Protocol
Примечание: обзор генерации индуцируемых LAP-меченый линии клеток стабильным для любого интересующего белка иллюстрируется на рисунке 1 и обзор LAP-меченого экспрессии белка, очистки и подготовки к массовым протеомики анализа показан на рисунке 3.
1. Клонирование открытой рамки считывания (ORF) гена интереса в LAP-тегов Вектор
- Клонирование ORF гена интереса к челночной Vector.
- С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации ORF интереса с соответствующими attB1 и attB2 сайтов в пределах праймеров для любого N-концевого слияния или С-концевого слияния. Приведены в таблице 1 для последовательностей праймеров и таблице 2 для условий ПЦР.
- Гель очищают продуктов ПЦР путем разделения их на 1% -ном агарозном геле. Акцизный усиленную группу, которая является правильный размер из геля и извлечь его из куска геля с использованием ДНК гнабор для выделения эль в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выдержите очищенный attB , содержащий продукты ПЦР с ATTP , содержащим челночный вектор и рекомбиназы , что позволяет ПЦР - продукты рекомбинация в вектор в соответствии с инструкциями производителя (см M aterials таблицу).
Примечание: Пустые челночные векторы и LAP-мечения векторы содержат ген ПЗС- B и должны быть размножены в ПЗС- В устойчивых бактериальных клеток (см Материалы таблицу). Однако ген БДКК объединяется, когда к ней ORF вставляется в эти векторы, следовательно , используют стандартные клетки DH5 & alpha ; E.coli , при распространении векторов с клонированными ORF , . - Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на Лурии бульона (LB) агар пластины с 50 мг / мл канамицина 13.
- Выберите колонии, устойчивые к канамицину.
- Grow выбранные колонии в LB меняДиа с 50 мг / мл канамицина, чтобы ДНК мини-Prep и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров для секвенирования , перечисленных в таблице 3.
- Перенос интересующего гена из челнока Вектор в LAP-тега Vector.
- Выдержите челночный вектор, содержащий последовательность подтверждали интересующего гена ORF с LAP-тегов вектора (pGLAP1 для N-концевого слитого) и рекомбиназы, который опосредует передачу представляющего интерес гена из челночного вектора в вектор LAP-тегов в соответствии с инструкции изготовителя (см Материалы).
Примечание: Серия LAP / TAP векторов , которые могут быть использованы на основе желаемой промотора, эпитоп-метку, и N или С-концевого мечения можно найти в таблице 4. - Transform DH5 & alpha ; клетках E.coli с 1 мкл продукта реакции и пластинчатые трансформированных клеток на чашку с агаром LB с 100 мг / мл ампициллина , 13.
- Выберите стойкую Colo ампициллинпаний.
- Grow выбранные колонии в LB среде с 100 мг / мл ампициллина, сделать ДНК мини-Prep, и подтвердить интеграцию гена путем секвенирования ДНК с использованием праймеров , перечисленных секвенирования в таблице 5.
- Выдержите челночный вектор, содержащий последовательность подтверждали интересующего гена ORF с LAP-тегов вектора (pGLAP1 для N-концевого слитого) и рекомбиназы, который опосредует передачу представляющего интерес гена из челночного вектора в вектор LAP-тегов в соответствии с инструкции изготовителя (см Материалы).
2. Генерация индуцируемого стабильной клеточной линии, которая выражает LAP-меченый ген, представляющий интерес
- Выберите линию клеток лучше всего подходит для проекта, представляющего интерес. В качестве альтернативы, создать линию клеток хозяина из любой существующей линии клеток, которые конститутивно экспрессирует тетр и содержит сайт FRT, который позволяет Поясной-меченый ген, представляющий интерес быть стабильно интегрирована в геном (см Материалы).
Примечание: Этот протокол использует клеточной линии HEK293, содержащий тетр и сайт FRT, выращиваемый в -Tet DMEM / F12 СМИ [сделано с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), лишенной тетрациклин (-Tet)] 4 , - Определить минимальную концентрацию гигромицина требуется, чтобы убить линию клеток-хозяев в пределах от 1 до 2 пикс после того наркотиков. Концентрация может варьироваться от линий клеток-хозяев, при этом большинство в диапазоне от 100 мкг / мл и 800 мкг / мл.
