Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذه المنهجية هو السماح للمحقق لمراقبة بسرعة وسهولة، وبتحديد التأثير أن وكيل الدوائي له على معدل ضربات القلب من عسل النحل. النحل، مثل غيرها من الحشرات، يكون نظام الدورة الدموية المفتوحة التي تنشر الدملمف، أي ما يعادل الحشرات من الدم، في جميع أنحاء تجويف الجسم، والمعروفة باسم hemocoel. تداول الدملمف ضروري لنقل المواد الغذائية وعوامل المناعة، والنفايات، وكذلك هرمونات عصبية وغيرها من الجزيئات يشير الى 1. ومما يسهل تداولها من قبل سفينة الظهرية، والتي تمتد على طول خط الوسط الظهرية من الحشرات، وكذلك أجهزة نابض التبعي. ينقسم السفينة الظهرية إلى قسمين متميزة وظيفيا، عين القلب في البطن والشريان الأورطي في الصدر والرأس. تقلصات نشر في الدملمف مضخة القلب نحو الصدر والرأس، في حين تضمن أجهزة نابض التبعي تدفق اللمف الدموي إلى الحدود القصوى.
الطبقة = "jove_content"> الحشرات وظيفة القلب ويمكن ملاحظة ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب، وهذا يتوقف على حجم، مرحلة علم وظائف الأعضاء، أو حياة الحشرة. نهج مشترك لمراقبة معدل ضربات القلب في اليرقات والحشرات الصغيرة هو استخدام التصوير حيوي داخلي 2. هذا الأسلوب هو أقل فائدة في النحل البالغ، ولكن، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب عرضها بشكل واضح السفينة الظهرية من خلال جدار البطن. نهج مستقر لتسجيل معدل ضربات القلب في مجموعة متنوعة من الحشرات، بما في ذلك النحل، هو استخدام الحراري الاتصال، الذي يستخدم الثرمستورات تطبيقها على السطح الخارجي للحشرة لكشف نبضات القلب 3،4. كما تم تسجيل معدل ضربات القلب في النحل البالغ باستخدام تقنية الكهربية لقياس والكهربائية 4،5 إشارة مقاومة. هذا الأسلوب يتطلب إدخال أقطاب كهربائية في الحيوان بجانب القلب واستخدام محول مقاومة لتسجيل دقات القلب (4). وبالمثل، استخدمت الكهربائي إلى DETECر الإشارات الكهربائية التي ينتجها القلب وجنبا إلى جنب مع تسجيل فيديو للنحل لمراقبة التغيرات في نشاط القلب 6. وهناك ميزة واضحة لهذه المناهج هي أن معدل ضربات القلب يتم تقييم في حالها، والنحل الحية، وليس في عينة تشريح، مما يساعد على ضمان توفر مجموعة كاملة من الاستجابات الفسيولوجية في هذا الموضوع. وتشمل التحديات من هذه الأساليب المحاسبية لتجميد أو تخدير لهذا الموضوع، والحاجة للحد من متغيرات ومؤثرات الخارجية التي قد تغير معدل ضربات القلب، وكذلك تحديد طريقة تسليم المناسب عند اختبار وكلاء الدوائية.
مقاربة أخرى التي استخدمت لدراسة النحل النشاط القلبي لتشريح جزء من الحشرة من أجل فضح القلب، ثم قياس تقلصات سفينة الظهرية باستخدام القوة التشريد محول 7. في هذا البروتوكول، واستحم القلب باستمرار مع المياه المالحة الفسيولوجية التي تعمل بنظام التشغيل والاختبار المشتركmpounds يمكن حله في هذا الحل لتطبيق لهذا الموضوع (7). وهناك فرق كبير بين هذه الطريقة وتلك التي سبق وصفها هو أن الحبل العصبي البطني تتم إزالة، والقضاء على الدور الذي ثبت الجهاز العصبي المركزي للعب في تحوير معدل ضربات القلب 5. والنتيجة هي أن ضربات القلب الأساسي، التي عادة ما تكون غير منتظمة جدا، تستقر على تردد أقل من ذلك بكثير والسعة من عادة ما لوحظ في حشرة تعيش 5،7. ما كل من هذه الأساليب تكون مشتركة هي أنها تتطلب معدات متخصصة للغاية ومكلفة في كثير من الأحيان، بالإضافة إلى مستوى معين من الخبرة، من أجل أن تتم. ولعل أكبر العيب هو أن أيا من هذه الطرق بشكل خاص مناسبة تماما لالتجارب التي تنطوي على اختبار عدد كبير من الموضوعات، مثل فحص مكتبة من مركبات يحتمل cardiomodulatory.
