tilsett 900 ul av 0,2 M natriumborat, pH 9 for å bringe det endelige volum til 1 ml.
- Tilsett 100 ul av 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Rotere rørene forsiktig ved romtemperatur i 30 minutter. For 220 mM DMP, resuspender innholdet i en flaske 50 mg i 877 ul 0,2 M natriumborat, pH 9 og tilsett umiddelbart til perlesuspensjon.
- Etter inkubasjon med DMP, vaske perlene en gang med 1 ml 0,2 M etanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5 for å inaktivere det gjenværende tverrbindingsmiddel. Resuspender perler i 1 ml av den samme buffer og rotere i 1 time ved RT. Pellet perler og resuspender perler i 500 mL av 0,2 M etanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5. Perler er stabil for Several måneder ved 4 ° C.
- Bruk 40 ug antistoff for immunopresipitering fra et lysat fremstilt fra en 0,5 ml cellepellet, pakket cellevolum (PCV).
- Utarbeidelse av buffere for cellelysering og Complex Rensing
- Forbered LAPX buffere (hvor X er den ønskede saltkonsentrasjonen [mM KCl] av LAP-buffer; 300 mM for cellelyse, 200 mM for de fleste perle vaskinger, og 100 mM for å vaske perlene før eluering proteiner) ved å lage en pH 7,4 oppløsning inneholdende 50 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), X mM KCl, 1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA), 1 mM MgCl2, og 10% glycerol.
MERK: Komponentene i denne buffer blir anvendt for å tilnærme miljøet i levende celler. HEPES brukes som en buffer i pH-raseri av 7,2-8,2. KCl er et salt som brukes for å opprettholde ionestyrken av bufferen. EGTA er et chelaterende middel som binder kalsiumioner for å redusere nivåene av kalsium i forhold til magnesium. Glycerol og MgCl2 brukes til å forbedre stabiliteten av proteiner. - Forbered LAPX N buffer ved å legge til 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol til LAPX buffer.
MERK: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol er et mildt vaskemiddel som solubiliserer proteiner, men bevarer protein-protein interaksjoner, og dermed en høyere konsentrasjon brukes under utpakkingen og det er da senket under bindende og vasketrinn.
- Forbered LAPX buffere (hvor X er den ønskede saltkonsentrasjonen [mM KCl] av LAP-buffer; 300 mM for cellelyse, 200 mM for de fleste perle vaskinger, og 100 mM for å vaske perlene før eluering proteiner) ved å lage en pH 7,4 oppløsning inneholdende 50 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), X mM KCl, 1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA), 1 mM MgCl2, og 10% glycerol.
- Utarbeidelse av cellelysater
- Suspender 500 mL av PCV inn 2,5 ml LAP300 med 0,5 mM ditiotreitol (DTT) og proteasehemmere. Legg 90 mL av 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% endelig) og bland ved å snu opp.
- Plasser på is i 10 min. Sentrifuger ved 21000 x g i 10 min. Samle denne lav hastighet supernatant (LSS). Ta en 10 mL prøve av LSS for gel analyse.
- Overfør LSS til en TLA100.3 rør og spinn på 100 000 xg i 1 time ved 4 ° C. Samle denne høyhastighets supernatant (HSS), i et rør og legg på is. Ta en 10 mL prøve av HSS for gel analyse.
MERK: Unngå å ta den øverste lipid laget end den nederste celleavfall lag. Lipidlaget skal fjernes ved vakuum aspirasjon før oppsamling av det HSS.
- Først Affinity Capture: Bindingen til Anti-GFP Perler
- Forhånds eluere antistoff koplet kuler (bruke 160 pl av perler per 0,5 ml cellepellet (PCV)) ved å vaske dem 3 ganger med 1 ml elueringsbuffer [3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4] for å kvitte seg med ukoblet antistoffer og redusere bakgrunn. Gjør raskt. Ikke la perler i høy salt i lang tid.