Примечание: HEK293 клетки , выращенные в -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицину , при температуре 37 ° С и 5% СО 2 умирают в течение 1-2 недель. - Со-трансфекцию вектора, выражающий флиппазы рекомбиназой (посредничает интеграцию LAP-меченого интересующего гена в сайт FRT внутри генома клетки) с вектором LAP-меченый в клетки HEK293 с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя , Используйте соотношение 4: 1 рекомбинантному вектора к вектору LAP 14.
Примечание: Оптимальное соотношение зависит от линии клетки-хозяина и способ трансфекции, и может потребоваться титрование. Соотношение 4: 1 хорошо подходит для большинства клеточных линий. Включите мнимо трансформированных пластину в качестве отрицательного контроля. - Однажды после трансфекции, замените / F12 СМИ -Tet DMEM со свежей средой.
- Через два дня после transfectiна, расщепленных клеток до 25% слияния. Разрешить клетки ~ 5 ч, чтобы прикрепить к нему, а затем добавить к гигромицину-содержащий -Tet DMEM / F12 носитель в концентрации заданного в шаге 2.2. Для НЕК293 используют 100 мкг / мл к гигромицину.
Примечание: FRT содержащий клеточной линии HEK293 также содержит тетр, связанный с сопротивлением бластицидин, поэтому 5 мкг / мл бластицидин используется во время стабильного процесса отбора клеточной линии, чтобы выбрать для тетр и свести к минимуму вытекающей выражение. - Заменить гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ по мере необходимости, пока отдельные очаги клеток появляются, которые напоминают непрозрачных пятен на прозрачной пластине.
- Добавьте 20 мкл трипсина в верхней части каждой ячейки очагов и пипеткой вверх и вниз в 2 раза с 200 мкл пипетки наконечник. Место клеток в 24-луночного планшета и расширить клетки путем непрерывного роста в гигромицину содержащих -Tet DMEM / F12 СМИ.
- Клетки сетчатые для индуцируемой экспрессии белка LAP-меченый по фиксированной клеток или живых клеток флуоресцентной микроскопии и / илиВестерн - блоттинга для GFP тега внутри тега LAP-15.
3. Очистка LAP-меченый белковых комплексов
Примечание: Следующая LAP-меченого очистки белков детали протокола рекомендации по условиям и объемам используемых для типичной очистки белков LAP-меченый на основе предыдущего опыта. Тем не менее, следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что эмпирическое оптимизация проводится для любого белкового комплекса и уровня экспрессии белка, представляющие интерес для обеспечения наилучших результатов.
- Рост клеток и клеток урожая.
- Разверните проверенную LAP-меченый клеточной линией для TAP изоляции белковых комплексов, путем непрерывного пассирования все НЕК293 в более крупные пластин и / или роллер - флаконах в -Tet DMEM / F12 среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Для индуцибельная клеточных линий Tet / Dox, индуцируют в течение 10-15 ч при концентрации 0,2 мкг / мл Tet / Dox, когда клетки достигают ~ 70% слияния, до того harvestinг клеток.
Примечание: Концентрация и время индукции должен быть определен для каждого белка, титрование 0,1-1 мкг / мл Tet / Dox в течение 10-15 ч, рекомендуется. - Урожай клеток путем перемешивания или трипсином и гранул клеток при 875 мкг в течение 5-10 мин.
- Связывание анти-GFP антитела к Бисер Белок А
- С помощью 40 мкг антитела для иммунопреципитации из лизатов, приготовленной из 0,5 мл клеточного осадка с, гематокрита (PCV).
