Abstract
kendi yapısını ve fonksiyonunu incelemek için proteinlere kimyasal sondaları tanıtmak için mevcut şu anda birçok kimyasal araç vardır. Faydalı bir yöntem, genetik olarak bioorthogonal fonksiyonel grubu ihtiva eden bir doğal olmayan amino asidin sokulması protein konjugasyon olup. Bu rapor, site-spesifik bir antikor konjugasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır. protokol bir azid içeren amino asitin genetik dahil, ve zorlanma-terfi azid-alkin siklo (SPAAC) tarafından konjugasyon reaksiyonu için deneysel ayrıntıları içerir. Bu soy-destekli Reaksiyon fizyolojik pH ve sıcaklıkta reaksiyona moleküllerin basit karıştırma ile ilerler ve bakır (I) 'iyonları ve bakır kenetleme ligandlar olarak ilave reaktifler gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem, genel protein konjugasyon ve antikor ilaç konjugatları (ADC) geliştirilmesi için yararlı olabilecektir.
Introduction
Escherichia coli içinde bir p -methoxyphenylalanine genetik dahil belirtildikten sonra, 1 100'den doğal olmayan amino asitler (UAA'lar) başarılı bir şekilde çeşitli proteinlerin dahil edilmiştir. Bu UAAS arasında 1-3, bioorthogonal fonksiyonel grupları içeren amino asitler yoğun çalışılan ve büyük oranını temsil edilmiştir. UAAS kullanılan bioorthogonal fonksiyonel gruplar, keton, 4 azit 5 alkin, 6 sikloostin, 7 tetrazin, 8 α, β-doymamış bir amid, 9 norbonen, 10 transcyclooctene, 11 ve bisiklo [6.1.0] -nonyne bulunmaktadır. Her fonksiyonel grubun avantajları ve dezavantajları vardır 11 da, azid ihtiva eden amino asitler en yaygın protein konjugasyon için kullanılmıştır. p -Azidophenylalanine (AF), azido-içeren amino asitler bir, hali hazırda mevcuttur, ve dahil efficiency mükemmel. Bu amino asidi içeren mutant proteinler bakır katalitik siklo veya SPAAC göre cyclooctynes sahip alkinler ile reaksiyona sokulabilir. 12-20
Son zamanlarda, biopharmaceuticals ilaç endüstrisinde büyük ilgi çekmiştir. Antikor-ilaç konjugatı (ADC) bağlı insan kanserlerinin 21 ve tedavisi için hedeflenen bir tedavi için kabiliyetleri de avantajlı terapötik bir antikor sınıfı diğer hastalıklar. 50'den fazla ADC klinik çalışmalarda şu anda, ve sayısı hızla artmaktadır. ADC'ler geliştirilmesinde birçok faktör etkinliğini en üst düzeye çıkarmak ve yan etkileri en aza indirmek için dikkate alınması gerekir. Bu faktörler arasında, etkin ve yere-özgü konjugasyonu reaksiyonu, bir antikor arasında bir kovalent bağ oluşturmak üzere bir ilacın önemlidir. Konjugasyon reaksiyonu istenen etkinlik ve spesifikliği, bir bir bioorthogonal fonksiyonel grup ile konjugasyon ile elde edilebilirözellikle, bir antikor içine dahil edilir, doğal olmayan bir amino asit. Burada 22-26, biz bir protokol rapor sitenin spesifik dahil bir antikor fragmanına AF biyokimyasal prob mutant antikor fragmanı konjuge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid Yapı
- Bir His 6 Etiketleme-hedef antikor geni (pBAD-HerFab-WT) ifade edecek bir ifade plazmid (pBAD-HerFab-L177TAG) Construct ve kehribar kodonu ile lösin-177 için kodonu replace (TAG) 27 kullanılarak konvansiyonel saha-yönlendirilmiş mutagenez tekniği.
