Abstract
Есть в настоящее время многие химические инструменты, доступные для введения химических зондов в белки, чтобы изучить их структуру и функцию. Полезный метод белка конъюгации с помощью методов генной введением искусственную аминокислоту, содержащую bioorthogonal функциональную группу. В настоящем докладе описывается подробный протокол для сайт-специфической конъюгации антитела. Протокол включает экспериментальные данные для генетического включения азида, содержащего аминокислоты, а также реакции конъюгации штаммом раскрученной азид-алкиновая циклоприсоединения (SPAAC). Этот штамм раскрученной реакция протекает путем простого смешивания реагирующих молекул при физиологическом рН и температуры, а также не требует дополнительных реагентов, таких как медь (I) и ионов меди хелатирующих лигандов. Таким образом, этот метод был бы полезен для общего конъюгации белка и развития Конъюгаты антител с наркотиками (АЦП).
Introduction
Поскольку генетическое включение р -methoxyphenylalanine в кишечной палочки сообщалось, 1 более 100 ненатуральные аминокислоты (УААН) были успешно включены в различные белки. 1-3 Среди этих УААН, аминокислоты , содержащие bioorthogonal функциональные группы были тщательно изучены и представляют собой самую большую долю. В bioorthogonal функциональные группы , используемые в UAAS включают кетон, 4, 5 азид алкина, 6, 7 cyclooctyne тетразин, 8 a, b-ненасыщенного амида, 9, 10 norbonene transcyclooctene, 11 и бицикло [6.1.0] -nonyne. 11 Хотя каждая функциональная группа имеет свои преимущества и недостатки, азида содержащих аминокислоты наиболее широко используются для белка сопряжения. р -Azidophenylalanine (АФ), один из азидо , содержащих аминокислоты, легко доступен, и его введение efficiency отлично. Мутантные белки, содержащие эту аминокислоту можно вводить в реакцию с медью алкинов, катализируемых циклоприсоединения или с cyclooctynes по SPAAC. 12-20
В последнее время биофармацевтических привлекают большое внимание в фармацевтической промышленности. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) , является класс терапевтических антител, которые выгодно из - за их способности к целенаправленной терапии для лечения рака у человека 21 и других заболеваний. Более 50 АЦП в настоящее время в клинических испытаниях, и их число быстро растет. В разработке АЦП, многие факторы необходимо учитывать, чтобы максимизировать эффективность и свести к минимуму побочные эффекты. Среди этих факторов, эффективный и сайт-специфической реакции конъюгации с образованием ковалентной связи между антителом и лекарственное средство имеет решающее значение. Требуемая эффективность и специфичность в реакции конъюгации может быть достигнуто путем конъюгации с bioorthogonal функциональной группой вискусственную аминокислоту, которая специфически включена в антитело. 22-26 Здесь мы сообщаем протокол к сайту, в частности , включают АФ в фрагмента антитела и сопряжем фрагмент мутантного антитела с биохимической зондом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Плазмиду Строительство
- Построить выражение плазмиды (pBAD-HerFab-L177TAG) , которая выражала бы ген целевого антитела (pBAD-HerFab-WT) с его 6 в тег, и заменить кодон лейцина-177 с янтарным кодона (TAG) 27, с использованием обычный сайт-направленный мутагенез метод.
Таблицу материалов. - Построить еще одно выражение плазмиды (pEVOL-AFRs) , содержащий гены проэволюционировавшего тРНК Тир и аминоацил-тРНК - синтетазы пары (AARS). Используйте специально разработанные плазмиды вектор, pEVOL, для эффективного включения УААН. Подробные плазмида информационные и клонированию протоколы описаны в предыдущем сообщении. 28
- Получение плазмидной ДНК высокого качества с использованием коммерчески доступных наборов препарата плазмидной. Отношение ~ 1,8 260/280 является оптимальной для очищенной ДНК. При необходимости, выполнить 1% агарозном геле с целью проверки чистоты ДНК.
- Электропорация
- Добавьте каждый 1 мкл ДНК pEVOL-AFRs 28 и pBAD-HerFab-L177TAG до 20 мкл кишечной палочки штамма DH10β. Осторожно перемешать, с помощью пипетки. Плазмиды могут быть трансформированы совместно или в независимых реакций.