Примечание: Количество антитела, необходимое будет зависеть от обилия LAP-меченый белок, наряду с другими факторами, и потребует оптимизации. Титрование 10-40 мкг рекомендуется. - Равновесие 160 мкл объем уплотненного (PV) бусинки Белок A в PBST (PBS + 0,1% твин-20) в 1,5 мл трубки. Промыть 3 раза с 1 мл PBST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все смывает в настоящем документе, осуществляют центрифугирование бусинки при 5000 мкг в течение 10 сек. - Ресуспендируют бисером в 500 мкл PBST и добавляют 80 мкг сродства-purified кроличьей анти-GFP антитела в каждую пробирку 160 мкл бус. Перемешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
- Вымойте бисером 2 раза с 1 мл PBST. Затем мыть бусин в 2 раза с 1 мл 0,2 М бората натрия, рН 9 (20 мл 0,2 М бората натрия + 15 мл 0,2 М борной кислоты). После последней промывки, добавляют 900 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9, чтобы довести до конечного объема 1 мл.
- Добавьте 100 мкл 220 мМ диметилпимелимидата (DMP) до конечной концентрации 20 мМ. Поворот пробирки осторожно при комнатной температуре в течение 30 мин. Для получения 220 мМ DMP, ресуспендирования содержимое одного флакона 50 мг в 877 мкл 0,2 М бората натрия, рН 9 и добавляют непосредственно к суспензионной.
- После инкубации с ДМП, мыть бусин 1 раз с 1 мл 0.2 М этаноламина, 0,2 М NaCl, рН 8,5, чтобы инактивировать остаточный сшивающий агент. Ресуспендируют бисером в 1 мл того же буфера и вращаются в течение 1 ч при комнатной температуре. Пелле шарики и ресуспендируют бусины в 500 мкл 0,2 М этаноламина, 0,2 М NaCl с рН 8,5. Бусинки стабильны в течение Северал месяцев при температуре 4 ° С.
- С помощью 40 мкг антитела для иммунопреципитации из лизатов, приготовленной из 0,5 мл клеточного осадка с, гематокрита (PCV).
- Подготовка буфера для лизиса клеток и комплексной очистки
- Подготовьте LAPX буферов (где X является искомой концентрации соли [мМ KCl] буфера LAP; 300 мм для лизиса клеток, 200 мм для большинства бортов моек, и 100 мм для мытья шариков до начала элюирование белков) путем рН раствора 7,4 содержащий 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), Х мМ КСl, 1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ MgCl 2, и 10% глицерина.
Примечание: Компоненты этого буфера используются для аппроксимации среды в живых клетках. HEPES используется в качестве буфера в рН ярости 7.2-8.2. KCl, соль, используемая для поддержания ионной силы буфера. EGTA является хелатирующий агент, который связывает ионы кальция, чтобы уменьшить уровень кальция по сравнению с магнием. Глицерин и MgCl 2 используются для улучшения стабильности белков. - Подготовьте LAPX N буфер добавлением 0,05% нонил phenoxypolyethoxylethanol в буфер LAPX.
Примечание: нонил phenoxypolyethoxylethanol является мягкое моющее средство, что растворяет белки, но сохраняет белок-белковых взаимодействий, таким образом, используется более высокая концентрация в процессе экстракции и затем опускается во время связывания и промывки.
- Подготовьте LAPX буферов (где X является искомой концентрации соли [мМ KCl] буфера LAP; 300 мм для лизиса клеток, 200 мм для большинства бортов моек, и 100 мм для мытья шариков до начала элюирование белков) путем рН раствора 7,4 содержащий 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), Х мМ КСl, 1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ MgCl 2, и 10% глицерина.
- Получение клеточных лизатов
- Ресуспендируют в 500 мкл PCV в 2,5 мл LAP300 с 0,5 мМ дитиотреитола (DTT) и ингибиторы протеазы. Добавить 90 мкл 10% нонил phenoxypolyethoxylethanol (0,3%) и окончательным перемешайте инверсии.
- Место на льду в течение 10 мин. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Собрать эту низкую скорость супернатант (LSS). Возьмите пробу 10 мкл для анализа LSS геля.
- Передача LSS в TLA100.3 трубки и спина при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Соберите эту высокую скорость супернатанта (HSS), в трубе и место на льду. Возьмите пробу 10 мкл HSS для анализа в геле.
Примечание: Избегайте брать верхний слой наиболее липидный апd нижней ячейки мусора слой. Липидный слой должен быть удален путем вакуумной аспирации до сбора ССА.
