Abstract
Det finns för närvarande många kemiska verktyg för att införa kemiska sonder till proteiner för att studera deras struktur och funktion. En användbar metod är proteinkonjugering genom genetiskt introducera en onaturlig aminosyra innehållande en bioorthogonal funktionell grupp. Denna rapport beskriver ett detaljerat protokoll för sätesspecifik antikropp konjugering. Protokollet inkluderar experimentella detaljer för den genetiska inkorporering av en azid-innehållande aminosyra och konjugeringsreaktionen av stam-främjade azid-alkyn cykloaddition (SPAAC). Denna stam-främjade Reaktionen fortgår genom enkel blandning av de reagerande molekyler vid fysiologiskt pH och temperatur, och som inte kräver ytterligare reagens, såsom koppar (I) joner och koppar-kelatbildande ligander. Därför skulle denna metod vara användbar för allmän proteinkonjugering och utveckling av antikropps läkemedelskonjugat (ADC).
Introduction
Eftersom den genetiska inkorporering av p -methoxyphenylalanine i Escherichia coli rapporterades, 1 mer än 100 onaturliga aminosyror (UAAs) har framgångsrikt införlivas i olika proteiner. 1-3 Bland dessa UAAs, aminosyrorna innehåller bioorthogonal funktionella grupper har studerats ingående och utgör den största andelen. De bioorthogonal funktionella grupper som används i de UAAs inkluderar keton, 4 azid, 5 alkyn, 6 cyclooctyne, 7 tetrazin, 8 α, β-omättad amid, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 och bicyklo [6.1.0] -nonyne. 11 Även om varje funktionell grupp har sina fördelar och nackdelar, har aziden innehållande aminosyror varit mest använda för proteinkonjugering. p -Azidophenylalanine (AF), en av de azido-innehållande aminosyror, är lätt tillgänglig, och dess inkorporering efficiency är utmärkt. Mutantproteiner som innehåller denna aminosyra kan reageras med alkyner av koppar-katalyserad cykloaddition eller med cyclooctynes från SPAAC. 12-20
Nyligen har proteinläkemedel lockat stor uppmärksamhet inom läkemedelsindustrin. Den Antikropp-läkemedelskonjugat (ADC) är en klass av terapeutiska antikroppar som är fördelaktiga på grund av deras förmåga för riktad terapi för behandlingen av humana cancerformer 21 och andra sjukdomar. Mer än 50 ADC finns för närvarande i kliniska prövningar, och antalet ökar stadigt. I utvecklingen av ADC: er, många faktorer måste beaktas för att maximera effektiviteten och minimera biverkningar. Bland dessa faktorer, till ett effektivt och sätesspecifik konjugeringsreaktionen bilda en kovalent bindning mellan en antikropp och ett läkemedel är kritisk. Den önskade effektiviteten och specificiteten i konjugeringsreaktionen kan uppnås genom konjugering med en bioorthogonal funktionell grupp i enonaturlig aminosyra, som specifikt införlivas i en antikropp. 22-26 Här rapporterar vi ett protokoll till platsspecifikt införliva AF i ett antikroppsfragment och konjugera den muterade antikroppsfragment med en biokemisk sond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmidkonstruktion
- Konstruera en expressionsplasmid (pBAD-HerFab-L177TAG) som skulle uttrycka genen målantikroppen (pBAD-HerFab-WT) med en His 6 -taggen, och ersätta kodonet för leucin-177 med amber-kodonet (TAG) 27, med användning av konventionell platsriktad mutagenesteknik.
Se tabell över material. - Konstruera en annan expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) innehållande generna för den utvecklade tRNA Tyr och aminoacyl-tRNA-syntetas (ÅARS) paret. Använd den specialdesignade plasmidvektorn, pEVOL, för effektiv inkorporering av UAAs. De detaljerade plasmid informations- och kloningsprotokoll beskrivs i den föregående rapporten. 28
- Att med hög kvalitet plasmid-DNA genom användning av kommersiellt tillgängliga plasmiden förberedelsepaket. Den 260/280 förhållandet mellan ~ 1,8 är optimalt för det renade DNA. Om så erfordras, utför ett% agarosgelelektrofores för att kontrollera renheten hos DNA.
- elektroporering
- Lägg till varje 1 mikroliter DNA från pEVOL-AFRS 28 och pBAD-HerFab-L177TAG till 20 mikroliter Escherichia coli DH10β stam. Blanda försiktigt med hjälp av en pipett. Plasmiderna kan transformeras tillsammans eller i oberoende reaktioner.