- Vask perler 3 ganger med 1 ml LAP200 N. Bland HSS ekstraher med antistoffkuler i 1 time ved 4 ° C. Sentrifuger ved 21000 x g i 10 min. Ta en 10 pl prøve av supernatanten (dvs. strømningen gjennom (FT)) for gelanalyse.
- Vask kulene 3 ganger med 1 ml av LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteaseinhibitorer. Vask kulene 2 ganger (5 min hver) med 1 ml av LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteaseinhibitorer. Vask raskt to tIME med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT og ingen proteasehemmere før du legger tobakksetse virus (TEV) protease.
- TEV Cleavage
- Fortynne 10 mikrogram TEV protease i 1 ml LAP200 N og rotere rørene ved 4 ° C over natten.
MERK: Dette trinnet kan være optimalisert for alle LAP-tagget protein skal være ferdig i løpet av få timer ved å justere konsentrasjonen av TEV protease, som kan hjelpe til bevaring av LAP-tagget protein komplekser. - Pellet perler og overføre supernatant til et nytt rør. Skyll perler to ganger med 160 ul LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteasehemmere (trippel konsentrasjon) for å fjerne eventuelt gjenværende protein. Ta en 10 pl prøve av supernatanten for gelanalyse.
- Fortynne 10 mikrogram TEV protease i 1 ml LAP200 N og rotere rørene ved 4 ° C over natten.
- Second Affinity Capture: Binding til S Protein Agarose
- Vask en tube med 80 ul S-protein agarose slurry (40 pl pakket harpiks) 3 ganger med 1 ml av LAP200 N.
MERK: S protein binding til S-tag vil rekonstituere en aktiv RNase og en alternativ andre epitop tag bør vurderes for RNA inneholder protein komplekser. - Legg TEV elueres supernatanten til S protein agarose perler og stein i 3 timer ved 4 ° C. Pellet perler og vasker 3 ganger med 1 ml av LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteaseinhibitorer. Vask kulene 2 ganger med 1 ml LAP100.
- Vask en tube med 80 ul S-protein agarose slurry (40 pl pakket harpiks) 3 ganger med 1 ml av LAP200 N.
- protein Elution
- Eluere proteiner av S-proteinet agarose ved tilsetning av 50 ul 4 x Laemmli-prøvebuffer og oppvarm til 97 ° C i 10 min.
MERK: Proteiner kan også elueres fra kulene med elueringsbuffer (3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4).
- Eluere proteiner av S-proteinet agarose ved tilsetning av 50 ul 4 x Laemmli-prøvebuffer og oppvarm til 97 ° C i 10 min.
4. Identifisere samspill proteiner ved massespektrometri Analyse
- Teste kvaliteten på rensingen ved å analysere de innsamlede prøvene av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE), sølvfarging av gelen (se
- Å identifisere støkiometriske og støkiometriske co-rensende arter, ta den endelige eluering prøven og skille den ved SDS-PAGE. Flekk gelen med en massespektrometri kompatibel protein flekken. Skjære de mest fremtredende band og plassen mellom dem fra gelen og behandle dem for analyse av massespektrometri separat 16.
MERK: Det er mange tilnærminger for å skille den endelige rensing eluatene og forberede dem for massespektrometri 5. For eksempel kan LAP-rensede komplekser bli eluert fra S-protein-perlene ved hjelp av høyt saltinnhold (3,5 M MgCl2) og hele proteinet populasjonen en masse kan analyseres ved massespektrometri 17. Alternativt kan slutt eluatene separeres i 1 mm ved hjelp av SDS-PAGE og en enkelt 1 mm bånd kan være excised og analysert. Dette fjerner den komplekse blanding av eventuelle perler eller partikler som vil interferere med analysen.