- Первый Affinity Capture: Связывание с бисером Anti-GFP
- Предварительно элюирования антитела в сочетании бусин (используют 160 мкл шариков на 0,5 мл клеточного осадка (PCV)) путем промывки их 3 раза 1 мл буфера для элюции [3,5 М MgCl 2 20 мМ Трис, рН 7,4] , чтобы избавиться от отцеплен антитела и уменьшить фон. Сделайте быстро. Не оставляйте шарики в высокой концентрации соли в течение длительного времени.
- Вымойте бисер 3 раза 1 мл LAP200 N. Смешайте HSS экстракт с бусами антителами в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Центрифуга при 21000 х г в течение 10 мин. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта (то есть поток , проходящий через (FT)) для анализа в геле.
- Промыть бусин 3 раза с помощью 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ ДТТ ингибиторов и протеаз. Вымойте бисером 2 раза (5 мин каждая) с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Промыть быстро 2 тредакторы IME с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT и без каких - либо ингибиторов протеазы перед добавлением вируса табака травление (ТРВ) протеазы.
- ТРВ Расщепление
- Разбавляют 10 мкг TEV протеазы в 1 мл LAP200 N и вращать трубки при 4 ° С в течение ночи.
Примечание: Этот шаг может быть оптимизирована для любого LAP-меченый белок должен быть завершен в течение нескольких часов, регулируя концентрацию TEV протеазы, который может помочь сохранению LAP-меченого белковых комплексов. - Гранул шарики и передачи супернатант в свежую пробирку. Промыть шарики дважды 160 мкл LAP200 N с 0,5 мМ DTT и ингибиторы протеазы (тройной концентрации) , чтобы удалить остатки белка. Возьмите пробу 10 мкл супернатанта для анализа в геле.
- Разбавляют 10 мкг TEV протеазы в 1 мл LAP200 N и вращать трубки при 4 ° С в течение ночи.
- Второй Affinity Capture: Связывание с S белка агарозном
- Промыть 1 тюбик 80 мкл S белка агарозном суспензии (40 мкл упакована смола) 3 раза с помощью 1 мл LAP200 N.
Примечание: S ProtEin связывание с S-тега будет воссоздавать активную РНКазы и альтернативный второй эпитоп тег следует рассматривать для РНК-содержащие белковые комплексы. - Добавить ТРВ элюируют супернатант S белка агарозном бусин и рок в течение 3 ч при температуре 4 ° С. Пелле шарики и промыть 3 раза с 1 мл LAP200 N с 0,5 мМ DTT ингибиторов и протеазы. Вымойте бисером 2 раза с 1 мл LAP100.
- Промыть 1 тюбик 80 мкл S белка агарозном суспензии (40 мкл упакована смола) 3 раза с помощью 1 мл LAP200 N.
- Белок Элюирование
- Элюции белки от S белок агарозы путем добавления 50 мкл 4х буфера Лэммли образца и нагревают при 97 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Белки также могут быть элюировали из бисера с буфера для элюции (3,5 М MgCl 2 20 мМ Трис, рН 7,4).
- Элюции белки от S белок агарозы путем добавления 50 мкл 4х буфера Лэммли образца и нагревают при 97 ° С в течение 10 мин.
4. Выявление белков, взаимодействующих с помощью масс-спектрометрического анализа
- Проверить качество очистки путем анализа собранных образцов электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), окрашивание серебром геля (см
- Для того, чтобы определить стехиометрические и субстехиометрические видов со-очистительные, принять окончательное образец элюции и отделить его с помощью SDS-PAGE. Пятно гель с масс-спектрометрии совместимы белка пятна. Акцизный самые известные группы и пространство между ними из геля и обрабатывать их для анализа методом масс - спектрометрии отдельно 16.
