Protocol
BEMÆRK: En oversigt over dannelsen af inducerbare LAP-mærkede stabilt cellelinier til ethvert protein af interesse er vist i figur 1 og oversigt over LAP-mærket protein ekspression, oprensning og forberedelse til masse proteomikanalyser er illustreret i figur 3.
1. Kloning Den åbne læseramme (ORF) af genet af interesse ind i LAP-tag Vector
- Kloning ORF af genet af interesse ind i shuttlevektoren.
- Brug polymerasekædereaktion (PCR) til at amplificere ORF af interesse med de passende attB1 og attB2 sites inden primerne til enten N-terminal fusion eller C-terminal fusion. Se Tabel 1 for primersekvenser og tabel 2 for PCR-betingelser.
- Gel oprense PCR-produkterne ved at løse dem på en 1% agarosegel. Udskære forstærkede band, der er den korrekte størrelse fra gelen og udtrække det fra gelen skive ved hjælp af en DNA-gel ekstraktionskit i henhold til producentens anvisninger.
- Inkubér oprensede attB indeholdende PCR-produkter med en attP indeholdende shuttlevektor og rekombinasen der tillader PCR-produkterne til at rekombinere i vektoren i henhold til producentens anvisninger (se M aterialer tabel).
BEMÆRK: Tomme shuttle vektorer og LAP-tagging vektorer indeholder ccd B genet og er nødt til at blive formeret i CCD B resistente bakterieceller (se Materialer tabel). Men CCDB genet rekombineres ud, når en ORF indsættes i disse vektorer, og derfor bruge standard DH5a E. coli-celler, når formeringsmateriale vektorer med klonede ORF'er. - Transform DH5a E. coli-celler med 1 pi af reaktionsproduktet og pladen de transformerede celler på en Luria-bouillon (LB) agarplader med 50 mg / ml kanamycin 13.
- Vælg de resistente kolonier kanamycin.
- Grow de valgte kolonier i LB migdia med 50 mg / ml kanamycin, lave en DNA mini-prep og bekræft gen integration ved DNA-sekventering under anvendelse af de sekventeringsprimere anført i tabel 3.
- Overførsel af genet af interesse fra Shuttle Vector ind i LAP-tag Vector.
- Inkubér shuttle vektor, der indeholder sekvensen verificeret gen af interesse ORF med LAP-tag-vektoren (pGLAP1 til N-terminal fusion) og rekombinasen der medierer overførslen af genet af interesse fra shuttle vektoren i LAP-tag vektoren som pr producentens instruktioner (se materialer).
BEMÆRK: En serie af LAP / TAP vektorer, der kan anvendes baseret på den ønskede promotor, epitop-tag, og N eller C-terminale tagging kan findes i tabel 4. - Transform DH5a E. coli-celler med 1 pi af reaktionsproduktet og pladen de transformerede celler på en LB-agarplade med 100 mg / ml ampicillin 13.
- Vælg den resistente colo Ampicillinheder.
- Grow de valgte kolonier i LB-medium med 100 mg / ml ampicillin, lave en DNA mini-prep, og bekræft gen integration ved DNA-sekventering under anvendelse af de sekventeringsprimere anført i tabel 5.
- Inkubér shuttle vektor, der indeholder sekvensen verificeret gen af interesse ORF med LAP-tag-vektoren (pGLAP1 til N-terminal fusion) og rekombinasen der medierer overførslen af genet af interesse fra shuttle vektoren i LAP-tag vektoren som pr producentens instruktioner (se materialer).
2. Dannelse af en inducerbar stabil cellelinie, der udtrykker LAP-mærkede gen af interesse
- Vælg den celle linje bedst egnet til projektet af interesse. Alternativt oprette en værtscelle linje fra enhver eksisterende cellelinje, der konstitutivt udtrykker TetR og indeholder et FRT-sted, der tillader LAP-mærkede gen af interesse, der skal integreres stabilt i genomet (se Materialer).