Representative Results
For å fremheve nytten av dette systemet, ble den åpne leseramme (ORF) av Tau microtubule bindende protein klonet inn i shuttle-vektoren ved å forsterke den Tau ORF med primere som inneholder attB1 og attB2 sider (tabell 1), og inkubering av PCR-produkter med den shuttle-vektoren og en rekombinase som medierer innsetting av PCR-produktene inn i shuttle-vektoren. Reaksjonsproduktene ble brukt til å transformere DH5a bakterier 13 og plasmid-DNA fra kanamycin-resistente kolonier ble sekvensert for å sikre Tau innsetting. En sekvens validert shuttle-Tau vektor ble så brukt til å overføre Tau ORF inn i pGLAP1 vektor, som smeltet Tau i ramme med LAP (EGFP-TEV-S-Protein) tag, ved inkubasjon shuttle-Tau vektor med pGLAP1 vektor og rekombinase som formidler overføringen av ORF fra shuttle vektoren til pGLAP1. Reaksjonsproduktene ble brukt til å transformere DH5a bakterier13 og plasmid-DNA fra Ampicillin-resistente kolonier ble sekvensert for å sikre at LAP-Tau fusjon var i ramme. Sequence validert pGLAP1-LAP-Tau ble deretter co-transfektert med en vektor som uttrykker flippase rekombinasjon enzymet inn HEK293 celler som inneholdt en enkelt flippase anerkjennelse mål (FRT) område innenfor sitt genom, som er stedet for integrasjon for LAP-merket gener 14. Denne cellelinjen også uttrykte tetra som binder seg til Tet operatører oppstrøms av LAP-merket gener og stiller sitt uttrykk i fravær av Tet / Dox. Stabile integranter ble valgt med -Tet DMEM / F12 medium med 100 ug / ml Hygromycin i 5 dager. Individuelle hygromycin-resistente celle foci ble innhøstet ved å tilsette 20 ul av trypsin på toppen og pipettering opp og ned 2 ganger. Celler ble anbrakt i en 24 brønn plate og ekspanderes ved kontinuerlig vekst i -Tet DMEM / F12 media.
For å kontrollere at Hygromycin resistente celles var i stand til å uttrykke LAP-Tau, HEK293 LAP-Tau celler ble indusert med 0,1 mikrogram / ml Dox for 15 hr og proteinekstrakter ble fremstilt fra ikke-indusert og Dox-induserte celler. Disse ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE, overført til en PVDF-membran, og immunoblottet for GFP og Tubulin som lasting kontroll. Som vist i figur 4A, LAP-Tau (visualisert med anti-antistoffer GFP) ble bare uttrykt i nærvær av Dox. For å bekrefte at LAP-Tau ble riktig lokalisert til mitotiske mikrotubuli spindel under mitose, som hadde vært tidligere vist for endogen Tau 18, ble HEK293 LAP-Tau celler indusert med 0,1 mikrogram / ml Dox i 15 timer og cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyde og co-farget for DNA (Hoechst 33342) og mikrotubuli (anti-Tubulin antistoffer). Konsekvent ble LAP-Tau lokalisert til mitotisk spindel under metafase av mitose (figur 4B). For å kontrollere at LAP-Tau og dets samspill proteiner kunne renses med dette sysTEM, HEK293 LAP-Tau-celler ble dyrket i rulleflasker til ~ 70% konfluens, indusert med 0,1 ug / ml Dox i 15 timer, høstet ved omrøring, lysert med LAP300 buffer, og LAP-Tau ble renset ved hjelp av ovennevnte protokoll. Eluatene fra LAP-Tau rensing ble løst ved SDS-PAGE og gelen ble sølv farget. Figur 4C viser LAP-Tau rensing, merket med en stjerne er LAP-Tau og flere andre band indikasjon på Tau samspill proteiner kan sees.