Примечание: Существуют многочисленные подходы для разделения конечных элюатов очистки и подготовки их для масс - спектрометрии 5. Например, LAP-очищенные комплексы могут быть элюировали из S-белка с помощью бус с высоким содержанием соли (3,5 М MgCl 2) и все население белка скопом можно анализировать с помощью масс - спектрометрии 17. В качестве альтернативы, конечные элюатов могут быть разделены на 1 мм с помощью SDS-PAGE и один 1 мм полоса может быть электроннойxcised и проанализированы. Это очищает сложную смесь любых гранул или частиц, которые будут мешать анализу.
Representative Results
Для того, чтобы подчеркнуть полезность этой системы, открытой рамки считывания (ORF) , связывающего белка тау микротрубочек клонировали в челночный вектор путем амплификации Tau ORF с использованием праймеров , содержащих attB1 и attB2 участки (таблица 1) , и инкубацию продуктов ПЦР с помощью челночный вектор и рекомбиназа, который опосредует вставки ПЦР-продуктов в челночный вектор. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha ; бактерии 13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к канамицину был секвенирован , чтобы обеспечить вставку тау. Последовательность подтверждено шатл-тау вектор был затем использован для передачи Tau ORF в вектор pGLAP1, который плавленого Tau в рамке с LAP (EGFP-ТРВ-S-белка) тегов, путем инкубирования челночный вектор-тау с вектором pGLAP1 и рекомбиназа, который опосредует передачу ORF из челночного вектора до pGLAP1. Продукты реакции использовали для трансформации DH5 & alpha; бактерии13 и плазмидной ДНК из колоний , устойчивых к ампициллину , секвенировали , чтобы гарантировать , что слитый LAP-тау был в кадре. Последовательность подтверждено pGLAP1-LAP-Tau затем котрансфицируют с вектором, выражающего флиппазы рекомбинации фермента в клетках НЕК293, содержащий мишень одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP-меченый генов 14. Эта клеточная линия также выразил тетр, который связывается с операторами Tet перед Поясной-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Стабильные интегранты были выбраны с -Tet DMEM / F12 среде с 100 мкг / мл гигромицина в течение 5 дней. Отдельные гигромицину, фокусы устойчивые клеточные собирали путем добавления 20 мкл трипсина на верхней и пипетированием вверх и вниз 2 раза. Клетки были помещены в 24-луночный планшет и расширена за счет непрерывного роста в -Tet DMEM / F12 средах.
Для того, чтобы проверить, что клетки резистентной к гигромицинуs были способны выражать LAP-тау, HEK293 LAP-Tau клетки индуцируют 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 ч и белковые экстракты получают из неиндуцированной и DOX-индуцированных клеток. Эти экстракты разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембрану и иммуноблоттинг для GFP и тубулина в качестве контроля нагрузки. Как видно на рисунке 4A, LAP-тау (визуализировали с помощью анти-GFP антител) была выражена только в присутствии Dox. Для того, чтобы подтвердить , что LAP-тау был должным образом локализованы в митотических микротрубочек веретена в митозе, как это было ранее показано на эндогенный Tau 18, клетки НЕК293 LAP-тау индуцировали с помощью 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов и клетки фиксировали 4% параформальдегидную совместно окрашивали ДНК (Hoechst 33342) и микротрубочек (анти-тубулина антителами). Последовательно, LAP-тау был локализован в митотического веретена во время метафазы митоза (рис 4В). Для того, чтобы убедиться, что LAP-Тау и ее взаимодействующих белков может быть очищен с этим SYSTEM, НЕК293 LAP-Tau-клетки культивируют в роллер-флаконах до ~ 70% сплошности, индуцированный с 0,1 мкг / мл Dox в течение 15 часов, собирали путем перемешивания, лизируют с буфером LAP300, и LAP-тау был очищен с использованием вышеуказанного протокола. Элюаты от очистки LAP-тау были решены с помощью SDS-PAGE и гель окрашивали серебра. Рисунок 4C показывает очистку LAP-тау, отмеченные звездочкой является LAP-тау и несколько других групп свидетельствуют о Tau взаимодействующих белков можно увидеть.