- Для 0,1 см кюветах, установить параметры электропорации до 25 мкФ и 2,5 кВ.
- Вставьте кювету в скольжении шокирующей камеры. Вставьте слайд в камеру, пока кювета не имеет плотного контакта с электродами камеры.
- Pulse один раз, нажимая на кнопку импульсного режима до электропорации сигналов аппарата.
- Добавить 1 мл супер оптимальный бульон с катаболитной репрессии (СОК) среды , содержащей 2% (вес / объем) триптона, 0,5% (вес / объем) дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы в кювету и быстро вводить смесь в пробирку. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании.
- Spread трансформировали клетки E.coli на лизогении бульона (LB) агаром , содержащих соответствующие антибиотики (35 мкг / мл хлорамфеникола и 100 мкг / мл ампициллина для выбора pEVOL-AFRs и pBAD-HerFab-L177TAG, соответственно). Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 12 часов.
- подготовка Культура
- Инокулируйте одного преобразованного колонию в 5 мл LB-среде, содержащей антибиотики. Инкубируют в течение 12 часов при 37 ° C при встряхивании.
3. Экспрессия и очистка HerFab-L177AF
- Выражение HerFab-L177AF
- Передача первичной культуры (5 мл) в 200 мл LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и автофокусировка (1 мМ), с последующей инкубацией при 37 ° C при встряхивании.
Примечание: 100 мМ АФ маточный раствор (10 мл) получали путем растворения 206 мг AF в 100 мМ соляной кислотой (10 мл, конечный объем). - Добавляют 2 мл 1,6 М арабинозы (16конечная концентрация мМ) , когда культура достигает лог-фазы (OD 550 = 0,8, OD = оптическая плотность). Инкубируют в течение 12 ч при 30 ° C при встряхивании.
- Урожай клеток путем центрифугирования при 11000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и заморозить осадок при -20 ° С.
- Передача первичной культуры (5 мл) в 200 мл LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и автофокусировка (1 мМ), с последующей инкубацией при 37 ° C при встряхивании.
- лизис клеток
- Ресуспендируют гранул клеток в 20 мл буфера для лизиса периплазматический, содержащего 30 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 20% сахарозы и 0,2 мг / мл лизоцима, и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С.
- Центрифуга Клеточный лизат при 18000 х г при 4 ° С в течение 15 мин. Передача супернатант в новую пробирку и отбросить осадок.
- Аффинной хроматографии с Ni-NTA
- Добавить смолы подвеска Ni-NTA на каждую центрифужную пробирку (400 мкл смолы на 200 мл культуры), и осторожно перемешивают при температуре 4 ° С в течение 1 ч.
- Налейте суспензии в колонну полипропилена и промывают смолу три раза 5 мл промывных бушельffer , содержащий 50 мМ NaH 2 PO 4 (рН 8,0), 20 мМ имидазола и 300 мМ NaCl.
- Элюции целевого антитела по 300 мкл буфера для элюции , содержащим 50 мМ NaH 2 PO 4 (рН 8,0), 250 мМ имидазола и 300 мМ NaCl.
- Определить концентрацию мутантного белка с помощью анализа Брэдфорда 29 или путем измерения оптической плотности при 280 нм. Вычислить коэффициент экстинкции (75866 М -1 см -1) для HerFab-L177AF при 280 нм с помощью белка коэффициент экстинкции калькулятора с использованием коэффициента экстинкции (2,471 М -1 см -1) для AF.
Примечание: последовательность аминокислот HerFab можно найти на сайте NCBI (GI: 783282791 и GI: 783282792).
4. Сопряжение Очищенный HerFab-L177AF с алкине Зонды Использование Strain раскрученной азид-алкиновая циклоприсоединения (SPAAC)
- Добавьте 20 мкл Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) в H 2 O (20081; конечная концентрация М) к раствору 10 мкл HerFab-L177AF (10 мкМ конечная концентрация) в фосфатном буфере , содержащем 10 мМ Na 2 HPO 4 (рН 7,0) и 100 мМ NaCl.
Примечание: В качестве альтернативы, difluorinated cyclooctyne (DIFO) и бицикло [6.1.0] нонин (BCN) производные также доступны для того же приложения. - Дайте штамм раскрученной реакцию циклоприсоединения проводят в течение 6 ч при 37 ° С. Если светочувствительный датчик (например, Cy5.5) используется, накройте реакционный сосуд с алюминиевой фольгой.