Figur 1: Oversikt over Generation of LAP-merket induserbare stabile cellelinjer for ethvert protein av interesse. Den åpne leseramme (ORF) av gener av interesse er forsterket med attB1 og attB2 områder som flankerer 5'- og 3'-endesekvenser, henholdsvis (primersekvenser er gitt i Tabell 1) og klonet inn i shuttle vektoren. Sekvens verifisert shuttle vektorer med genet av interesse blir så brukt til å overføre genet av interesse inn i pGLAP1 vektoren. Sekvensen bekreftet pGLAP1 vektor med genet av interesse er deretter ko-transfektert med vektoren som inneholder den flippase rekombinase til den ønskede cellelinje som inneholder et enkelt flippase erkjennelse målet (FRT) område innenfor sitt genom, som er integrasjonssetet for LAP -tagged gener. Disse cellelinjene også uttrykke Tet repressor (tetra) som binder seg til Tet operatører (Teto 2) oppstrøms av LAP-merket gener og stiller sitt uttrykk i fravær av Tet / Dox. Den LAP-merket gen av interesse blir deretter saman inn i FRT nettstedet og stabile integranter er valgt med Hygromycin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Figur 2: Oversikt over Søknader om LAP-merket stabile cellelinjer. LAP-merket induserbare stabile cellelinjer blir indusert for å uttrykke den LAP-merket protein av interesse ved tilsetning Dox og kan synkroniseres på ulike stadier av cellesyklusen eller kan stimuleres med kjemikalier eller ligander for å aktivere hvilken som helst ønsket signalveien. Den subcellulære lokalisering av LAP-merket protein av interesse kan analyseres av levende celle eller fast celle bildebehandling. LAP-merkede proteiner kan også være tandem affinitetsrenset og deres samspill proteiner kan identifiseres ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS). Endelig kan Cytoscape brukes til å generere en protein-protein interaksjon nettverk av agn proteinet. Dox indikerer Doxycycline, IP indikerer immunpresipitatet, EGFP indikerer forbedret grønt fluorescerende protein, Tev indikerer TEV proteasespaltningsstillingen, og S indikerer S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oversikt over LAP-merket Protein Expression, rensing og klargjøring for massespektrometri. Protokollen har 9 trinn: 1) vekst og induksjon av LAP-merket protein ekspresjon, 2) celle høsting og lyse, 3) forberedelse av lysater, 4) bindingen av lysater til anti-GFP perler, 5) TEV protease spalting av GFP-tag, 6) binding av lysatene til S-protein perler, 7) eluering av agn protein og samspill proteiner, og 8-9) utarbeidelse av prøver for massespektrometri-baserte proteomikk analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 4: Verifisering av LAP-Tau uttrykk. (A) Western blot (WB) analyse av proteinprøver fra ikke-indusert og Dox indusert LAP-Tau HEK293 celler probet med anti-GFP og anti-Tubulin antistoffer for påvisning av LAP-tagget Tau protein og Tubulin lasting kontroll, henholdsvis. Merk at LAP-Tau er bare uttrykt når cellene blir indusert med Dox. (B) Mitotiske celler som uttrykker LAP-Tau ble fikset og co-farget for DNA (Hoechst 33342) og Tubulin (badekar) med anti-tubulin antistoffer og subcellulære lokalisering av LAP-tau ble analysert ved fluorescens microcopy. Merk at LAP-Tau lokaliserer til mitotiske spindel og spindel polene under mitose. (C) Silver beiset gel av LAP-Tau rensing. MW indikerer molekylvekt, indikerer CL ryddet lysatene, og E indiskates endelige eluatene. Prøvene ble kjørt på en 4-20% SDS-PAGE og gelen ble sølvfarget for å visualisere de rensede proteiner. Legg merke til at et band som tilsvarer LAP-Tau er merket med en stjerne og flere andre band som tilsvarer co-rense proteiner kan sees. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| N-terminal fusjon | |
| Framover | 5'GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 ' |
| Omvendt | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 ' |
| C-terminal fusjon | |
| Framover | 5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 ' |
| Omvendt | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 ' |
Tabell 1: fremover og bakover primere for å forsterke ORF eller interesse for innsetting i Shuttle Vector. De attB områder er markert med fet skrift, betegner GSN at mer enn 18 gener spesifikke nukleotider legges til primer.
| Skritt | Temperatur | Tid | |
| initial denaturering | 94 ° C | 2 min | |
| PCR amplifiseringscykluser (35) | denaturering | 94 ° C | 30 sek |
| anneal | 55 ° C (avhengig av primeren Tm) | 30 sek | |
| Forlenge | 72 ° C | 1 min / kb | |
| Holde | 4 ° C | på ubestemt tid | |
Tabell 2: PCR betingelser for forsterkning av ORF av interesse.
