Abstract
Der er i øjeblikket mange kemiske værktøjer til rådighed til at indføre kemiske sonder i proteiner til at studere deres struktur og funktion. En nyttig metode er protein konjugering ved genetisk indføre en unaturlig aminosyre indeholdende en bioorthogonal funktionel gruppe. Denne rapport beskriver en detaljeret protokol til site-specifikt antistof konjugation. Protokollen omfatter eksperimentelle detaljer til genetisk inkorporering af et azid-indeholdende aminosyre, og konjugeringsreaktionen ved stamme-fremmet azid-alkyn cycloaddition (SPAAC). Denne stamme-fremmet reaktionen forløber ved simpel blanding af de reagerende molekyler ved fysiologisk pH og temperatur, og kræver ikke yderligere reagenser såsom kobber (I) ioner og kobber-chelaterende ligander. Derfor ville denne fremgangsmåde være nyttig til generel protein konjugering og udvikling af antistof-lægemiddelkonjugater (ADC'er).
Introduction
Da den genetiske inkorporering af p -methoxyphenylalanine i Escherichia coli blev rapporteret, har 1 mere end 100 unaturlige aminosyrer (UAAs) blevet indarbejdet i forskellige proteiner. 1-3 Blandt disse UAAs har de aminosyrer indeholdende bioorthogonal funktionelle grupper blevet grundigt undersøgt og repræsenterer den største andel. De bioorthogonal funktionelle grupper anvendes i UAAs omfatter keton, 4 azid, 5 alkyn, 6 cyclooctyne, 7 tetrazin, 8 α, β-umættede amid, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 og bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Selv om hver funktionel gruppe har sine fordele og ulemper, har azidet-holdige aminosyrer er mest udbredt anvendt for protein konjugering. p -Azidophenylalanine (AF), en af azido-holdige aminosyrer, er let tilgængelige, og dets inkorporering effekiency er fremragende. Mutantproteiner indeholdende denne aminosyre kan omsættes med alkyner af kobber-katalyseret cycloaddition eller med cyclooctynes efter SPAAC. 12-20
For nylig er biopharmaceuticals tiltrukket stor opmærksomhed i den farmaceutiske industri. Den Antistoflægemiddelkonjugat (ADC) er en klasse af terapeutiske antistoffer, der er fordelagtige på grund af deres evne til målrettet terapi til behandling af humane cancere 21 og andre sygdomme. Mere end 50 ADCs er i øjeblikket i kliniske forsøg, og antallet er hastigt stigende. I udvikling af ADC'ere, skal overvejes for at maksimere effektiviteten og minimere bivirkningerne af mange faktorer. Blandt disse faktorer, at en effektiv og stedspecifik konjugering reaktion danner en kovalent binding mellem et antistof og et lægemiddel er kritisk. Den ønskede effektivitet og specificitet i konjugeringsreaktionen kan opnås ved konjugation med en bioorthogonal funktionel gruppe i enunaturlig aminosyre, som er specifikt inkorporeret i et antistof. 22-26 Her rapporterer vi en protokol til site-specifikt indarbejde AF ind et antistoffragment og konjugere det mutante antistoffragment med en biokemisk probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid Construction
- Konstruer et ekspressionsplasmid (pBAD-HerFab-L177TAG), der ville udtrykke målet antistof-genet (pBAD-HerFab-WT) med et His 6 -tag, og erstatte den codon for leucin-177 med den gule codon (TAG) 27, ved hjælp af konventionel site-directed mutagenese teknik.
Se tabel of Materials. - Konstruere en anden ekspressionsplasmidet (pEVOL-AFRS) indeholdende generne for den udviklede tRNA Tyr og aminoacyl-tRNA-syntetase (Aars) par. Brug den specialdesignede plasmidvektoren, pEVOL, til effektiv inkorporering af UAAs. De detaljerede plasmid information og kloning protokoller er beskrevet i den foregående rapport. 28
- Opnå en høj kvalitet plasmid-DNA ved anvendelse af kommercielt tilgængelige plasmid forberedelsesmateriale. Den 260/280 forholdet ~ 1.8 er optimal for det oprensede DNA. Hvis det er nødvendigt, udføre 1% agarosegelelektroforese for at kontrollere renheden af DNA'et.
- elektroporation
- Tilføj hver 1 uL DNA af pEVOL-AFRS 28 og pBAD-HerFab-L177TAG til 20 uL Escherichia coli DH10β stamme. Bland forsigtigt ved hjælp af en pipette. Plasmiderne kan transformeres sammen eller i uafhængige reaktioner.
