Abstract
Det er for tiden mange kjemiske verktøy tilgjengelig for å innføre kjemiske sonder til proteiner for å studere deres struktur og funksjon. En nyttig metode er proteinkonjugering ved genetisk å innføre en unaturlig aminosyre inneholdende et bioorthogonal funksjonell gruppe. Denne rapporten beskriver en detaljert protokoll for stedsspesifikke antistoff konjugering. Protokollen omfatter eksperimentelle detaljer for genetisk inkorporering av et azid-inneholdende aminosyre, og konjugeringsreaksjonen med strekk fremmet azid-alkyn cykloaddisjon (SPAAC). Denne stamme-fremmet reaksjonen forløper ved enkel blanding av de reagerende molekyler ved fysiologisk pH og temperatur, og krever ikke ytterligere reagenser slik som kobber (I) -ioner og kobber-chelaterende ligander. Derfor vil denne metoden være nyttig for generell proteinkonjugering og utvikling av antistoff-legemiddelkonjugater (ADCs).
Introduction
Siden den genetiske inkorporering av p-metoksyfenylalanin i Escherichia coli ble rapportert, har 1 mer enn 100 unaturlige aminosyrer (UAAs) blitt innarbeidet i forskjellige proteiner. 1-3 Blant disse UAAs har de aminosyrene som inneholder bioorthogonal funksjonelle grupper blitt grundig studert og utgjør den største andelen. De bioorthogonal funksjonelle grupper anvendt i UAAs omfatter keton, 4-azid, 5 alkyn, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β-umettet amid, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 og bicyklo [6.1.0] -nonyne. 11 Selv om hver funksjonell gruppe har sine fordeler og ulemper, har azidet holdige aminosyrer blitt mest utstrakt bruk for proteinkonjugering. p -Azidophenylalanine (AF), en av de azido-inneholdende aminosyrer, er lett tilgjengelig, og dens inkorporering efficiency er utmerket. Mutante proteiner som inneholder denne aminosyren kan omsettes med alkyner med kobber-katalyserte cykloaddisjon eller med cyclooctynes ved SPAAC. 12-20
Nylig Biopharmaceuticals har vært å tiltrekke stor oppmerksomhet i den farmasøytiske industrien. Det antistoff-legemiddel-konjugatet (ADC) er en klasse av terapeutiske antistoffer som er fordelaktige på grunn av deres evne til målrettet terapi for behandling av kreft hos mennesker 21 og andre sykdommer. Mer enn 50 adjutanter er for tiden i kliniske studier, og antallet er stadig økende. Ved utvikling av ADC, mange faktorer må tas i betraktning for å maksimere effektiviteten og minimalisere bivirkningene. Blant disse faktorene, for en effektiv og stedsspesifikk konjugeringsreaksjonen dannelse av en kovalent binding mellom et antistoff og et legemiddel er kritisk. Den ønskede effektivitet og spesifisitet i konjugeringsreaksjonen kan oppnås ved konjugering med et bioorthogonal funksjonell gruppe i enunaturlig aminosyre som er spesifikt inkorporert i et antistoff. 22-26 Her rapporterer vi en protokoll til site-spesifikt innlemme AF inn i en antistoff-fragment og konjugere den muterte antistoff-fragment med en biokjemisk sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid Construction
- Konstruer et uttrykk plasmid (pBAD-HerFab-L177TAG) som ville uttrykke målet antistoff genet (pBAD-HerFab-WT) med en Hans seks -tag, og erstatte kodon for leucin-177 med den gule kodon (TAG) 27, ved hjelp av konvensjonell seterettet mutagenese teknikk.
Se tabell for materialteknologi. - Konstruer et annet uttrykk plasmid (pEVOL-AFRS) inneholder gener for den utviklet seg tRNA Tyr og aminoacyl-tRNA syntetase (Aars) par. Bruk spesialdesignet plasmid vektor, pEVOL, for effektiv inkorporering av UAAs. De detaljerte plasmid informasjon og kloning protokoller er beskrevet i forrige rapport. 28
- Oppnå høy kvalitet plasmid DNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige plasmid forberedelse kits. Den 260/280 forhold på ~ 1,8 er optimal for det rensede DNA. Om nødvendig, utføre ett% agarosegel elektroforese for å kontrollere renheten av DNA.
- electroporation
- Legg hver en mL DNA av pEVOL-AFRS 28 og pBAD-HerFab-L177TAG til 20 mL Escherichia coli DH10β belastning. Bland forsiktig ved å bruke en pipette. Plasmidene kan bli transformert sammen eller i uavhengige reaksjoner.