BEMÆRK: Denne protokol anvender en HEK293 cellelinie, som indeholder TetR og en FRT-sted, som dyrkes i -Tet DMEM / F12-medium [fremstillet med 10% føtalt bovint serum (FBS), der er blottet for tetracyclin (-Tet)] 4 . - Bestemme den minimale koncentration af Hygromycin kræves for at dræbe værtscellen linje inden 1 til 2 weeks efter narkotikamisbrug. Koncentrationen kan variere mellem værtscellelinier, med de fleste i området mellem 100 ug / ml og 800 ug / ml.
BEMÆRK: HEK293 celler dyrket i -Tet DMEM / F12-medium med 100 pg / ml hygromycin ved 37 ° C og 5% CO2 vil dø inden for 1-2 uger. - Co-transfektion af vektoren, der udtrykker flippase rekombinase (medierer integration af LAP-mærkede gen af interesse i FRT-stedet i genomet af cellen) med LAP-mærkede vektor i HEK293-celler under anvendelse af et transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger . Brug et forhold på 4: 1 af rekombinase vektor til LAP vektor 14.
BEMÆRK: Det optimale forhold er afhængig af den anvendte værtscelle linje og fremgangsmåde til transfektion, og kan kræve en titrering. Et forhold på 4: 1 fungerer godt for de fleste cellelinjer. Indbefatter en mock-transficeret plade som en negativ kontrol. - En dag efter transfektion udskifte -Tet DMEM / F12 medium med frisk medium.
- To dage efter transfectipå, opdele celler til 25% sammenflydning. Tillad celler ~ 5 timer for at vedhæfte, tilsæt derefter Hygromycin-holdige -Tet DMEM / F12 medier ved koncentrationen forudbestemte i trin 2.2. For HEK293 celler bruger 100 pg / ml Hygromycin.
BEMÆRK: FRT indeholdende HEK293 cellelinjen indeholder også TetR der er forbundet med Blasticidin modstand, således 5 ug / ml Blasticidin bruges under stabil cellelinie udvælgelsesprocessen til selektion for TetR og for at minimere resterende ekspression. - Erstat Hygromycin-holdige -Tet DMEM / F12-medium efter behov, indtil distinkte celle foci forekommer der ligner uigennemsigtige pletter mod den transparente plade.
- Tilsæt 20 pi trypsin på toppen af hver celle foci og pipetteres op og ned 2 gange med en 200 pi pipettespids. Placer celler i en plade med 24 og udvide cellerne ved kontinuerlig vækst i hygromycin-holdigt -Tet DMEM / F12-medium.
- Screen celler til inducerbar LAP-mærket protein ekspression med fast celle eller levende-celle fluorescensmikroskopi og / ellerWestern blotting for GFP tag i LAP-tag 15.
3. Oprensning af LAP-mærkede proteinkomplekser
BEMÆRK: Følgende LAP-mærkede protein rensning protokol detaljer anbefalinger om betingelser og mængder, der anvendes for en typisk LAP-mærket proteinoprensning baseret på tidligere erfaringer. Dog bør der udvises forsigtighed for at sikre, at empirisk optimering udføres for enhver proteinkompleks og protein udtryk niveau af interesse at give de bedste resultater.
- Cellevækst og Cell Høst.
- Udvide validerede LAP-mærkede cellelinie til TAP isolering af proteinkomplekser, ved løbende passage alle HEK293-celler i større plader og / eller rulleflasker i -Tet DMEM / F12-medium ved 37 ° C og 5% CO2.
- For Tet / Dox inducerbar cellelinjer, inducerer i 10-15 timer ved en koncentration på 0,2 ug / ml Tet / Dox når cellerne når ~ 70% sammenflydning, før harvesting celler.
BEMÆRK: bør bestemmes koncentrationen og induktion tid for hvert protein, anbefales en titrering af 0,1-1 mg / ml Tet / Dox for 10-15 timer. - Harvest celler ved agitation eller trypsinisering og pellet celler ved 875 xg i 5-10 min.
- Kobling Anti-GFP antistof til protein A perler
- Brug 40 ug antistof til immunpræcipitering fra et lysat fremstillet ud fra en 0,5 ml cellepellet, pakket cellevolumen (PCV).
BEMÆRK: Den mængde antistof behov vil afhænge af den overflod af LAP-mærkede protein, blandt andre faktorer, og vil kræve optimering. En titrering af 10-40 mg anbefales. - Ækvilibrere 160 pi pakkede volumen (PV) Protein A-perler i PBST (PBS + 0,1% Tween-20) i et 1,5 ml rør. Vask 3 gange med 1 ml PBST.