- For 0,1 cm kuvetter, angive indstillinger elektroporation til 25 uF og 2,5 kV.
- Sæt kuvetten ind i skinnen på den chokerende kammer. Skub glide ind i kammeret, indtil kuvetten gør fast kontakt med kammeret elektroder.
- Pulse gang ved at trykke på knappen puls indtil elektroporation bipper maskinen de.
- Tilsæt 1 ml super optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) medium indeholdende 2% (vægt / volumen) trypton, 0,5% (vægt / volumen) gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2 og 20 mM glucose til kuvetten hurtigt og overføre blandingen til et reagensglas. Inkubér cellerne i 1 time ved 37 ° C under omrystning.
- Spread transformerede E. coli-celler på lysogeni bouillon (LB) agarplader indeholdende passende antibiotika (35 pg / ml chloramphenicol og 100 ug / ml ampicillin til udvælgelse pEVOL-AFRS og pBAD-HerFab-L177TAG henholdsvis). Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 12 timer.
- forberedelse Kultur
- Inokulere en enkelt transformeret koloni i 5 ml LB-medium indeholdende antibiotika. Inkuber i 12 timer ved 37 ° C under omrystning.
3. ekspression og oprensning af HerFab-L177AF
- Ekspression af HerFab-L177AF
- Overfør den primære kultur (5 ml) i 200 ml LB-medium indeholdende ampicillin (100 ug / ml) og AF (1 mM), efterfulgt af inkubation ved 37 ° C under omrystning.
BEMÆRK: 100 mM AF stamopløsning (10 ml) blev fremstillet ved opløsning af 206 mg AF i 100 mM saltsyre (10 ml, slutvolumen). - Tilsættes 2 ml 1,6 M arabinose (16mM slutkoncentration), når kulturen når log-fase (OD550 = 0,8, OD = optisk densitet). Inkuber i 12 timer ved 30 ° C under omrystning.
- Harvest celler ved centrifugering ved 11.000 x g i 5 min. Supernatanten kasseres og fryse pelleten ved -20 ° C.
- Overfør den primære kultur (5 ml) i 200 ml LB-medium indeholdende ampicillin (100 ug / ml) og AF (1 mM), efterfulgt af inkubation ved 37 ° C under omrystning.
- cellelyse
- Resuspender cellepellets i 20 ml periplasmatisk lysisbuffer indeholdende 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% saccharose og 0,2 mg / ml lysozym, og inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C.
- Centrifugeres cellelysatet ved 18.000 xg ved 4 ° C i 15 min. Supernatanten overføres til et frisk rør og kassér pelleten.
- Ni-NTA affinitetskromatografi
- Tilføj Ni-NTA-harpiks suspension til hvert centrifugerør (400 uL harpiks til en 200 ml kultur), og blandes forsigtigt ved 4 ° C i 1 time.
- Hæld suspensionen i en polypropylen-søjle og vaske harpiksen tre gange med 5 ml vask buffer indeholdende 50 mM NaH 2 PO4 (pH 8,0), 20 mM imidazol, og 300 mM NaCl.
- Eluer målantistoffet med 300 pi elueringspuffer indeholdende 50 mM NaH 2 PO4 (pH 8,0), 250 mM imidazol, og 300 mM NaCl.
- Bestem koncentrationen af det mutante protein ved Bradford-proteinassay 29 eller ved at måle absorbansen ved 280 nm. Beregn ekstinktionskoefficienten (75.866 M -1 cm-1) for HerFab-L177AF ved 280 nm ved protein ekstinktionskoefficienten regnemaskine hjælp ekstinktionskoefficienten (2471 M -1 cm-1) for AF.
BEMÆRK: Aminosyresekvensen af HerFab kan findes i NCBI website (GI: 783.282.791 og GI: 783.282.792).
4. Konjugation af renset HerFab-L177AF med Alkyn Probes Brug Strain-forfremmet azid-alkyn Cycloaddition (SPAAC)
- Tilføj 20 pi Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) i H2O (20081; M slutkoncentration) til en opløsning af 10 pi HerFab-L177AF (10 uM slutkoncentration) i phosphatbuffer indeholdende 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) og 100 mM NaCl.