- Очищают меченого HerFab в соответствии со стадией 5.
5. Очистка меченого HerFab
- Добавьте 500 мкл образца к центробежному фильтр ротационную колонку.
- Центрифуга колонку спиновый при 14000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин.
- Выбросить проскок и передачи очищенного образца из ротационную колонку в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- В качестве альтернативы этапу 5.1- 5.3, выполнить purificaции путем диализа против того же самого буфера.
- Хранить очищенный меченый HerFab при температуре 4 ° С.
6. SDS-PAGE анализ меченых HerFab
- Добавьте 5 мкл LDS образец белка буфера, содержащего 106 мМ Трис & bull; HCl, 141 мМ Трис-основание (рН 8,5), 2% LDS, 10% глицерине, 0,51 мМ ЭДТА, 0,22 мМ СЕРВА Синий G250, а красный 0,175 мМ фенол до 13 мкл очищенный меченый HerFab (7,8 мкМ или 0,38 мг / мл) в присутствии (+) или отсутствие (-) 2 мкл дитиотреитола (ДТТ, 100 мМ конечная концентрация). Выдержите смесь при температуре 95 ° С в течение 10 мин.
- Прикрепите 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE гель кассету в электрофорез ячейку и добавить буфер работает. Загрузите конъюгированные образцы белка и предварительно окрашенную маркер молекулярного веса. Выполните гель-электрофореза в течение 35 мин при 200 В.
Примечание: Держите ячейку электрофорез в темноте в течение всего периода, чтобы свести к минимуму фото-отбеливание флуорофора. - После электрофореза передачигель для флуоресцентного сканера гель, и сканирование для флуоресцентного излучения на соответствующей длине волны. Для Cy5.5, используйте режим Cy5 в программном обеспечении сканера.
- Пятно гель с коммерческим пятном белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, фрагмент антитела был сайт-специфически конъюгирован с флуорофором путем введения азида содержащего аминокислоты в фрагмент и взаимодействие фрагмента мутантного антитела с напряженными cyclooctyne (Рисунок 1). HerFab был выбран в качестве фрагмента антитела мишень, в которую А. Ф. был включен в качестве азида содержащих аминокислоты. Для того, чтобы выбрать остаток в HerFab для замены с ФП, анализировалась рентгеновская кристаллическая структура HerFab. 30 Важные требования к остатку включают достаточное расстояние от участка связывания антител , чтобы минимизировать снижение его сродства связывания и доступности растворителя для эффективной реакции конъюгации. Лейцин в положении 177 было достойного кандидата, так как остаток хорошо подвергается воздействию извне антитела и находится вблизи границы раздела двух областей иммуноглобулина, которая удалена от сайта связывания антител.
Содержание "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Изначально выражение плазмида для HerFab с С-концевой His 6 -tag был построен, и янтарный кодон был введен в положении 177 для включения автофокусировки сайта -directed мутагенеза. было высказано мутант HerFab , содержащий AF в присутствии 1 мМ AF по коэкспрессирующей проэволюционировавшего тРНК Tyr и аминоацил-тРНК - синтетазы пары. 27 аффинной очистки Ni-NTA проводили для мутантных белков , экспрессированных в присутствии и отсутствие AF, и последующего анализа в SDS-PAGE показал , что фрагмент антитела полной длины был получен только в присутствии AF (рисунок 2). Затем фрагмент мутантного антитела , содержащий AF оценивали по реакции конъюгации с Cy5.5 -связанной производное аза-dibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO). фрагмент антитела и Cy5.5-ADIBO подвергали взаимодействию в фосфатном буфере в течение 6 часов, и реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии (+) и отсутствие (-) ДТТ (рисунок 3а). 25 Реакция с фрагментом дикого типа антитела также проведены и проанализированы в качестве контроля. Флуоресцентные изображения ясно показали конъюгации фрагмента мутантного антитела с Cy5.5-ADIBO, в то время как не конъюгация не наблюдалось в реакции с фрагментом дикого типа. Спрей ионизации Анализ методом электронного масс - спектрометрии (ESI-МС) показал количественный спряжения без заметного неконъюгированного фрагмента (рис 3b). В целом, эти результаты показали, что мутант HerFab, содержащий AF может быть эффективно и удобно, конъюгированного с напряженными cyclooctynes по SPAAC без какого-либо дополнительного реагента.