BEMÆRK: Alle vaskninger heri udføres ved centrifugering af perlerne ved 5.000 xg i 10 sek. - Resuspender perler i 500 pi PBST og tilføje 80 ug affinitet-purified kanin-anti-GFP-antistof til hvert rør af 160 pi perler. Bland i 1 time ved stuetemperatur (RT).
- Vask perler 2 gange med 1 ml PBST. Derefter vaskes perlerne 2 gange med 1 ml 0,2 M natriumborat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumborat + 15 ml 0,2 M borsyre). Efter den sidste vask tilsættes 900 pi af 0,2 M natriumborat, pH 9 for at bringe slutvolumenet til 1 ml.
- Tilsæt 100 pi 220 mM dimethylpimelimidat (DMP) til en endelig koncentration på 20 mM. Rotere rørene forsigtigt ved stuetemperatur i 30 minutter. For 220 mM DMP, resuspenderes indholdet af én 50 mg flaske i 877 pi 0,2 M natriumborat, pH 9, og der tilsættes straks til perlen suspension.
- Efter inkubation med DMP, vaske perler 1 gang med 1 ml 0,2 M ethanolamin, 0,2 M NaCl, pH 8,5 for at inaktivere det tilbageværende tværbinder. Resuspender perler i 1 ml af den samme buffer og rotere i 1 time ved stuetemperatur. Pellet perler og resuspendere perlerne i 500 pi 0,2 M ethanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5. Perler er stabile i several måneder ved 4 ° C.
- Brug 40 ug antistof til immunpræcipitering fra et lysat fremstillet ud fra en 0,5 ml cellepellet, pakket cellevolumen (PCV).
- Fremstilling af buffere for Cell Lysis og Kompleks Oprensning
- Forbered LAPX buffere (hvor X er den ønskede saltkoncentration [mM KCI] af LAP buffer, 300 mM for cellelyse, 200 mM for de fleste perle vaske, og 100 mM til vask perler før eluering proteiner) ved at gøre en pH 7,4 opløsning indeholdende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), X mM KCI, 1 mM ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 1 mM MgCl2 og 10% glycerol.
BEMÆRK: Komponenterne i denne puffer anvendes til at tilnærme miljøet i levende celler. HEPES bruges som en buffer i pH raseri af 7,2-8,2. KCI er et salt, der anvendes til at opretholde ionstyrken af pufferen. EGTA er et chelaterende middel, der binder calciumioner at nedbringe koncentrationerne af calcium sammenlignet med magnesium. Glycerol og MgCI2 anvendes til at forbedre stabiliteten af proteiner. - Forbered LAPX N puffer ved tilsætning 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol til LAPX buffer.
BEMÆRK: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol er et mildt rengøringsmiddel der opløser proteiner, men bevarer protein-protein interaktioner, og dermed en højere koncentration bruges under udpakningen, og det er derefter sænkes i løbet af de bindende og vasketrin.
- Forbered LAPX buffere (hvor X er den ønskede saltkoncentration [mM KCI] af LAP buffer, 300 mM for cellelyse, 200 mM for de fleste perle vaske, og 100 mM til vask perler før eluering proteiner) ved at gøre en pH 7,4 opløsning indeholdende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), X mM KCI, 1 mM ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 1 mM MgCl2 og 10% glycerol.
- Fremstilling af cellelysater
- Resuspender 500 pi PCV i 2,5 ml LAP300 med 0,5 mM dithiothreitol (DTT) og proteasehæmmere. Tilføj 90 pi 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% endelig) og bland ved at vende.
- Anbring på is i 10 min. Centrifuger ved 21.000 xg i 10 min. Saml denne lave hastighed supernatant (LSS). Tage en 10 pi prøve af LSS for gelanalyse.
- Overførsel LSS til en TLA100.3 rør og centrifugering ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Saml denne høje hastighed supernatant (HSS), i et rør og placere på is. Tage en 10 pi prøve af HSS til gelanalyse.
BEMÆRK: Undgå at tage det øverste mest lipid lag end bunden mest celledebris lag. Lipidlaget bør fjernes ved vakuum aspiration før opsamling af HSS.