Malzemelerin Tablo bakın. - Gelişti tRNA Tyr ve aminoasil-tRNA sentetaz (Aars) çifti için genleri içeren başka bir ifade plazmid (pEVOL-AFRS) Construct. UAAS etkin dahil edilmesi için özel olarak tasarlanmış plazmid vektörü, pEVOL kullanın. Ayrıntılı plazmid bilgi ve klonlama protokolleri önceki raporda açıklanmıştır. 28
- ticari olarak temin edilebilen bir plazmid hazırlama kiti kullanılarak, yüksek kaliteli plazmid DNA elde. ~ 1.8 260/280 oranı saflaştırılmış DNA için en uygunudur. Gerekirse DNA saflığını kontrol etmek için% 1 agaroz jel elektroforez gerçekleştirin.
- elektroporasyon
- 20 uL E. coli DH10β suşuna pEVOL-AFRS 28 ve pBAD-HerFab-L177TAG her 1 ul DNA ekleyin. bir pipet kullanılarak, yavaşça karıştırın. plazmidler birlikte ya da bağımsız reaksiyonlarda transforme edilebilir.
- 0.1 cm küvetler için, 25 iF ve 2.5 kV elektroporasyon ayarlarını.
- şok odasının slayt içine küvet yerleştirin. Küvet odası elektrotlar ile sıkı temas edene kadar odasına slayt itin.
- elektroporasyon makinesi bip sesi gelene kadar darbe düğmesine basarak bir kez Pulse.
- Katabolik baskı (SOC) ortamı maya ekstresi, 10 mM NaCI, 2.5 mM KCI (ağ / hac) trıpton,% 0.5 (w / v), 10 mM MgCI2,% 2 ihtiva eden 1 mL Süper uygun suyu, ve 20 mM glukoz ekleme hızlı küvete ve bir test tüpüne karışımı aktarın. çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe hücreleri.
- (PEVOL-AFRS sırasıyla pBAD-HerFab-L177TAG, seçilmesi için 35 ug / ml kloramfenikol ve 100 ug / ml ampisilin) uygun antibiyotikleri içeren agar plakaları lizojeni etsuyu (LB) üzerine yayıldı transforme E. coli hücreleri. 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Kültür hazırlama
- 5 ml LB ortamı içeren antibiyotiklere tek bir dönüştürülmüş koloni inoküle. çalkalanarak 37 ° C'de 12 saat boyunca inkübe edilir.
3. Ekspresyon ve HerFab-L177AF saflaştırılması
- HerFab-L177AF sentezlenmesi
- 200 ml LB ortamı ihtiva ampisilin içine primer kültürünün (5 mi) transfer (100 ug / ml) ve AF (1 mM), çalkalanarak 37 ° C'de kuluçkalandı.
Not: 100 mm AF stok çözeltisi (10 mL), 100 mM hidroklorik asit (10 mL, nihai hacim) 206 mg AF çözülmesiyle hazırlanmıştır. - (16 1.6 M arabinoz 2 mL ekleyinKültür log-faz (OD 550 = 0.8 OD = optik yoğunluk) ulaşır mM son konsantrasyon). çalkalama ile 30 ° C'de 12 saat boyunca inkübe edilir.
- 5 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri. Süpernatantı atın ve -20 ° C'de pelet dondurmak.
- 200 ml LB ortamı ihtiva ampisilin içine primer kültürünün (5 mi) transfer (100 ug / ml) ve AF (1 mM), çalkalanarak 37 ° C'de kuluçkalandı.
- Hücre liziz
- 30 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA,% 20 sakroz ve 0.2 mg / ml lisozim içeren 20 mi periplazmik liziz tamponunda yeniden süspanse hücre pelletleri, 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe karışımı.
- 15 dakika boyunca 4 ° C'de 18.000 x g'de hücre lizat santrifüjleyin. yeni bir tüp süpernatant aktarın ve pelet atın.
- Ni-NTA afinite kromatografisi
- Her bir santrifüj tüpüne (200 ml kültür, 400 uL reçine) Ni-NTA reçine süspansiyonu ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C'de nazik bir şekilde karıştırılır.