أعظم قوة النهج الموصوف هناهو بساطته. بروتوكول من السهل نسبيا لإتقان، والإعداد يتطلب مساحة صغيرة، وفقط المدخلات المالية الحد الأدنى الضروري. والأسلوب يتطلب أكثر قليلا من بعض النحل، عدد قليل من الأدوات الجراحية، وهو محلول متساوي التوتر، وإما المجهر الرقمي أو المجهر التقليدية مع كاميرا رقمية. يتم تشريح النحل لتصور السفينة الظهرية وتستخدم أشرطة الفيديو الرقمية لتسجيل معدل ضربات القلب قبل وبعد العلاج مع وكلاء الدوائية. وعلى الرغم من تسجيل الفيديو ليست في الواقع ضرورية لمراقبة التغيرات في معدل ضربات القلب، وسوف تزيد بشكل كبير الإنتاجية (أي عدد من المواضيع التي يمكن معالجتها في فترة معينة من الزمن). يمكن للمحقق تعظيم كفاءة من خلال تسجيل عدد كبير من أشرطة الفيديو في وقت واحد ومن ثم في وقت لاحق وسجل أشرطة الفيديو هذه في وقت أكثر ملاءمة. ميزة أخرى لهذا النهج هو أن أشرطة الفيديو تسمح المحقق للبدء من جديد، يجب أن توقف عملية التهديف، وجعلها أسهل للالخامسiewer ليكون أعمى للعلاج من أجل الحد من التحيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع وإعداد الموضوعات اختبار
- جمع العدد المناسب من النحل من مستعمرة.
ملاحظة: إن العدد المطلوب يعتمد على ليس فقط حجم ونطاق التجربة، ولكن أيضا مهارة المحقق. على سبيل المثال، إذا كان هناك 2 مجموعات العلاج مع حجم العينة المطلوبة من 10 النحل في كل مجموعة، قد محقق المهرة معقول جمع لا يقل عن 30 النحل لحساب تشريح فاشلة وينتهي مع 20 شريط فيديو مفيدة للتسجيل. - تقليل كمية الوقت الذي يمر بين جمع وتشريح.
ملاحظة: على الرغم من أن النحل يمكن أن يضم في المختبر لعدة أيام قبل تشريح، ونسبة نجاح تشريح (أي احتمال من الحفاظ على معدل ضربات القلب مستقر في سفينة الظهرية تشريح) وقد لوحظ أن ينخفض نسبة إلى مقدار الوقت الذي ويعيش النحل بعيدا عن مستعمرة.- توفير النحل مع مصدر المياه والغذاء في حين يضم في المختبر. لإكساءmple، كحد أدنى، وتوفير الوصول إلى 50٪ (ث / ت) حل السكروز في الماء (وهذا يكفي لفترات أقل من 6 ساعات). لفترات أطول، وتوفير النحل الوصول إلى العسل.
- النحل منزل في ليلة وضحاها المختبر عند درجة حرارة حوالي 32 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60-80٪ للحد من التوتر وتجنب الجفاف.
- قبل التشريح، وتخدير النحل لفترة وجيزة للمساعدة في التعامل معها.
ملاحظة: هذا يمكن أن تقلل من نسبة نجاح تشريح وتقليل الإنتاجية.- هدئ النحل إما عن طريق وضعها على الجليد أو في الثلاجة لفترة طويلة بما يكفي للحد من حركة من أجل مساعدة في التعامل معها.