- Første Affinity Capture: Binding til Anti-GFP Beads
- Pre-eluering antistof koblet perler (brug 160 pi perler pr 0,5 ml cellepellet (PCV)) ved at vaske dem 3 gange med 1 ml elueringsbuffer [3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4] for at slippe af med ukoblet antistoffer og reducere baggrunden. Gør hurtigt. Efterlad ikke perler i høj saltkoncentration i lang tid.
- Vask perler 3 gange med 1 ml LAP200 N. Bland HSS ekstraher med antistof-perler i 1 time ved 4 ° C. Centrifuger ved 21.000 xg i 10 min. Tage en 10 pi prøve af supernatanten (dvs. strømmen gennem (FT)) til gelanalyse.
- Vask perler 3 gange med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteaseinhibitorer. Vask perler 2 gange (5 min hver) med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteasehæmmere. Vask hurtigt 2 tIME'er med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT og ingen proteasehæmmere før du tilføjer tobak etch virus (TEV) protease.
- TEV spaltning
- Fortynd 10 ug TEV protease i 1 ml LAP200 N og rotere rørene ved 4 ° C natten over.
BEMÆRK: Dette trin kan optimeres til enhver LAP-mærket protein, der skal udfyldes i et par timer ved at justere koncentrationen af TEV-protease, som kan støtte bevarelsen af LAP-mærkede protein-komplekser. - Pellet perler og overføre supernatanten til et nyt rør. Skyl perlerne to gange med 160 pi LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteasehæmmere (tredobbelt koncentration) for at fjerne enhver resterende protein. Tage en 10 pi prøve af supernatanten til gelanalyse.
- Fortynd 10 ug TEV protease i 1 ml LAP200 N og rotere rørene ved 4 ° C natten over.
- Anden Affinity Capture: Binding til S Protein agarose
- Vask 1 tube 80 pi S-protein-agarose-opslæmning (40 pi pakkede harpiks) 3 gange med 1 ml LAP200 N.
BEMÆRK: S protein binding til S-tag vil rekonstituere et aktivt RNase og en alternativ andet epitopmærke bør overvejes til RNA indeholdende protein-komplekser. - Tilføj TEV eluerede supernatant til S-protein agaroseperler og sten i 3 timer ved 4 ° C. Pellet perler og vask 3 gange med 1 ml LAP200 N med 0,5 mM DTT og proteaseinhibitorer. Vask perler 2 gange med 1 ml LAP100.
- Vask 1 tube 80 pi S-protein-agarose-opslæmning (40 pi pakkede harpiks) 3 gange med 1 ml LAP200 N.
- proteineluering
- Eluere proteiner fra S-protein-agarose ved tilsætning af 50 pi 4x Laemmli prøvebuffer og opvarm til 97 ° C i 10 minutter.
BEMÆRK: Proteiner kan også elueres fra perlerne med elueringsbuffer (3,5 M MgCl2 med 20 mM Tris, pH 7,4).
- Eluere proteiner fra S-protein-agarose ved tilsætning af 50 pi 4x Laemmli prøvebuffer og opvarm til 97 ° C i 10 minutter.
4. Identificer interagerende proteiner ved massespektrometri Analyse
- Teste kvaliteten af oprensningen ved at analysere de indsamlede prøver ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE), sølvfarvning af gelen (se
- At identificere støkiometriske og substøkiometriske co-rensende arter, tage den endelige eluering prøven og adskille den fra SDS-PAGE. Farv gelen med en massespektrometri kompatibel protein pletten. Udskære de mest fremtrædende bånd og plads i mellem dem fra gelen og behandle dem til analyse ved massespektrometri separat 16.
BEMÆRK: Der er mange tilgange til at adskille den endelige rensning eluaterne og forberede dem til massespektrometri 5. For eksempel kan LAP-oprensede komplekser elueres fra S-protein-perler ved hjælp af høj salt (3,5 M MgCl2), og hele proteinet populationen massevis kan analyseres ved massespektrometri 17. Alternativt kan endelige eluater adskilles i 1 mm med SDS-PAGE og et enkelt 1 mm bånd kan være excised og analyseret. Dette afslutter den komplekse blanding af eventuelle perler eller partikler, der vil forstyrre analysen.