- For 0,1 cm kyvetter, satt elektroporeringsmetoden innstillingene til 25 uF og 2,5 kV.
- Sett kyvetten i lysbilde av sjokkerende kammeret. Skyv lysbilde inn i kammeret inntil kyvetten gjør fast kontakt med kammer elektrodene.
- Puls gang ved å trykke på pulsknappen til electroporation piper maskinen.
- Tilsett 1 ml super optimal kokes med catabolitt-represjon (SOC) medium inneholdende 2% (vekt / volum) trypton, 0,5% (w / v) gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, og 20 mM glukose til kyvetten raskt og overføre blandingen til et reagensrør. Cellene inkuberes i 1 time ved 37 ° C med risting.
- Spre transformerte E. coli-celler på lysogeni buljong (LB) agar plater inneholdende egnede antibiotika (35 ug / ml kloramfenikol og 100 ug / ml ampicillin for å velge pEVOL-AFRS og pBAD-HerFab-L177TAG, henholdsvis). Platene inkuberes ved 37 ° C i 12 timer.
- kultur forberedelse
- Vaksinere en enkelt transformert koloni i 5 ml LB-medium som inneholder antibiotika. Inkuber i 12 timer ved 37 ° C med risting.
3. Uttrykk og rensing av HerFab-L177AF
- Uttrykk for HerFab-L177AF
- Overfør den primære kulturen (5 ml) i 200 ml LB-medium inneholdende ampicillin (100 ug / ml) og AF (1 mM), etterfulgt av inkubering ved 37 ° C med risting.
MERK: 100 mM AF-stamløsning (10 ml) ble fremstilt ved å oppløse 206 mg AF i 100 mM saltsyre (10 ml, sluttvolum). - Tilsett 2 ml 1,6 M arabinose (16mM sluttkonsentrasjon) når kulturen har nådd den log-fase (OD 550 = 0,8, OD = optisk tetthet). Inkuber i 12 timer ved 30 ° C med risting.
- Høste cellene ved sentrifugering ved 11 000 xg i 5 min. Kast supernatant og fryse pellet ved -20 ° C.
- Overfør den primære kulturen (5 ml) i 200 ml LB-medium inneholdende ampicillin (100 ug / ml) og AF (1 mM), etterfulgt av inkubering ved 37 ° C med risting.
- cellelyse
- Resuspender cellepelletene i 20 ml periplasmatiske lyseringsbuffer inneholdende 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sukrose og 0,2 mg / ml lysozym, og inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C.
- Sentrifuger cellelysatet ved 18.000 xg ved 4 ° C i 15 min. Overfør supernatanten til et nytt rør og kast pellet.
- Ni-NTA affinitetskromatografi
- Legg til en Ni-NTA-harpiks suspensjon til hvert sentrifugerør (400 pl harpiks for en 200 ml kultur), og bland forsiktig ved 4 ° C i 1 time.
- Helle suspensjonen inn i en polypropylen-kolonne og vask harpiksen tre ganger med 5 ml vaske buffer inneholdende 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazol, og 300 mM NaCl.
- Eluer mål-antistoffet med 300 ul elueringsbuffer inneholdende 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazol, og 300 mM NaCl.
- Bestem konsentrasjonen av det mutante protein ved Bradford proteinanalyse 29 eller ved å måle absorbansen ved 280 nm. Beregn ekstinksjonskoeffisient (75866 M -1 cm -1) for HerFab-L177AF ved 280 nm etter protein ekstensjonskoeffisient kalkulator med ekstinksjonskoeffisient (2471 M -1 cm -1) for AF.
MERK: aminosyresekvensen HerFab kan finnes i NCBI nettsted (GI: 783282791 og GI: 783282792).
4. Bøyning av renset HerFab-L177AF med alkyn prober ved bruk av stamme-forfremmet Azid-alkyn cykloaddisjon (SPAAC)
- Tilsett 20 mL av Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) i H 2 O (20081; M sluttkonsentrasjon) til en oppløsning av 10 ul av HerFab-L177AF (10 pM sluttkonsentrasjon) i fosfatbuffer inneholdende 10 mM Na HPO 2 4 (pH 7,0) og 100 mM NaCl.