Рисунок 1: Обзор поколения LAP-меченый Индуцибельные Стабильные клеточные линии для любого интересующего белка. Открытая рамка считывания (ORF), из представляющих интерес генов амплифицируют с attB1 и attB2 сайтов, фланкирующих 5'- и 3'-конец последовательности, соответственно (последовательности праймеров приведены в Таблица 1) и клонировали в шаттл вектор. Последовательность проверяли челночные векторы с интересующим геном, затем используются для передачи интересующего гена в вектор pGLAP1. Последовательность проверяли pGLAP1 вектор с интересующего гена затем котрансфицируют с вектором, содержащим флиппазы рекомбиназу в желаемую клеточную линию, которая содержит цель одного распознавания флиппазы (FRT) сайта в их геном, который является местом интеграции для LAP -tagged генов. Эти клеточные линии также выражают Tet репрессор (тетр) , который связывается с операторами Tet (Teto 2) вверх по течению от LAP-меченый генов и заглушает их экспрессию в отсутствие Tet / Dox. Поясной-меченый интерес ген затем рекомбинируют в сайт FRT и стабильные интегранты выбираются с использованием гигромицина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Обзор приложений для LAP-меченый стабильных клеточных линий. LAP-меченый индуцируемые стабильные клеточные линии, которые индуцируют экспрессию Поясной-меченый белок, представляющий интерес путем Dox добавления и может быть синхронизирована на разных стадиях клеточного цикла или могут быть стимулированы с химическими веществами или лигандами, чтобы активировать любой желаемой пути передачи сигнала. Субклеточном локализации LAP-меченого белка, представляющего интерес можно анализировать с помощью живой клетки или визуализации фиксированной ячейки. LAP-меченных белков также может быть тандем аффинно очищенные и взаимодействующими белки могут быть идентифицированы с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS). И, наконец, Cytoscape может быть использован для создания сети белок-белковое взаимодействие белка приманки. Dox указывает доксициклина, IP указывает иммунопреципитации, EGFP указывает на усиленный зеленый флуоресцентный белок, Тев указывает сайт расщепления TEV протеазы, а S обозначает S-тег.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Обзор LAP-меченый экспрессии белка, очистки и подготовки к масс - спектрометрии. Протокол состоит из 9 этапов: 1) рост и индукции экспрессии белка LAP-меченый, 2) сбор клеток и лизис, 3) подготовка лизатов, 4) связывание лизатов с анти-GFP бусин, 5) TEV протеазы расщепление GFP-тег, 6) связывание лизатов с S-белковых шариков, 7) вымывание белка приманки и взаимодействующих белков и 8-9) подготовки образцов для масс-спектрометрии на основе протеомных анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 4: Проверка экспрессии LAP-тау. (A) Вестерн - блот (ВБ) Анализ образцов белка из неиндуцированной и Dox индуцированных клеток LAP-тау НЕК293 зондировали с анти-GFP и анти-тубулина антител для обнаружения LAP-меченый тау - белка и контроль Tubulin нагрузки, соответственно. Обратите внимание, что LAP-тау выражается только тогда, когда клетки индуцировали Dox. Клетки (B) митоза , выражающие LAP-Tau фиксировали и окрашивали совместно для ДНК (Hoechst 33342) и тубулина (ванна) с анти-тубулина антителами и субклеточном локализации LAP-тау анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что LAP-тау локализуется в митотического веретена и шпинделя полюсов во время митоза. (C) Серебро окрашивали гель очистки LAP-тау. MW обозначает молекулярную массу, CL показывает освобоженные лизатов и Е INDICATES окончательные элюатов. Образцы прогоняли на 4-20% SDS-PAGE, и гель окрашивали серебро, чтобы визуализировать очищенные протеины. Обратите внимание, что полоса, соответствующая LAP-тау отмечен звездочкой и ряда других полос, соответствующих совместно очистки белков можно увидеть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| N-концевой слитый | |
| Вперед | 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 ' |
| Задний ход | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 ' |
| C-концевой слитый | |
| Вперед | 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 ' |
| Задний ход | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 ' |
Таблица 1: прямого и обратного праймеров для амплификации ORF , или интереса для вставки в Shuttle Vector. Участки attB выделены жирным шрифтом, GSN означает, что более чем 18 генов специфические нуклеотиды добавляются к грунтовке.