Representative Results
For at fremhæve nytten af dette system blev den åbne læseramme (ORF) af tau-mikrotubulus-bindende protein klonet i shuttlevektoren ved amplifikation af Tau ORF med primere indeholdende attB1 og attB2 sites (tabel 1) og inkubering af PCR produkter med den shuttle vektor og en rekombinase, der medierer indsættelsen af PCR-produkterne ind i shuttle vektoren. Reaktionsprodukterne blev anvendt til at transformere DH5a-bakterier 13 og plasmid-DNA fra Kanamycinresistente kolonier blev sekventeret for at sikre Tau insertion. En sekvens valideret shuttle-Tau vektor blev derefter anvendt til at overføre Tau ORF i pGLAP1 vektoren, hvilket fusioneret Tau i ramme med LAP (EGFP-TEV-S-protein) tag, ved at inkubere shuttle-Tau-vektor med pGLAP1 vektoren og rekombinasen der medierer overførslen af ORF fra shuttle vektoren til pGLAP1. Reaktionsprodukterne blev anvendt til at transformere DH5a-bakterier13 og plasmid-DNA fra ampicillinresistente kolonier blev sekventeret for at sikre, at LAP-Tau-fusion var i ramme. Sekvens valideret pGLAP1-LAP-Tau blev derefter cotransficeret med en vektor, som udtrykker flippase rekombination enzymet i HEK293 celler, der indeholdt et mål enkelt flippase anerkendelse (FRT) site inden deres genom, som er stedet for integration for LAP-mærket gener 14. Denne cellelinie udtrykte også TetR som binder til Tet operatører opstrøms af LAP-mærkede gener og tavshed deres udtryk i fravær af Tet / Dox. Stabile integranter blev selekteret med -Tet DMEM / F12-medium med 100 ug / ml Hygromycin i 5 dage. Individuelle hygromycin resistente celle foci blev høstet ved tilsætning af 20 pi trypsin på toppen og pipettering op og ned 2 gange. Celler blev anbragt i en plade med 24 og ekspanderes ved kontinuerlig vækst i -Tet DMEM / F12-medium.
At kontrollere, at Hygromycin resistente celles var stand til at udtrykke LAP-Tau blev HEK293 LAP-Tau-celler induceret med 0,1 ug / ml Dox i 15 timer og proteinekstrakter blev fremstillet fra ikke-inducerede og Dox-inducerede celler. Disse ekstrakter blev separeret ved SDS-PAGE, overført til en PVDF-membran, og immunoblottedes for GFP og tubulin som ladningskontrol. Som det ses i figur 4A, LAP-Tau (visualiseret med anti-GFP-antistoffer) blev kun udtrykt i nærvær af Dox. At validere, at LAP-Tau blev korrekt lokaliseret til den mitotiske mikrotubulus spindel under mitose, som var tidligere blevet vist for endogen Tau 18, blev HEK293 LAP-Tau-celler induceret med 0,1 ug / ml Dox i 15 timer, og celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd og co-farvet for DNA (Hoechst 33342) og mikrotubuli (anti-tubulin antistoffer). Konsekvent blev LAP-Tau lokaliseret til den mitotiske spindel under metafase i mitosen (figur 4B). Vil kontrollere, at LAP-Tau og dets interagerende proteiner kan renses med dette system, HEK293 LAP-Tau-celler blev dyrket i rulleflasker til ~ 70% sammenflydning, induceret med 0,1 ug / ml Dox i 15 timer, høstet ved omrøring, lyseret med LAP300 puffer og LAP-Tau blev oprenset under anvendelse af ovennævnte protokol. Eluater fra LAP-Tau oprensning blev opløst ved SDS-PAGE og gelen blev sølvfarvet. Figur 4C viser LAP-Tau rensning, markeret med en stjerne, er LAP-Tau og flere andre bands tegn på Tau interagerende proteiner kan ses.