- بدلا من ذلك، كشف لفترة وجيزة النحل إلى CO 2 وذلك للمساعدة في التعامل معها.
ملاحظة: التعرض للبرد الموسع يمكن أن تقلل من نسبة نجاح التشريح. تمديد أو التعرض المتكرر للCO 2 يمكن أيضا أن يقلل من نسبة نجاح التشريح.
2. تشريحفي ظهري جدار البطن
ملاحظة: يجب أن يكون النحل على قيد الحياة في وقت تشريح.
- باستخدام ملقط و / أو مقص تسليخ مجهري، إزالة الأرجل والأجنحة لتسهيل تشريح البطن. الحفاظ على كوب صغير أو حاوية مماثلة مملوءة بالماء المقطر قريب لغرض الشطف الصكوك بين التشريح.
- بينما يقيد النحل مع ملقط، واستخدام مقص تسليخ مجهري لقطع أفقيا على طول جدار البطن الظهري بين tergites الأولى والثانية (انظر الشكل 1).
الشكل 1: عرض الظهرية من البطن النحل. وينبغي أن يتم شق الأولي بين tergites الأولى والثانية، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء الضغط عليهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- في حين تجتاح بخفة الحافة الخلفية للtergite الثاني مع ملقط، قطع طولي على طول كل جانب من النحل من شق الأولي إلى الحشرة (انظر الشكل 2). توخي الحذر عند قطع لتجنب ثقب الجهاز الهضمي.
الشكل 2: عرض جانبي من بطن النحل. ينبغي الشقوق الثانية والثالثة على طول جانبي البطن، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تبادل مقص لمجموعة ثانية من ملقط غرامة والاستفادة منها لفصل بعناية ظهري جدار البطن عن بقية سو البطن. إزالة بلطف الحشرة وأي جزء من الجهاز الهضمي التي لا تزال تعلق على جدار البطن الظهري. تجنب تمزق الأمعاء، كما محتويات يمكن معطف جدار البطن ويعيق التصور السفينة الظهرية.
الشكل (3): مشاهدة السفينة الظهرية. مرة واحدة وقد تم إزالة الأمعاء والواخزة، السفينة الظهرية مرئيا على طول خط الوسط من جدار البطن الظهرية تشريح. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- ترتيب جدار البطن الظهري في الاتجاه المطلوب تحت الكاميرا بحيث السفينة الظهرية مرئية (انظر الشكل 3). استخدام مقص لتقليم تسليخ مجهري بعيدا أي أب الزائدجدار dominal أن يعوق التصور السفينة الظهرية. شكل جدار البطن الظهري يجب أن تشبه كوب الضحلة أو وعاء عندما تقع بشكل صحيح.
- منذ سفينة الظهرية لا تمتد إلى قطاع البطن أخير للنحل، وإزالة tergite النهائي من أجل تحسين التصور للسفينة الظهرية.
- الاستفادة من micropipette حجم قابل للتعديل، وتغطي السفينة الظهرية مع 10 ميكرولتر من محلول متساوي التوتر للحفاظ على الظروف الفسيولوجية وتسهيل ضربات القلب ثابت.
ملاحظة: الحل المقترح هو قوة الربع حل رينغر (0.120 غرام كلوريد / L الكالسيوم، 0.105 غرام / لتر كلوريد البوتاسيوم، 0.050 غرام / لتر بيكربونات الصوديوم، و2.250 غرام / لتر كلوريد الصوديوم)، والتي تم العثور عليها لتسهيل مستقرة، ضربات القلب المستمر.
3. مراقبة والتحوير من معدل ضربات القلب
- السماح للسفينة الظهرية للجلوس دون عائق حتى يتم التوصل إلى مستقر، ضربات القلب المستمر(عادة في غضون 300 ثانية).
