Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
Höhere Organismen enthalten komplexe Gemeinschaften von verschiedenen Zelltypen, die über komplexere Funktionen zu bringen, zusammenzuarbeiten. Zum Beispiel enthalten Tumoren nicht nur Krebszellen, sondern auch Fibroblasten, Zellen , die Blutgefäße darstellen, und oft Immunzellen infiltriert 1; Blut enthält eine komplexe Mischung von Dutzenden von Immunzellsubtypen 2; und auch kultivierte Zelllinien können aus mehreren Subpopulationen bestehen, wie beispielsweise der luminalen und basalen Subtypen von Brustkrebszellen 3. Darüber hinaus verschiedene Zelltypen, die metabolische "Zusammenarbeit" zeigen nebeneinander bestehen können. Beispielsweise im Gehirn, sind Astrozyten gedacht Glukose zu Laktat zu konvertieren, die "gefüttert" zu Neuronen ist dann , dass dieses Substrat 4 zu oxidieren; T – Lymphozyten sind in einigen Zusammenhängen abhängig von benachbarten dendritischen Zellen als eine Quelle für Cystein 5; und Krebszellen können mit asso zusammenarbeitengehörigen Fibroblasten in Tumoren 6. Um das metabolische Verhalten solcher Systeme zu verstehen, ist es wichtig, zu trennen und die Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen Zelltypen zu messen.
Bei weitem das am häufigsten verwendete Verfahren zur Abtrennung von Zelltypen ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Dieses Verfahren ist breit anwendbar, vorausgesetzt, dass der Zelltyp oder Zustand von Interesse kann unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern, die Expression von gentechnisch fluoreszierende Proteine oder andere Farbstoffe "markiert" werden. Eine Möglichkeit besteht darin , zunächst getrennte Zelltypen durch einen Zellsortierer, wieder Kultur die einzelnen Zelltypen erhalten, und dann Metabolismus – Untersuchungen dieser Kulturen 7 durchführen. Dies ist jedoch nur möglich, wenn der Zelltyp oder Phänotyps in Kulturbedingungen stabil ist, und nicht die Übergangsverhalten, wie beispielsweise Zellzykluszustände noch die metabolischen Kooperation in Kokulturen erfassen kann. Für solche Fälle müssen Stoffwechsel direkt auf so gemessen werden,rtet Zellen. Das ist eine Herausforderung , da die Zelle Verfahren Sortierfächer Zellen zu Spannungen, die ihren Stoffwechsel 8 verzerren, und wir sind nur wenige Studien bewusst diesen Ansatz 9, 10. Insbesondere haben wir die Hauptmetaboliten wie Aminosäuren gefunden in Zellsortierpuffer gehalten von Zellen austreten kann, so dass die Messungen des absoluten Metabolitenfluss sind nicht mehr zuverlässig 11 (obwohl relativen Vergleich zwischen sortierten Fraktionen immer noch wertvoll sein kann).
Um diese Probleme zu umgehen, wir beschriften Zellen mit stabilen Isotopen vor der Sortierung und konzentrieren sich auf die MIDs in zellulären Metaboliten, anstatt Metaboliten Abundanzen. Da MIDs über längere Zeitskalen gebildet werden, sollten sie weniger durch Sortierung Bedingungen kurzfristige Exposition. Wir quantifizieren MIDs Full-Scan-hochauflösende Massenspektrometrie, die empfindlich genug ist, da bietenta auf Hunderten von Metaboliten von rund 500.000 sortierten Zellen beginnen, was etwa 30-60 Minuten von Zellsortierung Zeit. Ein Vergleich zwischen einem "mock sortiert" Kontrolle (Zellen durch den Zellsortierer Instrument weitergegeben, ohne spezifische Bevölkerungs Gating) und Metaboliten Extraktion direkt aus der Kulturschale gewährleisten gemacht, dass die beobachteten MIDs sind repräsentativ für diejenigen, die in der ursprünglichen Kultur. Je nach Wahl der stabilen Isotopen Tracern können verschiedene Stoffwechselwege mit diesem Verfahren untersucht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Methode basiert auf dem Prinzip, dass MIDs in zellulären Metaboliten, die die "Geschichte" des metabolischen Aktivitäten einer Zelle widerspiegeln. Dies macht es möglich, Stoffwechselaktivitäten in Subpopulation von Zellen zu untersuchen, wie sie in der komplexen Gemeinschaft der Zellen erfolgte vor der Zellsortierung Verfahren. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Peakflächen von Metaboliten deutlich zwischen Extrakten von sortierten Zellen und direkte Extraktion aus der Kulturschale <sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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