Figur 1: Oversigt over Dannelse af LAP-mærkede Inducerbare Stabile cellelinier til enhver protein af interesse. Den åbne læseramme (ORF) af gener af interesse amplificeres med attB1 og attB2 sites flankerer 5 'og 3' enden sekvenser, henholdsvis (primersekvenser er angivet i Tabel 1) og klonet ind shuttle-vektoren. Sekvensverificeret shuttle-vektorer med genet af interesse anvendes derefter til at overføre genet af interesse ind i pGLAP1 vektoren. Sekvensen verificeret pGLAP1 vektor med genet af interesse er derefter co-transficeret med vektoren indeholdende flippase rekombinase til den ønskede cellelinie, som indeholder et mål enkelt flippase anerkendelse (FRT) sted i genomet, som er stedet for integrationen for LAP -tagged gener. Disse cellelinier udtrykker også Tet repressor (TetR), som binder til Tet operatører (TetO 2) opstrøms for LAP-mærkede gener og tavshed deres udtryk i fravær af Tet / Dox. LAP-mærkede gen af interesse derefter rekombineret til FRT-stedet og stabile integranter selekteres med hygromycin. Klik her for at se en større version af dette tal.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54.870 / 54870fig2.jpg "/>
Figur 2: Oversigt over ansøgninger om LAP-mærkede stabile cellelinier. LAP-mærkede inducerbare stabile cellelinier induceres til at udtrykke LAP-mærkede protein af interesse ved Dox tilsætning og kan synkroniseres ved forskellige trin af cellecyklus eller kan stimuleres med kemikalier eller ligander til at aktivere enhver ønsket signalvej. Den subcellulære lokalisering af LAP-mærkede protein af interesse kan analyseres ved levende celle eller fast cell imaging. LAP-mærkede proteiner kan også være tandem affinitetsoprenset og deres interagerende proteiner kan identificeres ved væskekromatografi tandem-massespektrometri (LC-MS / MS). Endelig kan Cytoscape anvendes til at frembringe et protein-protein-interaktion netværk af agn protein. Dox indikerer Doxycyclin, IP indikerer immunpræcipitat, EGFP indikerer forbedret grønt fluorescerende protein, Tev indikerer TEV proteasespaltningssted, og S angiver S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Oversigt over LAP-mærket Protein Expression, rensning og forberedelse til massespektrometri. Protokollen har 9 trin: 1) vækst og induktion af LAP-mærkede protein-ekspression, 2) celle høst og lyse, 3) udarbejdelse af lysater, 4) bindingen af lysater til anti-GFP perler, 5) TEV protease spaltning af GFP-tag, 6) bindingen af lysater til S-protein-perler, 7) eluering af agn protein og interagerende proteiner, og 8-9) forberedelse af prøver til massespektrometri-baserede proteomikanalyser. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4: Kontrol af LAP-Tau udtryk. (A) Western blot (WB) analyse af proteinprøver fra ikke-inducerede og Dox induceret LAP-Tau HEK293-celler probet med anti-GFP og anti-tubulin antistoffer til påvisning LAP-mærkede Tau-protein og tubulin ladningskontrol hhv. Bemærk, at LAP-Tau kun udtrykkes, når cellerne induceret med Dox. (B) mitotiske celler udtrykker LAP-Tau blev fikseret og co-farvet for DNA (Hoechst 33342) og tubulin (Tub) med anti-tubulin antistoffer og den subcellulære lokalisering af LAP-tau blev analyseret ved fluorescens mikroskopi. Bemærk, at LAP-Tau lokaliseres til mitosespindelen og spindel poler under mitose. (C) sølvfarvede gel af LAP-Tau oprensning. MW angiver molekylvægt, CL indikerer klarede lysater og E IndicATES afsluttende eluater. Prøver blev kørt på en 4-20% SDS-PAGE og gelen blev sølvfarvet for at visualisere de oprensede proteiner. Bemærk, at en bånd svarende til LAP-Tau er markeret med en stjerne og flere andre bands, der svarer til co-oprensning af proteiner kan ses. Klik her for at se en større version af dette tal.
| N-terminal fusion | |
| Forward | 5'GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 ' |
| Bagside | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 ' |
| C-terminal fusion | |
| Forward | 5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 ' |
| Bagside | 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 ' |
Tabel 1: Frem og Reverse Primere til forstærkning ORF'er eller interesse til indsættelse i Shuttle Vector. AttB sites er fremhævet med fede bogstaver, GSN angiver, at mere end 18 genspecifikke nukleotider tilsættes til primeren.