- För 0,1 cm kyvetter, ange elektroporering inställningar till 25 iF och 2,5 kV.
- Sätt kyvetten i bilden av den chockerande kammaren. Skjut glida in i kammaren tills kyvetten gör fast kontakt med kammarelektroderna.
- Puls en gång genom att trycka på pulsknappen tills elektroporering piper maskinen.
- Tillsätt 1 ml super optimal buljong med katabolitrepression (SOC) medium innehållande 2% (vikt / volym) trypton, 0,5% (vikt / volym) jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, och 20 mM glukos till kyvetten snabbt och överföra blandningen till ett provrör. Inkubera cellerna i en timme vid 37 ° C med skakning.
- Spread transformerad E. coli-celler på lysogeni-buljong (LB) agarplattor innehållande lämpliga antibiotika (35 | j, g / ml kloramfenikol och 100 pg / ml ampicillin för val pEVOL-AFRS och pBAD-HerFab-L177TAG, respektive). Inkubera plattorna vid 37 ° C under 12 h.
- kultur beredning
- Inokulera en enda transformerad koloni i 5 ml LB-medium innehållande antibiotika. Inkubera i 12 h vid 37 ° C med skakning.
3. Expression och rening av HerFab-L177AF
- Expression av HerFab-L177AF
- Överföra den primära kulturen (5 ml) i 200 ml LB-medium innehållande ampicillin (100 | ig / ml) och AF (1 mM), följt av inkubation vid 37 ° C med skakning.
OBSERVERA: 100 mM AF stamlösning (10 ml) framställdes genom att lösa 206 mg AF i 100 mM saltsyra (10 ml, slutlig volym). - Tillsätt 2 ml av 1,6 M arabinos (16mM slutkoncentration) när kulturen når den log-fasen (OD 550 = 0,8, OD = optisk densitet). Inkubera i 12 h vid 30 ° C med skakning.
- Harvest celler genom centrifugering vid 11.000 xg under 5 min. Kassera supernatanten och frysa pelleten vid -20 ° C.
- Överföra den primära kulturen (5 ml) i 200 ml LB-medium innehållande ampicillin (100 | ig / ml) och AF (1 mM), följt av inkubation vid 37 ° C med skakning.
- cellys
- Resuspendera cell pellets i 20 ml periplasmatiska lysbuffert innehållande 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sackaros och 0,2 mg / ml lysozym, och inkubera blandningen under 1 h vid 37 ° C.
- Centrifugera cellysatet vid 18.000 xg vid 4 ° C under 15 min. Överför supernatanten till ett nytt rör och kasta pelleten.
- Ni-NTA-affinitetskromatografi
- Lägga Ni-NTA-harts suspension till varje centrifugrör (400 mikroliter harts för en 200 ml kultur), och blanda försiktigt vid 4 ° C under 1 h.
- Häll suspensionen i en polypropylen-kolonn och tvätta hartset tre gånger med 5 ml tvätt buffer innehållande 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazol, och 300 mM NaCl.
- Eluera målantikroppen med 300 mikroliter elueringsbuffert innehållande 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazol, och 300 mM NaCl.
- Fastställa koncentrationen av den mutanta protein genom Bradford-proteinanalys 29 eller genom att mäta absorbansen vid 280 nm. Beräkna extinktionskoefficienten (75.866 M -1 cm -1) för HerFab-L177AF vid 280 nm genom protein extinktionskoefficienten räknare med hjälp av extinktionskoefficienten (2471 M -1 cm -1) för AF.
OBS: Aminosyrasekvensen för HerFab kan hittas i NCBI website (GI: 783282791 och GI: 783282792).
4. Konjugering av renat HerFab-L177AF med alkyn Probes Använda Drag främjas azid-alkyn Cykloaddition (SPAAC)
- Tillsätt 20 mikroliter av Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) i H2O (20081; M slutlig koncentration) till en lösning av 10 mikroliter av HerFab-L177AF (10 pM slutkoncentration) i fosfatbuffert innehållande 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) och 100 mM NaCl.