ملاحظة: يتم تصور نبضات كما الانقباضات الإيقاعية للسفينة الظهرية. في البداية، قد يبدو أن هناك أي ضربات القلب، وخاصة إذا كان تخدير والنحل، ولكن القلب عادة استئناف الضرب بعد يستريح في محلول متساوي التوتر لعدة دقائق، ويمكن أن يستمر الضرب لساعات، شريطة أن يبقى استحم في حل. - قياس معدل ضربات القلب من حيث عدد نبضة في الدقيقة (BPM).
- تسجيل عدد من الانقباضات التي لوحظت خلال فترة 60 ثانية. استخدام عداد اليد رصيده وجهاز توقيت لتسهيل هذه العملية.
- قياس التغير في معدل ضربات القلب عن طريق تسجيل BPM لوحظ قبل وبعد العلاج بمركب cardiomodulatory.
ملاحظة: على الرغم من أن الوقت اللازم لمراقبة تأثير على معدل ضربات القلب قد تختلف تبعا لمجمع يجري اختبارها، والتغيرات في معدل ضربات القلب وعادة ما يمكن أن يلاحظ في غضون دقائق.- تحديد معدل ضربات القلب خط الأساس مباشرة قبلإضافة أي مركب الاختبار.
وعادة ما يمكن تحديد معدل ضربات القلب في مرحلة ما بعد العلاج بعد 90-120 ثانية: ملاحظة. - إعداد cardiomodulators إمكانية (على سبيل المثال، أوكتوبامين) عن طريق إذابة المركب في محلول متساوي التوتر نفسه الذي استخدم ليستحم السفينة الظهرية.
- إضافة مركبات اختبار في حل المحيطة السفينة الظهرية من خلال الاستفادة من micropipetter.
- تحديد معدل ضربات القلب خط الأساس مباشرة قبلإضافة أي مركب الاختبار.
- لمزيد من الدقة وأعلى إنتاجية، وجعل تسجيل الفيديو من كل موضوع الاختبار ثم استخدام أشرطة الفيديو لتسجيل معدل ضربات القلب في وقت لاحق.
ملاحظة: هذا يسمح للمحقق واحد لارباك تشريح من أجل تسهيل الإنتاج المستمر تقريبا من أشرطة الفيديو. عند تسجيل الفيديو، والحد الأدنى الموصى به من طول ما يقرب من 240 ثانية مع أي مركب اختبار يتم إضافتها على علامة 60 ثانية. وهذا يضمن أن المحقق لديه نافذة 60 ثانية لتسجيل معدل ضربات القلب الأساسي ومن ثم نافذة 60 ثانية أخرى لتسجيل بعد المعالجة معدل ضربات القلب 120 ثانيةبعد العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لأن العديد من المركبات النشطة الدوائية التي يمكن اختبارها باستخدام هذا البروتوكول هي غير قابلة للذوبان في الماء، فإنه من الضروري أن يكون مذيب يمكن الاعتماد عليها من شأنها أن تسمح المركبات اختبار ليتم تسليمها عن طريق محلول متساوي التوتر تستخدم ليستحم السفينة الظهرية. ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) هو مذيب التي يشيع استخدامها كوسيلة لإيصال الأدوية التجريبية وغيرها من المركبات في الحيوانات 8، وقد تم استخدامه بنجاح لهذا الغرض في الدراسات دراسة تأثير المبيدات على نحل العسل النشاط القلبي 9. ونتيجة لذلك، تم اختيار DMSO باعتبارها وسيلة ممكنة لإيصال مركبات اختبار للسفينة الظهرية، الأمر الذي يتطلب أن يكون أول اختبار للنشاط cardiomodulatory. في هذا البروتوكول، واستحم السفينة الظهرية تشريح في البداية في 10 ميكرولتر من محلول قوة الربع قارع الأجراس ومن ثم معدل ضربات القلب يتم تحديد مسبق إلى إضافة مركبات الاختبار. مركبات اختبار عالبريد تسليم بتركيز معلوم في 10 ميكرولتر من DMSO الذائبة في حل قوة الربع قارع الأجراس، وبعد ذلك لوحظ السفينة الظهرية لتغييرات لاحقة في معدل ضربات القلب.