| Trin | Temperatur | Tid | |
| indledende denaturering | 94 ° C | 2 min | |
| PCR amplifikationscykler (35) | denaturere | 94 ° C | 30 sek |
| anneal | 55 ° C (afhængig af primeren Tm) | 30 sek | |
| Udvide | 72 ° C | 1 min / kb | |
| Holde | 4 ° C | på ubestemt tid | |
Tabel 2: PCR-betingelser til amplifikation af ORF'erne interessante.
| Vector | Forward Sequencing Primer | Reverse Sequencing Primer |
| shuttle Vector | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
Tabel 3: Fremad og Reverse sekventeringsprimere til Shuttle Vector.
| ID | Struktur | Parental | promotor | Bac Res | Mam Res | Tet reg? |
| pGLAP1 | N-term EGFP-TEV-S-peptid | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | Amp | Hyg | Ja |
| pGLAP2 | N-term Flag-TEV-S-peptid | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | Amp | Hyg | Ja |
| pGLAP3 | N-term EGFP-TEV-S peptid; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Amp | Hyg | Ingen |
| pGLAP4 | N-term Flag-TEV-S peptid; ; C-term V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Hyg | Ingen | |
| pGLAP5 | C-term S-peptid-PreProt x2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Amp | Hyg | Ingen |
Tabel 4: Liste over tilgængelige LAP / TAP Vektorer med variable Initiativtagere, epitop-tags, og Dox Inducerbare Expression Capabilities for N eller C-terminal Protein Tagging. Vektorer er kommercielt tilgængelige. Bac Res indikerer bakteriel resistens markering, Mam Res indikerer pattedyrcelle resistens markering, Tet reg? angiver, om ekspression er Tet / Dox regulerbar.
| Vector | Forward Sequencing Primer | Reverse Sequencing Primer |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
Tabel 5: Fremad og Reverse sekventeringsprimere til pGLAP Vektorer.
Discussion
Den skitserede protokol beskriver kloningen af gener af interesse ind i LAP-tagging vektor, generering af inducerbare LAP-mærkede stabile cellelinjer, og oprensningen af LAP-mærkede protein komplekser til proteomikanalyser. Med hensyn til andre LAP / TAP-tagging tilgange, er denne protokol blevet strømlinet for at være forenelig med high-throughput metoder til at kortlægge protein lokalisering og protein-protein interaktioner inden for enhver cellulær vej. Denne fremgangsmåde har været almindeligt anvendt til den funktionelle karakterisering af proteiner kritiske for cellecyklusprogression, mitosespindelen forsamling, spindel pole homeostase, og ciliogenesis at nævne nogle få, og har hjulpet forståelsen af, hvordan fejlagtig regulering af disse proteiner kan føre til sygdomme hos mennesker 15, 16,19,20. For eksempel, vores gruppe for nylig udnyttet dette system til at definere funktionen og reguleringen af STARD9 mitotiske kinesin (en kandidat kræft mål) i spindel samling 15,21, for at definere enny molekylær forbindelse mellem Tctex1d2 dynein let kæde og korte ribben polydaktyli syndromer (SRP'er) 19, og til at definere en ny molekylær link til at forstå, hvordan mutation af Mid2 ubiquitinligase kan føre til X-bundne intellektuelle handicap 16. Andre laboratorier har også med held anvendt denne metode, herunder en, der bestemmes, at Tctn1, en regulator af muse hedgehog signalering, var en del af en ciliopathy-associeret protein-kompleks, at reguleret ciliær membransammensætning og ciliogenesis i et væv-afhængig måde 22,23. Derfor kan denne protokol i store træk anvendes på dissektion af enhver cellulær vej.