- polipropilen sütuna süspansiyon dökün ve 5 ml yıkama met ile reçineyi üç defa yıkamakffer 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 20 mM imidazol, 300 mM NaCl içeren.
- 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 250 mM imidazol, 300 mM NaCI ihtiva eden 300 uL yıkama tamponu ile hedef antikor yıkayın.
- Bradford protein deneyi 29 ya da 280 nm'de absorbans ölçülerek mutan protein konsantrasyonunu belirleyin. Sönüm katsayısı (2,471 M -1 cm -1) AF kullanarak protein söndürme katsayısı hesap makinesi tarafından 280 nm'de HerFab-L177AF için sönüm katsayısı (75866 M -1 cm -1) hesaplayın.
Not: HerFab amino asit sekans, NCBI web sitesinde bulunabilir (Gl: 783282791 ve GI: 783.282.792) olabilir.
Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma kullanma Alkin Sondalar ile Saf HerFab-L177AF 4. Konjugasyon (SPAAC)
- (H 2 O 200 Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) 20 mcL ekleyin81; 10 mM Na-2 HPO 4 (pH 7.0) ve 100 mM NaCl ihtiva eden fosfat tamponu içinde HerFab-L177AF 10 uL (10 uM son konsantrasyon) solüsyonuna M nihai konsantrasyon).
NOT: alternatifler, diflorine sikloostin (Difo) ve bisiklo gibi [6.1.0] nonyne (BCN) türevleri ayrıca aynı uygulama için kullanılabilir. - suşa teşvik siklo-ilave reaksiyonu, 37 ° C'de 6 saat devam etmesine izin verir. Işığa duyarlı bir prob (örneğin, Cy5.5) kullanılırsa, alüminyum folyo ile reaksiyon bölmesi kapağı.
- Adım 5'e göre etiketlenmiş HerFab arındırın.
Etiketli HerFab 5. saflaştırılması
- Bir santrifüj filtre döndürme kolonuna numune 500 ul ekle.
- 15 dakika boyunca 4 ° C'de 14,000 x g'de spin kolon santrifüjleyin.
- Sil akış ve transfer 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne spin kolon numuneyi saflaştırılmıştır.
- Alternatif bir 5,1- 5.3 adım olarak, arıtma için yerineaynı tampona karşı diyaliz ile tion.
- 4 ° C'de arıtılmış, etiketli HerFab saklayın.
Etiketli HerFab 6. SDS-PAGE analizi
- 106 mM Tris-HCI, 141 mM Tris bazı (pH 8.5),% 2 LDS,% 10 gliserol, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Mavi G250 ve 13 uL kırmızı 0.175 mM fenol ihtiva eden 5 uL LDS proteini örnek tamponu ekleme varlığı (+) veya yokluğunda HerFab (7.8 uM veya 0.38 mg / ml) olarak tanımlanan saflaştırılmış (-) 2 uL ditiotreitol (DTT, 100 mM nihai konsantrasyon). 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe karışımı.
- Elektroforez hücreye% 4-12 Bis-Tris, SDS-PAGE jeli kaseti takın ve çalışan tampon ekleyin. birleşik protein örnekleri ve Önceden boyanmış molekül ağırlığı işaretleyici yükleyin. 200 V 35 dakika boyunca jel elektroforezi gerçekleştirin
Not: fluorofor fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için tüm dönem boyunca karanlıkta elektroforez hücresi tutun. - Elektroforezisten sonra, aktarmaBir floresan jel tarayıcıya jel ve uygun dalga boyunda floresan emisyonu için tarayın. Cy5.5 için tarayıcı yazılımı Cy5 modunu kullanın.