MERK: Som alternativ, difluorinated cyclooctyne (DIFO) og bisyklo [6.1.0] nonyn (BCN) derivater er også tilgjengelig for den samme applikasjonen. - Tillat den strekk fremmet cykloaddisjon reaksjon forløpe i 6 timer ved 37 ° C. Hvis et lysfølsomt probe (for eksempel Cy5.5) anvendes, omfatter reaksjonsbeholderen med aluminiumsfolie.
- Rense merket HerFab henhold til trinn 5.
5. Rensing av Merket HerFab
- Legg 500 ul av prøven til et sentrifugalfilter spinnkolonne.
- Sentrifuger spinnkolonne ved 14.000 xg ved 4 ° C i 15 min.
- Forkast gjennomstrømnings og overføring renset prøve fra spinnkolonne til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Som et alternativ til trinn 5.1 5.3, utføre purificasjon ved dialyse mot samme buffer.
- Oppbevar renset merket HerFab ved 4 ° C.
6. SDS-PAGE analyse av Merket HerFab
- Tilsett 5 mL LDS-protein-prøvebuffer inneholdende 106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris-base (pH 8,5), 2% LD, 10% glyserol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM Serva Blå G250, og 0,175 mM fenolrødt til 13 ul rensede merkede HerFab (7,8 uM eller 0,38 mg / ml) i nærvær (+) eller fravær (-) av 2 ul ditiotreitol (DTT, 100 mM sluttkonsentrasjon). Inkuber blandingen ved 95 ° C i 10 min.
- Fest 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel kassett til elektroforese cellen og legger til buffer. Last inn konjugerte protein prøver og pre-farget molekylvekt markør. Utføre gelelektroforese i 35 minutter ved 200 V.
Merk: Hold elektroforese celle i mørket i hele perioden for å minimere foto-bleking av fluorophore. - Etter elektroforese, overføregelen til en fluoriserende gel skanner, og skanning for fluorescens-emisjon ved den aktuelle bølgelengde. For Cy5.5 Bruk Cy5 modus i skannerprogramvaren.
- Flekk gelen med en kommersiell protein flekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien, et antistoff-fragment ble sete-spesifikt konjugert med en fluorofor ved å innlemme et azid-inneholdende aminosyre i fragmentet og omsetning av det muterte antistoff-fragment med en anstrengt cyclooctyne (figur 1). HerFab ble valgt som mål-antistoff-fragment hvori AF ble innlemmet som en azid-inneholdende aminosyre. For å velge residuet i HerFab for utskifting med AF, ble røntgenkrystallstrukturen av HerFab analysert. 30 Viktige krav til residuet inkludere nok avstand fra det antistoff-bindingssetet for å minimere reduksjon i dens bindingsaffinitet og løsningsmidlet tilgjengeligheten for effektiv konjugeringsreaksjonen. Leucin i posisjon 177 var en grei kandidat fordi residuet godt eksponert til utsiden av antistoffet og plassert i nærheten av grenseflaten mellom to immunoglobulin-domener, noe som er fjernt fra det antistoff-bindingssetet.
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 "> I første omgang ble uttrykket plasmid for HerFab med en C-terminal Hans seks -tag konstruert, og en amber kodon ble innført ved posisjon 177 for AF inkorporering av nettstedet -rettet mutagenese. det mutante HerFab innehold AF ble uttrykt i nærvær av 1 mM AF ved ko-uttrykker utviklet tRNA Tyr og aminoacyl-tRNA-syntetase-par. 27 Ni-NTA affinitetsrensing ble utført for de mutante proteinene uttrykt i nærvær og fravær av AF, og den følgende SDS-PAGE-analyse viste at den full-lengde antistoff-fragment ble oppnådd bare i nærvær av AF (figur 2). Deretter mutant antistoff-fragmentet som inneholdt AF ble evaluert for konjugeringsreaksjonen med en Cy5.5 -koblet aza-dibenzocyclooctyne derivatet (Cy5.5-ADIBO). den antistoff-fragment og Cy5.5-ADIBO ble omsatt i en fosfatbuffer i 6 timer, og reaksjonsblandingen ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE i nærvær (+) og fravær (-) DTT (figur 3a). 25 Reaksjonen med en vill-type antistoff-fragment ble også utført og analysert som en kontroll. Fluorescens bildene viste klart konjugering av mutanten antistoff-fragmentet med Cy5.5-ADIBO, mens det ikke ble observert konjugering i reaksjonen med villtype-fragmentet. Elektronspray ionisering massespektrometrisk (ESI-MS) analyse viste kvantitativ konjugering med ingen påvisbar ukonjugert fragment (figur 3b). Samlet viser disse resultater viste at det mutante HerFab holdige AF kan bli effektivt og enkelt konjugert med anstrengt cyclooctynes etter SPAAC uten ytterligere reagens.