Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
Yüksek organizmalar daha karmaşık işlevleri hakkında getirmek için işbirliği farklı hücre tiplerinin karmaşık topluluklar içerir. Örneğin, tümörler de sadece kanserli hücreleri, ancak fibroblastlar, kan damarlarını oluşturan ve genellikle bağışıklık hücresi 1 infiltratlarının hücreleri içerir; Kan bağışıklık hücresi alt tiplerinin 2 onlarca karmaşık bir karışımını içerir; ve hatta kültürlenmiş hücre çizgileri, luminal ve göğüs kanseri hücrelerinin 3 taban alt tipleri gibi birden fazla alt popülasyonlarının, oluşabilirler. Metabolik "işbirliği" sergileyebilir arada Dahası, farklı hücre tipleri. Örneğin, beyinde, astrositler bu alt tabakayı 4 okside nöronlara ardından "beslenen" dir laktat, glikoz dönüştürmek için düşünülen; T lenfositleri sistein 5 kaynağı olarak bitişik dendritik hücreler göre bazı bağlamlarda vardır; ve kanser hücrelerinin Asso ile işbirliği yapabilirtümör 6 kaygılar da fibroblastlar. Bu tür sistemlerin metabolik davranışını anlamak için, ayrı ve mevcut olan çeşitli hücre tipleri metabolik etkinliklerini ölçmek için gereklidir.
Bugüne kadar hücre türlerini ayırmak için en yaygın kullanılan yöntem floresan aktive hücre sıralama olduğunu. Bu yöntem, hücre tipi veya ilgi durumu floresan antikorlar, işlenmiş floresan proteinleri ifade ya da diğer boyalar kullanarak "etiketli" koşuluyla, geniş çapta uygulanabilir. Bir seçenek hücre sıralayıcı ile birbirinden bağımsız olarak hücre türleri, yeniden kültür elde edilen ayrı hücre tipleri için, ve daha sonra bu kültürler 7 metabolizması çalışmalar yapmak. Hücre tipi veya fenotip kültür şartlarında stabildir ve hücre döngüsü devletler, ne de ko-kültürlerde metabolik işbirliği gibi geçici davranış yakalama olamaz Ancak, bu sadece uygulanabilir. Bu gibi durumlarda, metabolizma, böylece doğrudan ölçülmelidirrted hücreleri. Bu prosedür sıralama hücre kendi metabolizmasını 8 bozulabilir gerilimlere hücreleri tabi çünkü zorlu ve biz bu yaklaşımı 9, 10 alarak sadece bir kaç çalışmalar farkındayız. Özellikle, mutlak metaboliti bolluğu ölçümleri artık güvenilir böylece amino asitler gibi önemli metabolitleri, hücre sıralama tamponunda tutulan hücrelerden sızabilir bulduk 11 (sıralı fraksiyonları arasındaki göreceli karşılaştırma hala değerli olabilir rağmen).
Bu sorunları aşmak için, biz sıralama öncesinde duraylı izotop hücreleri etiket ve hücresel metabolitleri yerine metabolit bolluklarının MID odaklanmak. MID uzun zaman ölçeklerinde üzerinde oluştuğu için, daha az sıralama koşullara kısa süreli maruz kalma etkilenen edilmelidir. Biz DA sağlayacak kadar hassastır tam tarama yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak MID ölçmekhücre sıralama zamanın yaklaşık 30-60 dk gerektiren yaklaşık 500.000 sıralanmış hücrelerden başlayarak metabolitlerin yüzlerce, üzerinde ta. kültür çanak gözlenen MID orijinal kültür bulunanların temsil olmasını sağlamak için yapılır bir arasında bir karşılaştırma doğrudan kontrolü (herhangi bir özel nüfus yolluk olmadan cep sıralayıcı enstrüman geçirilerek hücreleri) ve metabolit çıkarma "mock sınıflandırılmaktadır". kararlı izotop izleyicilerin seçimi bağlı olarak, çeşitli metabolik yollar bu yöntemle ele alınabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim yöntemi hücresel metabolitleri MID bir hücrenin metabolik faaliyetleri "tarihini" yansıtması ilkesine dayanmaktadır. Bu, daha önceki bir hücre ayırma prosedürü, hücrelerin karmaşık eden oluştu şekilde mümkün hücrelerin alt popülasyonunda metabolik faaliyetlerini araştırmak için yapar. Buna karşılık, metabolitleri pik alanları sıralanmış hücreler ve kültür çanak 11 doğrudan çıkarma özleri arasında belirgin farklılıklar göstermektedir. Böl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
