Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
Hogere organismen bevatten complexe gemeenschappen van verschillende celtypen die samenwerken om meer complexe functies te brengen. Bijvoorbeeld tumoren bevatten niet alleen kankercellen, maar ook fibroblasten, cellen die bloedvaten vormen, vaak immuuncel infiltraten 1; bloed bevat een complex mengsel van tientallen immuuncel subtypen 2; en zelfs gekweekte cellijnen kunnen bestaan uit meerdere subpopulaties, zoals de luminale en basale subtypes van borstkankercellen 3. Bovendien verschillende celtypen die naast elkaar kunnen metabole "samenwerken" vertonen. Bijvoorbeeld in de hersenen, astrocyten worden verondersteld om glucose om te zetten naar lactaat, die vervolgens "gevoed" neuronen die dit substraat 4 oxideren; T-lymfocyten zijn in sommige contexten afhankelijk aangrenzende dendritische cellen als een bron van cysteïne 5; en kankercellen kunnen samenwerken met assobehorende fibroblasten in tumoren 6. De metabolische gedrag van dergelijke systemen te begrijpen, is het noodzakelijk te scheiden en meten van de metabolische activiteiten van de verschillende celtypen aanwezig.
Verreweg de meest gebruikte methode voor het scheiden van celtypes is fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze werkwijze is breed toepasbaar, mits het celtype of de toestand van belang kan worden "gemerkt" met fluorescerende antilichamen expressie van fluorescente proteïnen, of andere kleurstoffen. Een optie is om in eerste instantie een aparte cellen types door middel van een cel sorter, re-cultuur van de afzonderlijke celtypen verkregen, en vervolgens uit te voeren onderzoek naar het metabolisme van deze culturen 7. Dit is echter alleen mogelijk als het type cel of fenotype stabiel in kweekomstandigheden, en kan transient gedrag vangen zoals celcyclus staten, noch de metabolische samenwerking in co-culturen. Voor dergelijke gevallen moet de stofwisseling direct worden gemeten, zodatrted cellen. Dit is een uitdaging, omdat de celsortering procedure onderwerpt cellen om de spanningen die hun metabolisme 8 kunnen verstoren, en we zijn ons bewust van de weinige studies die deze aanpak 9, 10. In het bijzonder hebben wij gevonden dat belangrijke metabolieten zoals aminozuren kunnen lekken uit cellen in celsortering buffer gehouden, zodat metingen van absolute metaboliet abundantie niet meer betrouwbaar 11 (hoewel relatieve vergelijking tussen gesorteerde fracties nog steeds waardevol kan zijn).
Om deze problemen te omzeilen, We noemen cellen met stabiele isotopen uit te sorteren, en focus op de MID in cellulaire metabolieten, plaats metaboliet abundanties. Sinds MID's worden gevormd over langere tijdschalen, moeten ze minder worden beïnvloed door kortdurende blootstelling aan het sorteren van omstandigheden. We kwantificeren MID's met behulp van full-scan met hoge resolutie massaspectrometrie, die gevoelig genoeg is om da te biedenta op honderden metabolieten vanaf ongeveer 500.000 gesorteerde cellen, die ongeveer 30-60 min van celsortering tijd. Een vergelijking tussen een "mock gesorteerd" controle (cellen doorgegeven via de celsorteerinrichting instrument zonder gating specifieke populatie) en metaboliet extractie direct uit de kweekschaal wordt nagegaan of de waargenomen MID representatief zijn voor die welke in het oorspronkelijke cultuur. Afhankelijk van de keuze van stabiele isotopen kunnen diverse metabole pathways bestudeerd worden met deze methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze werkwijze is gebaseerd op het principe dat MID in cellulaire metabolieten weerspiegelen de "geschiedenis" van metabolische activiteiten van een cel. Dit maakt het mogelijk om metabolische activiteiten onderzoeken subpopulatie van cellen, zoals ze zich in het complex door cellen, vóór de celsortering procedure. In tegenstelling piekoppervlakken van metabolieten verschillen sterk tussen de extracten van gesorteerde cellen en directe extractie uit de cultuur schotel 11. Voor een dee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