| шаг | температура | Время | |
| Первоначальная денатурация | 94 ° C | 2 мин | |
| Циклы ПЦР-амплификации (35) | денатурировать | 94 ° C | 30 сек |
| отжигать | 55 ° C (в зависимости от праймера Tm) | 30 сек | |
| простираться | 72 ° C | 1 мин / кб | |
| Держать | 4 ° C | на неопределенное время | |
Таблица 2: условия ПЦР для амплификации ORF , представляющих интерес.
| Вектор | Форвард Секвенирование Primer | Обратный секвенирования Primer |
| Трансфер Вектор | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
Таблица 3: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для Shuttle Vector.
| Я БЫ | Состав | родительский | Промоутер | Bac Res | Мам Res | Tet рег? |
| pGLAP1 | N-термин EGFP-ТРВ-S пептид | pcDNA5 / FRT / TO | ЦМВ | ампер | Hyg | да |
| pGLAP2 | N-термин Flag-ТРВ-S пептид | pcDNA5 / FRT / TO | ЦМВ | ампер | Hyg | да |
| pGLAP3 | N-термин EGFP-ТРВ-S пептид; C перспективе V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | ампер | Hyg | Нет |
| pGLAP4 | N-термин Flag-ТРВ-S пептид; ; C перспективе V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | Hyg | Нет | |
| pGLAP5 | C-S Термин пептид-PreProt x2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1a | ампер | Hyg | Нет |
Таблица 4: Список доступных LAP / TAP векторов с переменными промоутеры, эпитоп-теги и Dox индуцируемой экспрессии Возможности для N или С-концевого белка Tagging. Векторы являются коммерчески доступными. Bac Res указывает маркер устойчивости к бактериальным, Мам Res указывает маркер устойчивости клеток млекопитающих, Tet рег? указывает, является ли выражение Tet / Dox регулируемую.
| Вектор | Форвард Секвенирование Primer | Обратный секвенирования Primer |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
Таблица 5: в прямом и обратном праймеры для секвенирования для pGLAP векторов.
Discussion
Изложенная протокол описывает клонирование генов, представляющих интерес в вектор LAP-маркировать, поколение индуцируемых LAP-меченый стабильных клеточных линий, а также очистку LAP-меченый белковых комплексов для протеомных анализов. Что касается других подходов LAP / TAP-мечения, этот протокол был оптимизирован, чтобы быть совместимым с высокой пропускной способностью подходов к карте локализации белка и белок-белковых взаимодействий в пределах любого клеточного пути. Такой подход широко применяется к функциональной характеристике белков критических для прогрессии клеточного цикла, сборки веретена, шпинделя полюса гомеостаза и цилиогенеза назвать несколько и помог понять, как misregulation этих белков может привести к человеческим заболеваниям 15, 16,19,20. Например, наша группа недавно использовали эту систему для определения функции и регуляции STARD9 митотической кинезином (целевая рак кандидат) в сборке шпинделя 15,21, чтобы определитьНовая молекулярная связь между Tctex1d2 динеин легкой цепи и короткие ребра полидактилия синдромы (SRPS) 19, и определить новую молекулярную связь для понимания того, как мутация убиквитинлигазы MID2 может привести к Х-хромосомой ограниченными интеллектуальными возможностями 16. Другие лаборатории также успешно применили этот метод, в том числе тот , который определил , что Tctn1, регулятор мыши Hedgehog сигнализации, была частью цилиопатии ассоциированного белкового комплекса , которая регулировала цилиарного состава мембраны и цилиогенеза в ткани-зависимым способом 22,23. Таким образом, этот протокол может быть широко применен к рассечения любого клеточного пути.