| Vector | Forward Sekvensering Primer | Omvendt Sekvensering Primer |
| Shuttle Vector | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
Tabell 3: forover og bakover Sekvense Primere for Shuttle Vector.
| ID | Struktur | foreldre~~POS=TRUNC | Arrangøren | bac Res | Mam Res | Tet reg? |
| pGLAP1 | N-term EGFP-TEV-S peptid | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | amp | Hyg | Ja |
| pGLAP2 | N-term Flag-TEV-S peptid | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | amp | Hyg | Ja |
| pGLAP3 | N-term EGFP-TEV-S peptid; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | Hyg | Nei |
| pGLAP4 | N-term Flag-TEV-S peptid; ; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Hyg | Nei | |
| pGLAP5 | C-term S peptid-PreProt x2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | amp | Hyg | Nei |
Tabell 4: Oversikt over tilgjengelige LAP / TAP vektorer med Variable arrangører, epitop-koder, og Dox induserbar ekspresjon muligheter for N eller C-terminal Protein merking. Vektorer er kommersielt tilgjengelige. Bac Res indikerer bakteriell resistens markør, indikerer Mam Res pattedyrceller resistensmarkør, Tet reg? angir om uttrykket er Tet / Dox regulerbar.
| Vector | Forward Sekvensering Primer | Omvendt Sekvensering Primer |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
Tabell 5: forover og bakover sekvenseringsprimere for pGLAP vektorer.
Discussion
Den skisserte protokollen beskriver kloning av gener av interesse i fanget merking vektor, generering av induserbare LAP-merket stabile cellelinjer, og rensing av LAP-tagget protein komplekser for proteomikk analyser. Med hensyn til andre LAP / TAP-tagging tilnærminger, har denne protokollen blitt strømlinjeformet for å være kompatibel med high-throughput tilnærminger for å kartlegge protein lokalisering og protein-protein interaksjoner innenfor enhver cellulær veien. Denne tilnærmingen har blitt mye brukt til funksjonell karakterisering av proteiner kritiske for cellesyklusprogresjon, mitotisk spindelenheten, spindel pol homeostase, og ciliogenesis for å nevne noen, og har hjulpet forståelsen av hvordan misregulation av disse proteinene kan føre til menneskelige sykdommer 15, 16,19,20. For eksempel, gruppen vår nylig utnyttet dette systemet for å definere den funksjon og regulering av STARD9 mitotiske kinesin (en kandidat kreft mål) i spindelenheten 15,21, for å definere enny molekylær koblingen mellom Tctex1d2 dynein lett kjede og korte rib polydactyly syndromer (SRPS) 19, og for å definere en ny molekylær lenke for å forstå hvordan mutasjon av Mid2 ubiquitin ligase kan føre til X-koblede utviklingshemning 16. Andre laboratorier har også med hell brukt denne metoden, inkludert en som fastslått at Tctn1, en regulator av mus pinnsvin signalering, var en del av en ciliopathy-assosierte proteinkompleks som regulerte ciliær membransammensetning og ciliogenesis i et vev-avhengig måte 22,23. Derfor kan denne protokollen grovt brukes til disseksjon av enhver cellulær veien.