- ticari bir protein boyası ile jel Leke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, bir antikor parçası örneğin bir bölgeye özel fragmanına bir azid ihtiva eden amino asit içeren ve gergin sikloostin mutant antikor fragmanının reaksiyona sokulmasıyla bir florofor ile konjuge (Şekil 1). HerFab AF bir azid ihtiva eden amino asit dahil edildiği içine hedef antikor fragmanı olarak seçilmiştir. AF değiştirilmesi için HerFab kalıntı seçmek için HerFab X-ışını kristal yapısı analiz edilmiştir. Kalıntının 30 önemli şartlar etkin konjugasyon reaksiyonu için bağlanma afinitesinde azalmaya ve çözücü ulaşmak en aza indirmek için, antikor bağlanma yeri yeterli mesafe bulunmaktadır. Kalıntı iyi antikor dışına maruz kalan ve antikor bağlanma yeri uzak iki immünoglobulin alanlarının arayüzü, yakın bulunması nedeniyle pozisyon 177 de lösin iyi bir aday oldu.
içeriği "fo: keep-together.within Sayfa =" 1 "> Başlangıçta, His6 Etiketleme-bir C-terminal ile birlikte HerFab için ekspresyon plazmidi inşa edildi ve kehribar rengi bir kodon sitesi AF dahil edilmesi için pozisyon 177 tanıtıldı -directed mutagenez. AF içeren mutant HerFab birlikte ifade gelişti tRNA, Tyr ve aminoasil-tRNA sintetaz çift 1mM AF mevcudiyetinde ifade edildi. 27 Ni-NTA afinite saflaştırma mevcudiyetinde ifade mutant proteinler için uygulandı ve AF ve aşağıdaki SDS-PAGE analizinin olmaması tam uzunlukta antikor fragmanı AF mevcudiyetinde sadece elde edildiği (Şekil 2). Daha sonra, AF içeren mutant antikor parçası Cy5.5 ile konjügasyon reaksiyonu için değerlendirildi mevcudiyetinde B-bağlı aza-dibenzocyclooctyne türevi (Cy5.5-ADIBO). antikor fragmanı ve Cy5.5-ADIBO 6 saat bir fosfat tamponu içinde reaksiyona sokuldu ve reaksiyon karışımı, SDS-PAGE ile analiz edilmiştir (+) ve yokluk (-) DTT (Şekil 3a). 25. Bir vahşi tip bir antikor fragmanı ile reaksiyonu, aynı zamanda gerçekleştirilen bir kontrol olarak analiz edildi. konjugasyon vahşi tip fragmanı ile reaksiyonda gözlenirken floresans görüntüleri net, Cy5.5-ADIBO mutant antikor fragmanının konjugasyon göstermiştir. Elektron püskürtme iyonizasyon kütle spektrometrisi (ESI-MS) analizi hiç bir bulgulanabilir birleşmemiş fragmanının (Şekil 3b) kantitatif konjugasyon göstermiştir. Genel olarak, bu sonuçlar, AF içeren mutant HerFab ek reaktif olmayan etkin ve uygun şekilde SPAAC tarafından gergin cyclooctynes ile konjuge olabilir gösterdi.