BEMÆRK: Som alternativer difluorinated cyclooctyne (DIFO) og bicyclo [6.1.0] nonyne (BCN) derivater er også tilgængelige for det samme program. - Tillad stammen-fremmet cycloaddition reaktionen forløbe i 6 timer ved 37 ° C. Hvis der anvendes en lysfølsom probe (f.eks Cy5.5), dække reaktionsbeholderen med aluminiumsfolie.
- Oprens den mærkede HerFab ifølge trin 5.
5. Oprensning af mærkede HerFab
- Der tilsættes 500 pi af prøven til en centrifugal filter spin-kolonne.
- Centrifugeres spin kolonne ved 14.000 xg ved 4 ° C i 15 min.
- Kassér gennemstrømning og overførsel oprenset prøve fra spinkolonne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Som et alternativ til trin 5.1- 5.3, udføre rensningsmedietion ved dialyse mod den samme buffer.
- Opbevar oprenset mærket HerFab ved 4 ° C.
6. SDS-PAGE analyse af mærket HerFab
- Tilsæt 5 pi LDS protein prøvebuffer indeholdende 106 mM Tris · HCI, 141 mM Tris-base (pH 8,5), 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blå G250, og 0,175 mM phenolrødt til 13 pi oprenset mærket HerFab (7,8 uM eller 0,38 mg / ml) i nærvær (+) eller fravær (-) af 2 pi dithiothreitol (DTT, 100 mM slutkoncentration). Inkuber blandingen ved 95 ° C i 10 min.
- Fastgør 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-gel kassette til elektroforese celle og tilføje løbende buffer. Indlæse de konjugerede proteinprøver og præ-farvede molekylvægtmarkør. Udføre gelelektroforese i 35 min ved 200 V.
Bemærk: Hold elektroforese celle i mørke i hele perioden for at minimere foto-blegning af fluoroforen. - Efter elektroforese overføresgelen til en fluorescerende gel scanner, og scanne for fluorescensemission ved den passende bølgelængde. For Cy5.5 bruge Cy5 mode i scannersoftwaren.
- Farv gelen med en kommerciel protein plet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse et antistoffragment var stedspecifikt konjugeret med en fluorofor ved at inkorporere et azid-indeholdende aminosyre i fragmentet og omsætning af mutant antistoffragment med en anstrengt cyclooctyne (figur 1). HerFab blev valgt som mål-antistoffragment, hvori AF blev inkorporeret som et azid-indeholdende aminosyre. For at vælge resten i HerFab til udskiftning med AF, blev X-ray krystalstruktur HerFab analyseret. 30 Vigtige krav til remanensen indbefatter tilstrækkelig afstand fra antistofbindingsstedet at minimere faldet i dets bindingsaffinitet og solvens tilgængelighed for effektiv konjugering reaktion. Leucin ved position 177 var en udmærket kandidat fordi remanensen godt eksponeret for ydersiden af antistoffet og placeret nær grænsefladen mellem to immunglobulindomæner, som er fjernt fra antistofbindingsstedet.
indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 "> I første omgang blev ekspressionsplasmid for HerFab med en C-terminal His 6 -tag konstrueret, og en amber codon blev indført ved position 177 AF-inkorporering af webstedet -dirigerede mutagenese. mutanten HerFab indeholdende aF blev udtrykt i nærvær af 1 mM aF ved co-udtrykkende den udviklede tRNA Tyr og aminoacyl-tRNA-syntetase par. 27 Ni-NTA affinitetsoprensning blev udført for de mutante proteiner udtrykt i nærvær og fravær af aF, og følgende SDS-PAGE-analyse viste, at antistoffragmentet fuld længde kun blev opnået i nærvær af aF (figur 2). Dernæst mutanten antistoffragmentet indeholdende aF blev evalueret for konjugering reaktion med en Cy5.5 -bundet aza-dibenzocyclooctyne derivat (Cy5.5-ADIBO). antistoffragmentet og Cy5.5-ADIBO blev omsat i en phosphatpuffer i 6 timer, og reaktionsblandingen blev analyseret ved SDS-PAGE i nærvær (+) og fravær (-) Af DTT (figur 3a). 25 Reaktionen med en vildtype antistoffragment blev også udført og analyseret som kontrol. De fluorescens billeder viste tydeligt konjugation af mutant antistoffragment med Cy5.5-ADIBO, mens ingen konjugation blev observeret i reaktionen med vildtype-fragmentet. Elektron ionisering massespektrometrisk (ESI-MS) analyse viste kvantitativ konjugering uden påviselig ukonjugeret fragment (figur 3b). Generelt set viste disse resultater, at mutant HerFab indeholdende AF kan være effektivt og bekvemt konjugeret med belastede cyclooctynes efter SPAAC uden yderligere reagens.