Et kritisk trin i denne protokol er det udvalg af LAP-mærkede stabile cellelinier, der er hygromycin-resistent. Der skal udvises særlig omhu for at sikre, at alle celler i kontrolgruppen plade er døde, før du vælger foci i den eksperimentelle plade til forstærkning. Hygromycin kan også Added under rutinemæssig celle dyrkning af LAP-mærkede stabil cellelinjer til yderligere at sikre, at alle celler opretholde LAP-mærkede gen af interesse ved FRT-stedet. Det skal understreges, ikke alle LAP-mærkede proteiner vil være funktionel, og at det er vigtigt at have assays på plads, der kan anvendes til at teste proteinfunktion. Eksempler på anvendte assays til at teste proteinfunktion omfatter redningen af siRNA-induceret fænotyper og in vitro aktivitetsassays. For at løse eventuelle problemer med tilføjelse af et stort LAP-tag, har vi tidligere genereret TAP-tag vektorer er forenelige med dette system, der indeholder mindre tags, såsom FLAG, som er mindre tilbøjelige til at inhibere funktionen og lokalisering af proteinet af interesse fire. Endvidere findes LAP tagging vektorer til frembringelse C-terminale LAP-mærkede proteiner eller C-terminale TAP-mærkede proteiner, der er kompatible med dette system, som kan anvendes i tilfælde, hvor en LAP / TAP tag ikke tolereres ved N terminus af et protein. Derudover the salt og opvaskemiddel koncentrationer i rensningsanlægget buffere (LAPX N) kan modificeres til at øge eller mindske rensning stringens, hvis der observeres ingen eller for mange interaktioner. Tilsvarende affinitetsoprensning procedure tandem er strengere end enkelt oprensningsprocedurer og svage interaktionskandidater kan gå tabt, således en enkelt rensningsskema kan anvendes, når få eller ingen interaktionskandidater identificeres.
Det er vigtigt at bemærke, at der findes andre GFP-epitop tagging tilgange, tillader stor skala GFP protein tagging for protein lokalisering og rensning studier 24,25. Disse omfatter BAC TransgenOmics tilgang, der anvender bakterielle kunstige kromosomer til at udtrykke GFP-mærkede gener af interesse fra deres native miljø, der indeholder alle de regulatoriske elementer, som efterligner endogene genekspression 24. For nylig er CAS9 / single-styret RNA (sgRNA) ribonukleoprotein komplekser (RNP'er) blevet anvendt til at afslutteogenously tag gener af interesse med en split-GFP system, der tillader ekspression af GFP-mærkede gener fra deres endogene genomiske loci 25. Selv om begge disse tilgange muliggøre ekspressionen af mærkede proteiner under endogene betingelser, sammenlignet med den her beskrevne LAP-tagging protokol, de ikke tillader inducerbar og afstemmelige ekspression af de taggede gener af interesse. Derudover har de endnu ikke anvendes på tandem epitop tagging for TAP. Det er også vigtigt at bemærke, at andre tagging systemer også kan modificeres til at blive kompatible med systemet beskrevet her til frembringelse af inducerbare epitopmærkede stabile cellelinjer. For eksempel har nærhed-afhængig biotin identifikation (BioID) vundet stor opmærksomhed på grund af sin evne til at definere rumlige og tidsmæssige relationer blandt interagerende proteiner 26. Denne teknik udnytter proteinfusioner til en promiskuøs stamme af Escherichia coli biotinligase BirA, som biotinyleres helst protein i en ~ 10 nm radius af enzymet. De biotinylerede proteiner er derefter affinitetsoprenset under anvendelse af biotin-affinitetsindfangning og analyseret for sammensætning ved massespektrometri. BirA vil biotinylere helst protein i umiddelbar nærhed, selv kortvarigt, hvilket gør det særligt velegnet til detektering svagere interagerende partnere i et kompleks 27. Derudover betyder rensning ordningen ikke nødvendiggør, at endogene protein-protein interaktioner forblive intakt og kan udføres under denatureringsbetingelser, og dermed reducere antallet af falske positiver. Inden for vores nuværende protokol, kan substitution af pGLAP1 vektor af en BirA-tagging vektor omdanne dette system fra at identificere protein-protein interaktioner baseret på affinitet til at opdage dem baseret på nærhed. Et sådant system ville være yderst fordelagtig til detektion af forbigående protein-interaktioner som det er tilfældet mellem mange enzym-substrat-interaktioner og til kortlægning af det Spatiotemporal protein-protein-interactions inden definerede strukturer som det er blevet udført for centrosom og cilier 26,28.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
- Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
- LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
- ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
- Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
- Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
- Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
- Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
- Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
- Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
- Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
- Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
- Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
- Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
- Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
- Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
- Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
- Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
- Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