Рисунок 1: Схематическое изображение сайт-специфической маркировки антител по SPAAC.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Экспрессия мутантной HerFab , содержащий AF в положении 177 (L177) в присутствии проэволюционировавшего пары т - РНК / Аарс. Выражение HerFab-L177AF в LB среде, содержащей эволюционировали тРНК / AFRs пары и 1 мМ AF. Очищенные образцы анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии (+) или отсутствие (-) ДТТ, а гель окрашивали с коммерческим пятном белка. Рисунок адаптирован из Ko, W. и др. 27. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сопряжение реагируютион HerFab-L177AF с Cy5.5-ADIBO. (А) анализ SDS-PAGE конъюгации реакции дикого типа HerFab и HerFab-L177AF с Cy5.5-ADIBO. Реакционные смеси анализируют в присутствии (+) и отсутствии (-) ДТТ, и белковые полосы визуализируют с помощью коммерческого пятна белка (слева) и флуоресцентной томографии (справа). (Б) ESI-МС анализ HerFab-L177AF (слева) и HerFab-L177AF , помеченный Cy5.5-ADIBO (справа): Ожидаемая масса разница между HerFab- L177AF и конъюгированного антитела = 1190 Da, наблюдаемая масса разница = 1,190 Da , Рисунок адаптирован из Ko, W. и др. 27. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генетическое введение неприродных аминокислот в белки имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами, используемыми для модификации белков. 1-3 Одним из важных преимуществ является его общая применимость к любому виду белка. В принципе, нет никаких ограничений в выборе целевого белка и целевой сайт белка. Тем не менее, замена структурно или функционально важных остатков с UAA может привести к изменению структуры и функции белка-мишени. Как правило, остатки, которые подвергаются воздействию растворителей и не взаимодействуют с другими остатками выбраны для включения УААН. Таким образом, структурная информация из кристаллической структуры с высокой разрешающей способностью используется для того, чтобы выбрать оптимальные места для UAA инкорпорации. 30 Поскольку включение УААН является технически простым и требует простого мутагенеза, множественные сайты могут быть легко экранированы , чтобы выбрать оптимальный остаток для желаемой функции белка - мишени. </ Р>
В этом протоколе, АФ генетически включены в фрагмент антитела, и мутантный фрагмент является сайт-специфически метят флуорофором, используя SPAAC. Выход конъюгации этого метода является количественное без каких-либо нежелательных реакций, что является важным шагом вперед по сравнению с предыдущим отчета. 25 Это было достигнуто за счет тщательного структурного анализа для выбора оптимального сайта и увеличение времени реакции. Таким образом, выбор площадки для UAA включения имеет решающее значение для быстрого и количественного конъюгации. Кроме того, использование эффективных систем ААУ инкорпорации (например, pEvol-AFRs) также имеет важное значение для выходу протеина и эффективности инвазии . 28
Другие UAAS включены в белки с помощью генетического метода инкорпорации для белка конъюгации также может быть использован для сопряжения антител. 4-11 С точки зрения скорости реакции, медь катализируемой реакции циклоприсоединения,а также обратный электрон-спроса реакции Дильса-Альдера с использованием тетразины 8 и деформированные алкены или алкины, 7 будет лучше , чем SPAAC используемые в данном исследовании. Тем не менее, медь-катализируемой реакции циклоприсоединения требует меди (I) ион и лиганды, 31 и аминокислоты для реакции Дильса-Альдера являются часто синтетически сложной задачей, и не достаточно стабильной для количественного сопряжения. Кетон-гидроксиламина конденсации 4 также можно использовать для той же цели. Тем не менее, она требует умеренно кислых условиях, и его скорость реакции происходит медленнее, чем у SPAAC. Учитывая такие факторы, как коммерческой и синтетической доступности неестественных аминокислот, скорость реакции, био-ортогональности, биосовместимость условий реакции, и эффективность включения неприродных аминокислот, метод с использованием SPAAC и генетически заложенная AF будет полезен для разработки модифицированного терапевтические белки, такие как АЦП, а также для общегобелок маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