OBS: Som alternativ, difluorinated cyclooctyne (DIFO) och bicyklo [6.1.0] nonyn (BCN) derivat är också tillgängliga för samma program. - Tillåta den töjningsgivande befordrad cykloaddition reaktionen fortsätta i 6 h vid 37 ° C. Om en ljuskänslig sond (t.ex. Cy5.5) används, täcka reaktionskärlet med aluminiumfolie.
- Rena den märkta HerFab enligt steg 5.
5. Rening av märkt HerFab
- Tillsätt 500 | il av provet till en centrifugal filterspinnkolonn.
- Centrifugera spinnkolonn vid 14.000 xg vid 4 ° C under 15 min.
- Släng genomströmning och överföring renat prov från spinnkolonn till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Som ett alternativ till steg 5.1- 5,3, utför purification genom dialys mot samma buffert.
- Lagra den renade märkta HerFab vid 4 ° C.
6. SDS-PAGE-analys av märkt HerFab
- Tillsätt 5 | il LDS proteinprovbuffert innehållande 106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris-bas (pH 8,5), 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250, och 0,175 mM fenolrött till 13 mikroliter av renat märkt HerFab (7,8 | iM eller 0,38 mg / ml) i närvaro (+) eller frånvaro (-) av 2 pl ditiotreitol (DTT, 100 mM slutlig koncentration). Inkubera blandningen vid 95 ° C under 10 min.
- Fäst 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-gel kassett till elektroforescell och lägga löpbufferten. Ladda de konjugerade proteinprover och för-färgade molekylviktsmarkör. Utföra gelelektrofores under 35 minuter vid 200 V.
Obs: Håll elektroforescell i mörker under hela perioden för att minimera fotoblekning av fluoroforen. - Efter elektrofores överföragelén till en fluorescerande gel scanner, och söka efter fluorescensemission vid lämplig våglängd. För Cy5.5 använder Cy5 läget i skannerprogrammet.
- Färga gelén med en kommersiell protein fläck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie, ett antikroppsfragment var sätesspecifikt konjugerade med en fluorofor genom att införliva en azid-innehållande aminosyra in i fragmentet och omsättning av den muterade antikroppsfragment med en ansträngd cyclooctyne (Figur 1). HerFab valdes som mål-antikroppsfragment, in i vilken AF införlivades som en azid-innehållande aminosyra. Att välja återstoden i HerFab för att ersätta med AF, ades röntgenkristallstrukturen för HerFab analyseras. 30 Viktiga krav för återstoden innefattar tillräckligt avstånd från antikroppen bindningsställe för att minimera minskningen i dess bindningsaffinitet och lösningsmedel tillgänglighet för effektiv konjugeringsreaktionen. Leucin vid position 177 var en ordentlig kandidat eftersom återstoden är väl exponerat för utsidan av antikroppen och som ligger nära gränsytan mellan två immunoglobulindomäner, som är på avstånd från antikroppen bindningsstället.
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Inledningsvis var expressionsplasmid för HerFab med en C-terminal His 6 -taggen konstruerat och en amber kodon infördes vid positionen 177 för AF införlivande genom webbplatsen -directed mutagenes. mutanten HerFab innehållande AF uttrycktes i närvaro av 1 mM AF genom sam-expression av evolved tRNA Tyr och aminoacyl-tRNA-syntetas paret. 27 Ni-NTA-affinitetsrening utfördes för de muterade proteinerna som uttrycks i närvaro och frånvaro av AF, och efter SDS-PAGE-analys visade att antikroppsfragment av full längd erhölls endast i närvaro av AF (fig 2). Härnäst det mutanta antikroppsfragmentet innehållande AF utvärderades för konjugering reaktion med en Cy5.5 -kopplad aza-dibenzocyclooctyne derivatet (Cy5.5-ADIBO). den antikroppsfragmentet och Cy5.5-ADIBO reagerades i en fosfatbuffert under 6 h, och reaktionsblandningen analyserades med SDS-PAGE i närvaro (+) och frånvaro (-) Av DTT (figur 3a). 25 Reaktionen med en vildtypsvarietet antikroppsfragment utfördes också och analyserades som en kontroll. Fluorescens bilder visade tydligt konjugering av den mutanta antikroppsfragment med Cy5.5-ADIBO, medan ingen konjugering observerades i reaktionen med vildtyp fragmentet. Elektronsprut jonisering masspektrometrisk (ESI-MS) analys visade kvantitativ konjugation med ingen detekterbar okonjugerad fragment (figur 3b). Sammantaget dessa resultat visade att den mutanta HerFab innehållande AF kan vara effektivt och enkelt konjugeras med ansträngda cyclooctynes från SPAAC utan ytterligare reagens.