Важным шагом в этом протоколе является выбор LAP-меченый стабильных клеточных линий, которые являются устойчивыми к гигромицину. Особое внимание следует уделять внимание тому, чтобы все клетки в контрольной пластине мертвы, прежде чем выбрать фокусы в экспериментальной пластины для усиления. Гигромицину также может быть ADDEd во время обычного клеточного культивирования LAP-меченый линии клеток стабильным для дальнейшего обеспечения того, чтобы все клетки поддерживать LAP-меченый интересующего гена на сайте FRT. Мы предупреждаем, что не все LAP-меченных белков будет функциональным и, что важно иметь анализы на месте, которые могут быть использованы для тестирования функции белка. Примеры анализов , используемых для тестирования функции белка включают спасение миРНК-индуцированной фенотипов и в анализах пробирке активности. Для устранения любых потенциальных проблем, с добавлением большого LAP-тега, ранее мы генерироваться векторы ТАР-тегов, совместимые с этой системой, которые содержат мелкие метки, как FLAG, которые, менее вероятно, чтобы ингибировать функцию и локализацию белка, представляющего интерес 4. Кроме того, LAP-маркировать векторы существуют для генерации C-концевой LAP-меченных белков или C-концевые TAP-меченных белков, которые совместимы с этой системой, которая может быть использована в тех случаях, когда LAP / TAP тег не переносится на N -terminus белка. Кроме того, гое соль и моющее средство концентрации буферов очистки (LAPX N) может быть изменен , чтобы увеличить или уменьшить Очистку строгость при соблюдении доли не имеет или слишком много взаимодействий. Аналогичным образом, процедура очистки сродством тандем является более жестким, чем одиночный процедуры очистки и слабые interactors могут быть потеряны, таким образом, одна схема очистки может быть использован, когда идентифицируются мало или совсем нет interactors.
Важно отметить , что существуют и другие подходы к GFP эпитоп мечения , которые позволяют крупномасштабного белка GFP тегах для локализации белка и очистки исследований 24,25. К ним относятся подход BAC TransgenOmics , который использует бактериальные искусственные хромосомы , чтобы выразить GFP-меченый интерес генов из их родной среды , которая содержит все регуляторные элементы, имитирующем экспрессии 24 эндогенный ген. Совсем недавно, cas9 / Одноэлементная наведением РНК (sgRNA) рибонуклеопротеидные комплексы (РНП), были использованы для завершенияogenously метить гены , представляющие интерес с системой сплит-GFP , который позволяет экспрессию GFP-меченый генов от их эндогенных локусов генома 25. Хотя оба эти подхода позволяют экспрессию меченных белков при эндогенных условиях, по сравнению с протоколом LAP-мечения, описанного здесь, они не позволяют индуцибельной и перестраиваемой экспрессии меченых интерес генов. Кроме того, они еще должны применяться к тандемной эпитопа мечения для TAP. Важно также отметить, что другие системы мечения также могут быть модифицированы, чтобы стать совместимым с системой, описанной здесь для генерации индуцируемые эпитоп-меченый стабильных клеточных линий. Например, близость-зависимой идентификации биотин (BioID) привлекло значительное внимание в связи с его способностью определять пространственные и временные соотношения между взаимодействующих белков 26. Этот метод использует белковые слитые в беспорядочном штамма кишечной палочки биотин лигазы Бира, который biotinylates любой белок в пределах ~ 10 нм радиусом фермента. Биотинилированные белки затем очищали с использованием аффинной захвата биотин-аффинной и анализировали на состав, с помощью масс-спектрометрии. Bira будет biotinylate любой белок в непосредственной близости, даже скоротечно, что делает его особенно хорошо подходит для обнаружения слабых взаимодействующих партнеров в сложном 27. Кроме того, схема очистки не требует, что эндогенные белок-белковых взаимодействий остаются нетронутыми и могут быть выполнены в денатурирующих условиях, тем самым снижая уровень ложных срабатываний. В рамках нашего текущего протокола, замена вектора pGLAP1 на вектор Бира-мечения может превратить эту систему от идентификации белок-белковых взаимодействий на основе сродства к их обнаружения на основе близости. Такая система была бы весьма выгодным для обнаружения переходных взаимодействий белков как это происходит между многими взаимодействий фермент-субстрат и для картирования пространственно-временной белок-белок Interactions в рамках определенных структур , как было проведено для центросоме и ресничек 26,28.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
- Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
- LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
- ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
- Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
- Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
- Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
- Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
- Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
- Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
- Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
- Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
- Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
- Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
- Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
- Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
- Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
- Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
- Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).