Şekil 1: SPAAC site-spesifik antikor etiketleme şematik gösterimi."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: gelişmiş tRNA / AARS çiftinin mevcudiyetinde pozisyon 177 (L177) AF içeren mutant HerFab ekspresyonu. gelişti tRNA / AFRS çifti ve 1 mM AF içeren LB ortamında HerFab-L177AF sentezlenmesi. (-) Ile saflaştınlmış numuneler mevcudiyetinde (+) veya yokluğunda SDS-PAGE ile analiz edildi DTT ve jel, ticari bir protein lekesi ile boyandı. Ko, W. ve arkadaşları uyarlanmıştır Şekil. 27. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Konjugasyon tepkiCy5.5-ADIBO ile HerFab-L177AF iyon. Cy5.5-ADIBO vahşi tip HerFab ve HerFab-L177AF konjugasyonu reaksiyonu (a), SDS-PAGE analizi. (-) Reaksiyon karışımları varlığında (+) ve yokluğunda analiz edildi DTT ve protein bantları, ticari bir protein leke (sol) ve floresan görüntüleme (sağ) ile görselleştirilmiştir. (B) ESI-MS Cy5.5-ADIBO (sağ) ile etiketlenmiş HerFab-L177AF (sol) ve HerFab-L177AF analizleri: HerFab- L177AF ve konjuge antikor = 1,190 Da arasında beklenen kütle farkı kütle farkı = 1,190 Da gözlenen . Ko, W. ve arkadaşları uyarlanmıştır Şekil. 27. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
proteinlerin içine Doğal olmayan amino asitlerin genetik dahil protein modifikasyonu için kullanılan diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Önemli avantajlar 1-3 bir proteinin her türlü genel uygulanabilmesidir. Prensip olarak, bir hedef proteini ve protein, bir hedef sitesi seçiminde herhangi bir sınırlama yoktur. Bununla birlikte, UAA ile yapısal ve fonksiyonel olarak önemli kalıntısının yerine, hedef proteinin yapısını ve fonksiyonunu değiştirerek neden olabilir. Genel olarak, çözücü maruz kalan ve diğer artıkları ile etkileşmeyen tortuları UAAS dahil edilmesi için tercih edilmektedir. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü bir kristal yapısından yapısal bilgi UAA dahil edilmek için uygun sitesi seçmek için kullanılır. 30 UAAS dahil teknik olarak kolaydır ve basit bir mutagenez gerektirdiğinden, birden fazla bölgede kolayca hedef proteinin arzu edilen bir işlev için en uygun bir tortu seçmek için taranabilir. </ P>
Bu protokol, AF genetik bir antikor fragmanı içine dahil edilir, ve mutant parçası SPAAC kullanarak site-spesifik olarak bir florofor ile işaretlenmiş olan. Bu yöntemin konjugasyon verimi önceki rapora kıyasla önemli bir gelişmedir istenmeyen reaksiyon olmadan kantitatiftir. 25 Bu, optimal site seçimi ve reaksiyon süresi bir artış dikkat yapısal analizi ile elde edilmiştir. Bu nedenle, UAA dahil edilmek üzere alana seçimi, hızlı ve nicel konjugasyonu için kritik önem taşır. Buna ek olarak, etkili bir UAA dahil sistemlerinin kullanımı (örneğin, pEvol-AFRS) aynı zamanda, protein verimi ve dahil verimliliği için önemlidir. 28
Protein konjugasyon için genetik dahil yöntemi ile protein içine dahil diğer UAA'lar antikor konjugasyon için kullanılabilir. Reaksiyon oranı cinsinden 4-11, bakır katalize siklo-ilave reaksiyonu,gibi tetrazinler 8 ve gergin alkenler ve alkinleri kullanılarak ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu gibi, 7, bu çalışmada kullanılan SPAAC daha iyi olacaktır. Bununla birlikte, bakır ile katalize edilen siklo-ilave reaksiyonu, genellikle, sentetik olarak zor, ve kantitatif olarak bağlanması için yeteri kadar sabit değildir, bakır (I) 'in iyon ve ligandları, 31 ve Diels-Alder reaksiyonu için amino asit gerektirmektedir. Keton-hidroksiamin yoğunlaştırma 4, aynı zamanda, aynı amaç için kullanılabilir. Bununla birlikte, orta seviyede asidik koşullar gerektirir, ve reaksiyon hızı SPAAC daha yavaştır. örneğin, ticari veya sentetik, doğal olmayan amino asitler erişilebilirliği reaksiyon oranı, biyo-ortogonal, reaksiyon koşulları biyouyumluluk ve doğal olmayan amino asitlerin dahil edilmesi, verimliliği, genetik olarak SPAAC ve kullanma yöntemi gibi faktörler göz önüne alındığında AF modifiye geliştirmek için yararlı olacaktır Incorporated tedavi böyle bir ADC gibi proteinler, yanı sıra, genel gelinceProtein etiketleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
- Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
- Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
- Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
- Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
- Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
- Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
- Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
- Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
- Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
- Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
- Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
- Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