قبل اختبار أي مركبات، تم اختبار مجموعة وتركيز DMSO عن أي تأثير على معدل ضربات القلب، نسبة إلى حل قوة الربع قارع الأجراس مع 0٪ DMSO. تم حل DMSO عند 0.2٪ و 2٪، 10٪، و 20٪ ت / ت في حل قوة الربع قارع الأجراس من أجل اختبار تركيز النهائي من 0.1٪، 1٪، 5٪، و 10٪ عندما أضيف في حجم مساو ل الحل الاستحمام بالفعل السفينة الظهرية. وقد استخدم هذا النهج، بدلا من إضافة DMSO في التركيز المطلوب في 10 ميكرولتر الأولية المستخدمة ليستحم السفينة الظهرية، لأن ليس كل تشريح غلة ضربات القلب مستقر. إذا كان لدى DMSO لها تأثير سلبي على معدل ضربات القلب، قد لا يكون هذا التأثير يمكن تمييزها من تشريح الفاشلة. تم تقييم معدل ضربات القلب مباشرة قبلمضيفا DMSO، ثم بعد ذلك مرة أخرى 120 ثانية. ويبين الشكل (4) ونتائج هذه التجربة، مما يدل على أن 0.1٪ و 1٪ DMSO في الحل لم يكن لها تأثير كبير على معدل ضربات القلب، نسبة إلى قوة الربع حل قارع الأجراس دون DMSO، في حين أن 5٪ و 10٪ DMSO انخفضت بشكل ملحوظ في معدل ضربات القلب.
الشكل 4: تأثير DMSO على معدل ضربات القلب النحل. ويبين الرسم البياني النسبة المئوية للتغير في معدل ضربات القلب القاعدية، كما يقاس في نبضة في الدقيقة. العلاج من عسل النحل سفينة الظهرية مع 0.1٪ أو 1٪ DMSO ت / ت في حل قوة الربع رينغر لا زيادة كبيرة أو نقصان معدل ضربات القلب، نسبة إلى حل قوة الربع قارع الأجراس دون DMSO. العلاج مع 5٪ أو 10٪ DMSO في حل يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل ضربات القلب. النتائج المعبر عنها يعني ± SEM (ن = 10). * P <السيطرة DMSO 0.05 مقابل 0٪ (كروسكال واليس اختبار مع اختبار المقارنات المتعددة دان). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من أجل هذا الاختبار لتكون ذات صلة، يجب أن يكون من الممكن لمراقبة التغيرات في معدل ضربات القلب بعد العلاج مع مركبات cardiomodulatory. ومن المعروف أن أمين أوكتوبامين الاحيائية ليكون بمثابة معدل عصبي في اللافقاريات 10، ولقد ثبت ليكون بمثابة cardioaccelerant في كل من ذبابة الفاكهة 11 و العسل النحل 7. تم اختبار أوكتوبامين ضد سيارة (1٪ DMSO في حل قوة الربع رينغر) كما هو موضح أعلاه في تركيزات من 100 نانومتر، و 10 ميكرومتر، و 100 ميكرومتر. ويبين الشكل 5 نتائج هذه التجربة، مما يدل على أن 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر تركيزات أوكتوبامين زيادة كبيرة في معدل ضربات القلب.
ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الرقم 5: تأثير أوكتوبامين على معدل ضربات القلب النحل. ويبين الرسم البياني النسبة المئوية للتغير في معدل ضربات القلب القاعدية، كما يقاس في نبضة في الدقيقة. العلاج من عسل النحل سفينة الظهرية مع 100 نيوتن متر أوكتوبامين لا زيادة كبيرة أو نقصان معدل ضربات القلب بالنسبة للسيارة (1٪ DMSO ت / ت في حل قوة الربع رينغر). العلاج مع 10 ميكرومتر وأوكتوبامين 100 ميكرومتر زيادة كبيرة في معدل ضربات القلب بالنسبة للمركبة. النتائج المعبر عنها يعني ± SEM (ن = 10). * P <0.05 مقابل السيطرة على السيارة (اختبار كروسكال واليس مع اختبار المقارنات المتعددة دان). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