Figur 1: Skematisk illustration af site-specifikt antistof mærkning af SPAAC.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ekspression af mutant HerFab indeholdende AF i position 177 (L177) i nærvær af den udviklede tRNA / Aars par. Ekspression af HerFab-L177AF i LB-medium indeholdende den udviklede tRNA / AFRS pair og 1 mM AF. Oprensede prøver blev analyseret ved SDS-PAGE i nærvær (+) eller fravær (-) af DTT, og gelen blev farvet med et kommercielt protein plet. Figur tilpasset fra Ko, W. et al. 27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konjugation reagereion of HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. (A) SDS-PAGE-analyse af konjugationsreaktionen af vildtype HerFab og HerFab-L177AF med Cy5.5-ADIBO. Reaktionsblandingerne blev analyseret i nærvær (+) og fravær (-) af DTT og proteinbånd blev visualiseret ved en kommerciel protein plet (venstre) og fluorescensimagografi (højre). (B) ESI-MS analyser af HerFab-L177AF (til venstre) og HerFab-L177AF mærket med Cy5.5-ADIBO (til højre): forventede masse forskel mellem HerFab- L177AF og det konjugerede antistof = 1190 Da, observerede masse forskel = 1190 Da . Figur tilpasset fra Ko, W. et al. 27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den genetiske inkorporering af unaturlige aminosyrer i proteiner har adskillige fordele frem for andre metoder, der anvendes for protein modifikation. 1-3 En af de vigtige fordele er dens generelle anvendelighed til nogen form for protein. I princippet er der ingen begrænsning i at vælge et målprotein og et målområde af proteinet. udskiftning af et strukturelt eller funktionelt vigtige rest med en ULA, kan dog resultere i at ændre strukturen og funktionen af målproteinet. Generelt er rester, der er udsat for opløsningsmiddel og ikke interagerer med andre rester valgt til inkorporering af UAAs. Derfor er strukturel information fra en høj opløsning krystalstruktur anvendt til at vælge optimale steder for UAA inkorporering. 30 Da inkorporeringen af UAAs er teknisk let og kræver en simpel mutagenese, kan flere steder let screenes for at udvælge en optimal rest for en ønsket funktion af et målprotein. </ P>
I denne protokol, er AF genetisk inkorporeret i et antistof fragment, og mutant-fragmentet er site-specifikt mærket med en fluorofor, hjælp SPAAC. Konjugeringen Udbyttet af denne metode er kvantitativ uden nogen uønsket reaktion, som er en vigtig forbedring i forhold til den foregående rapport. 25 Dette blev opnået ved omhyggelig strukturanalyse for at udvælge en optimal websted og en forøgelse af reaktionstiden. Derfor er valget af stedet for UAA inkorporering er kritisk for hurtig og kvantitativ konjugering. Desuden er anvendelsen af effektive ULA inkorporering systemer (f.eks pEvol-AFRS) er også kritisk for udbyttet protein og inkorporering effektivitet. 28
Andre UAAs inkorporeres i proteiner ved genetisk inkorporering fremgangsmåde til protein konjugering kan også anvendes til antistofkonjugering. 4-11 Med hensyn til reaktionshastighed, kobber-katalyseret cycloaddition reaktion,samt inverse elektron-demand Diels-Alder-reaktion ved anvendelse tetraziner 8 og anstrengt alkener eller alkyner, vil 7 være bedre end den SPAAC anvendt i denne undersøgelse. Imidlertid kobber-katalyserede cycloaddition reaktion kræver kobber (I) ion og ligander, 31 og aminosyrerne for Diels-Alder-reaktionen er ofte syntetisk udfordrende, og ikke tilstrækkelig stabil til kvantitativ konjugering,. Keton-hydroxyamin kondens 4 kan også bruges til samme formål. Men det kræver, moderat sure betingelser, og dens reaktionshastighed er langsommere end den SPAAC. I betragtning af de faktorer såsom kommercielt og syntetisk tilgængelighed af unaturlige aminosyrer, reaktionshastigheden, bio-ortogonalitet, biokompatibilitet reaktionsbetingelser og inkorporering effektivitet unaturlige aminosyrer, fremgangsmåden til anvendelse SPAAC og genetisk inkorporeret AF ville være nyttige til at udvikle modificerede terapeutiske proteiner, såsom ADCs, såvel som for den almeneprotein mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