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av stedsspesifikke antistoff merking av SPAAC.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Ekspresjon av mutant HerFab innehold AF ved posisjon 177 (L177) i nærvær av det utviklet seg tRNA / aars par. Uttrykk for HerFab-L177AF i LB medium som inneholder den utviklet seg tRNA / AFRS par og 1 mM AF. Rensede prøver ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE i nærvær (+) eller fravær (-) av DTT, og gelen ble farget med en kommersiell protein flekk. Figur tilpasset fra Ko, W. et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bøyning reagereion av HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. (A) SDS-PAGE analyse av konjugeringsreaksjon av villtype HerFab og HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. Reaksjonsblandingene ble analysert i nærvær (+) eller fravær (-) av DTT, og proteinbånd ble visualisert ved en kommersiell protein flekk (til venstre) og fluorescens-avbildning (til høyre). (B) ESI-MS analyser av HerFab-L177AF (til venstre) og HerFab-L177AF merket med Cy5.5-ADIBO (høyre): forventet masseforskjell mellom HerFab- L177AF og antistoff = 1190 Da observerte masse forskjell = 1190 Da . Figur tilpasset fra Ko, W. et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den genetiske inkorporering av unaturlige aminosyrer i proteiner har flere fordeler fremfor andre metoder som brukes for proteinmodifisering. 1-3 En av de viktigste fordelene er dens generelle anvendbarhet til noen form for protein. I prinsippet er det ingen begrensninger i valg av et målprotein og et målområde av proteinet. Imidlertid kan utskifting av et strukturelt eller funksjonelt viktig rest med en UAA resultere i endring av struktur og funksjon av målproteinet. Vanligvis er rester som er utsatt for løsemiddel og ikke samhandle med andre rester valgt for inkorporering av UAAs. Derfor er strukturell informasjon fra en høyoppløselig krystallstruktur som brukes for å velge optimale områder for UAA innlemmelse. 30 På grunn av at inkorporering av UAAs er teknisk enkel og krever en enkel mutagenese, kan flere steder lett kan siktes for å velge en optimal rest for en ønsket funksjon av et målprotein. </ P>
I denne protokollen blir AF genetisk inkorporert i et antistoff-fragment, og det mutante fragmentet er sete-spesifikt merket med en fluorofor, ved hjelp av SPAAC. Konjugeringen Utbyttet av denne fremgangsmåte er kvantitativ uten enhver uønsket reaksjon, som er en viktig forbedring i forhold til den tidligere rapport. 25 Dette ble oppnådd ved forsiktig strukturell analyse for valg av et optimalt område, og en økning i reaksjonstiden. Derfor er valget av området for UAA innlemmelse kritisk for rask og kvantitativ konjugering. I tillegg er også viktig for proteinutbytte og inkorporering effektivitet ved bruk av effektive UAA innlemmelse systemer (f.eks pEvol-AFRS). 28
Andre UAAs innlemmet i proteiner ved genetisk inkorporering fremgangsmåte for proteinkonjugering kan også brukes for antistoffet konjugering. 4-11 gjelder reaksjonshastighet, kobber-katalysert cykloaddisjon reaksjon,samt invers elektron-demand Diels-Alder-reaksjon ved anvendelse av tetraziner 8 og anstrengt alkener eller alkyner, vil 7 bli bedre enn det SPAAC brukt i denne studien. Imidlertid krever den kobber-katalyserte cykloaddisjon reaksjon kobber (I) -ionet og ligander, 31 og de aminosyrene til Diels-Alder-reaksjon er ofte syntetisk utfordrende, og ikke stabil nok for kvantitativ konjugering. Keton-hydroksyamin kondens 4 kan også brukes for samme formål. Imidlertid krever det moderat sure betingelser, og dens reaksjonshastighet er lavere enn den for SPAAC. Tatt i betraktning de faktorer som kommersielt og syntetisk tilgjengeligheten av naturlige aminosyrer, reaksjonshastigheten, bio-ortogonalitet, biokompatibilitet av reaksjonsbetingelser, og inkorporering effektivitet av unaturlige aminosyrer, fremgangsmåten for å bruke SPAAC og genetisk innlemmet AF ville være nyttig for å utvikle modifisert terapeutiske proteiner, slik som ADC, samt for generellprotein merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