Et kritisk punkt i denne protokollen er utvalget av LAP-merket stabile cellelinjer som er Hygromycin motstandsdyktig. Spesiell forsiktighet bør tas for å sikre at alle cellene i styreplate er døde før du velger foci i den eksperimentelle plate for forsterkning. Hygromycin kan også Added under rutinemessig celledyrking av LAP-merket stabile cellelinjer for å ytterligere sikre at alle cellene opprettholde LAP-merket genet av interesse på FRT nettstedet. Vi advarer at ikke alle LAP-merkede proteiner vil være funksjonelle, og at det er viktig å ha analyser på plass som kan brukes til å teste protein funksjon. Eksempler på analyser brukes til å teste protein funksjon inkluderer redning av siRNA-indusert fenotyper og in vitro aktivitetsanalyser. For å løse eventuelle problemer med tillegg av en stor LAP-tag, har vi tidligere generert TAP-tag vektorer som er kompatible med dette systemet som inneholder mindre koder, som flagg, som er mindre sannsynlighet for å hemme funksjon og lokalisering av protein av interesse 4. I tillegg LAP-tagging vektorer eksisterer for å generere C-terminal LAP-merkede proteiner eller C-terminal TAP-merkede proteiner som er kompatible med dette systemet, som kan brukes i tilfeller der en LAP / TAP tag ikke tolereres på N -terminus av et protein. I tillegg the salt og vaskemiddel konsentrasjoner av rense buffere (LAPX N) kan endres for å øke eller redusere rensing stringens hvis ingen eller for mange interaksjoner er observert. Tilsvarende er det tandem affinitetsrensing prosedyre strengere enn ett renseprosedyrer og svake interactors kan gå tapt, og således kan anvendes en enkelt rense ordning ved få eller ingen interactors er identifisert.
Det er viktig å merke seg at andre GFP epitop tagging tilnærminger finnes som tillater stor skala GFP protein merking for protein lokalisering og rensing studier 24,25. Disse inkluderer BAC TransgenOmics tilnærming som utnytter bakterie kunstige kromosomer til å uttrykke GFP-merket gener av interesse fra sitt opprinnelige miljø som inneholder alle de regulatoriske elementer, som etterligner endogene genuttrykk 24. Mer nylig har CAS9 / single-styrt RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekser (RNPs) blitt brukt til å endeogenously merke gener av interesse med en split-GFP system som gjør at uttrykket av GFP-merket gener fra deres endogene genomisk loci 25. Selv om begge disse tilnærmingene aktivere uttrykk for merkede proteiner etter endogene forhold, sammenlignet med LAP-tagging protokollen beskrevet her, de tillater ikke for induserbar og fleksibel uttrykk for de merkede gener av interesse. I tillegg har de ennå å bli brukt på tandem epitop merking for TAP. Det er også viktig å merke seg at andre merkingssystemer kan også bli modifisert til å bli kompatibelt med systemet som er beskrevet her for generering av induserbare epitop-tagget stabile cellelinjer. For eksempel har nærhet avhengig biotin identifikasjon (BioID) fått stor oppmerksomhet på grunn av sin evne til å definere romlige og tidsmessige relasjoner mellom samspill proteiner 26. Denne teknikken utnytter proteinfusjoner til en promiskuøs stamme av Escherichia coli biotin-ligase BIRA, som biotinylerteer ethvert protein innen et ~ 10 nm radius av enzymet. De biotinylerte proteinene blir deretter affinitetsrenset ved å bruke biotin-affinitet fangst og analysert med henblikk på sammensetning ved hjelp av massespektrometri. BIRA vil biotinylere hvilket som helst protein i umiddelbar nærhet, selv forbigående, noe som gjør den spesielt egnet for detektering av svake vekselvirker partnere i et komplekst 27. I tillegg gjør rensing ordningen ikke nødvendiggjør at endogene protein-protein interaksjoner forbli intakt og kan utføres under denaturerende betingelser, og dermed redusere frekvensen av falske positiver. Innenfor vår nåværende protokoll, kan substitusjon av pGLAP1 vektor med en Bira merking vektortransformere dette systemet fra å identifisere protein-protein interaksjoner basert på tilhørighet til å oppdage dem basert på nærhet. Et slikt system ville være meget fordelaktig for å detektere transiente protein interaksjoner som er tilfellet mellom mange enzym-substrat-vekselvirkninger og for kartlegging av tid og rom-protein-protein interactions innenfor definerte strukturer som har blitt utført for sentrosomen og flimmerhårene 26,28.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
- Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
- LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
- ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
- Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
- Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
- Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
- Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
- Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
- Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
- Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
- Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
- Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
- Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
- Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
- Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
- Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
- Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
- Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