Figur 1: Schematisk illustration av platsspecifik antikroppsmärkning av SPAAC.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Expression av mutant HerFab innehållande AF vid position 177 (L 177) i närvaro av den utvecklade tRNA / AARS paret. Expression av HerFab-L177AF i LB-medium innehållande utvecklad tRNA / AFRS par och 1 mM AF. Renade prover analyserades med SDS-PAGE i närvaro (+) eller frånvaro (-) av DTT, och gelén färgades med en kommersiell proteinfärgning. Figur anpassad från Ko, W. et al. 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Konjugering reagerajon av HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. (A) SDS-PAGE-analys av konjugering reaktion av vildtyp HerFab och HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. Reaktionsblandningama analyserades i närvaro (+) och frånvaro (-) av DTT, och proteinbanden synliggjordes genom en kommersiell protein fläck (till vänster) och fluorescens avbildning (höger). (B) ESI-MS analyser av HerFab-L177AF (till vänster) och HerFab-L177AF märkt med Cy5.5-ADIBO (höger): förväntade massan skillnaden mellan HerFab- L177AF och den konjugerade antikroppen = 1190 Da, observerat mass skillnad = 1190 Da . Figur anpassad från Ko, W. et al. 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den genetiska inkorporering av onaturliga aminosyror i proteiner har flera fördelar jämfört med andra metoder som används för proteinmodifiering. 1-3 En av de viktigaste fördelarna är dess allmänna tillämpbarhet till någon form av protein. I princip finns det ingen begränsning i valet av ett målprotein och ett målställe av proteinet. Emellertid kan ersättning av en strukturellt eller funktionellt viktiga rester med en UAA resultera i att förändra strukturen och funktionen av målproteinet. Generellt är rester som utsätts för lösningsmedel och inte interagerar med andra rester väljs för inkorporering av UAAs. Därför är strukturell information från en högupplöst kristallstruktur användas för att välja optimala platser för UAA inkorporering. 30 På grund av att inkorporeringen av UAAs är tekniskt enkelt och kräver en enkel mutagenes, kan flera webbplatser lätt screenas för att välja ett optimalt rest för en önskad funktion av ett målprotein. </ P>
I detta protokoll, är AF genetiskt införlivas ett antikroppsfragment, och muterade fragmentet är platsspecifikt märkt med en fluorofor, med hjälp av SPAAC. Konjugeringen Utbytet av denna metod är kvantitativ utan någon oönskad reaktion, vilket är en viktig förbättring jämfört med den föregående rapporten. 25 Detta åstadkoms genom försiktig strukturanalys för val av en optimal plats och en ökning av reaktionstiden. Därför är valet av plats för UAA inkorporering kritisk för snabb och kvantitativ konjugation. Dessutom är också avgörande för proteinutbyte och införlivande effektivitet användningen av effektiva UAA inkorporeringssystem (t.ex. pEvol-AFRS). 28
Andra UAAs inkorporerade i proteiner genom genetisk inkorporering metod för proteinkonjugering kan också användas för antikroppen konjugering. 4-11 När det gäller reaktionshastighet, kopparkatalyserade cykloaddition reaktion,samt invers elektron-demand Diels-Alder-reaktion med användning av tetrazines 8 och ansträngda alkener eller alkyner, kommer 7 att vara bättre än den SPAAC användes i denna studie. Kräver emellertid den kopparkatalyserade cykloadditionsreaktionen koppar (I) jon och ligander, 31 och aminosyrorna för Diels-Alder-reaktion är ofta syntetiskt utmanande, och inte tillräckligt stabila för kvantitativ konjugation. Keton-hydroxiamin kondens 4 kan också användas för samma ändamål. Det kräver dock måttligt sura betingelser, och dess reaktionshastighet är långsammare än den för SPAAC. Med tanke på de faktorer som kommersiella och syntetisk tillgänglighet av onaturliga aminosyror, reaktionshastigheten, bio-ortogonalitet, biokompatibilitet av reaktionsbetingelser, och inkorporering effektiviteten av onaturliga aminosyror, metoden att använda SPAAC och genetiskt införlivas AF skulle vara användbart för att utveckla modifierade terapeutiska proteiner såsom ADCs, samt för allmänproteinmärkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
