Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å la etterforsker for å raskt og enkelt observere og kvantifisere effekten som en farmakologisk middel har på puls av honningbier. Bier, i likhet med andre insekter, har et åpent sirkulasjonssystem som sprer hemolymfe, insekt tilsvarende blod, i hele kroppens hulrom, kjent som hemocoel. Sirkulasjonen av hemolymfe er vesentlig for transport av næringsstoffer, immunologiske faktorer, avfallsprodukter, samt neurohormones og andre signaliseringsmolekyler 1. Circulation lettes ved den dorsale fartøyet, som strekker seg langs rygglinjen av insekt, så vel som hjelpe pulsatile organer. Den dorsale kar er delt i to funksjonelt forskjellige seksjoner som er betegnet som hjerte i magen og aorta i thorax og hode. Spredd sammentrekninger i hjertet pumpe hemolymph mot thorax og hode, mens tilbehøret pulsatile organer sikre hemolymph strømmen til ekstremiteter.
En annen tilnærming som har blitt benyttet for å studere bie hjerteaktivitet er for delvis å dissekere insekt for å blottlegge hjertet, deretter måle rygg fartøyet kontraksjoner ved hjelp av en kraft forskyvnings transduser 7. I denne protokollen, hjertet er stadig badet med løping fysiologisk saltvann og test compounds kan løses i denne løsningen for søknad til emnet 7. En vesentlig forskjell mellom denne fremgangsmåte og de tidligere beskrevne, er at det ventrale nervesystemet er fjernet, noe som eliminerer den rolle i sentralnervesystemet har vist seg å spille ved modulering av puls 5. Resultatet er at grunnlinjen hjerterytme, som vanligvis er ganske ujevn, stabiliseres ved en mye lavere frekvens og amplitude enn det som vanligvis observeres i et levende insekt 5,7. Det alle disse fremgangsmåter har til felles, er at de krever høyt spesialisert og ofte kostbart utstyr, i tillegg til et visst nivå av ekspertise, for å bli utført. Kanskje den største ulempen er at ingen av disse metodene er spesielt godt egnet til forsøk som innebærer utprøving et stort antall fag, som for eksempel screening et bibliotek av potensielt cardiomodulatory forbindelser.
Den største styrken til tilnærmingen som er beskrevet herer dens enkelhet. Protokollen er relativt lett å mestre, oppsettet krever liten plass, og bare en minimal økonomisk innspill er nødvendig. Metoden krever litt mer enn noen bier, et par kirurgiske instrumenter, en isotonisk oppløsning, og enten et digitalt mikroskop eller et tradisjonelt mikroskop med et digitalt kamera. Bier dissekeres for å visualisere ryggbeholderen og digital video blir brukt til å registrere puls før og etter behandling med farmakologiske midler. Selv videoopptak er faktisk ikke nødvendig å observere endringer i hjerterytmen, vil det øke gjennomstrømning (dvs. det antall individer som kan behandles i en gitt tidsperiode). Etterforskeren kan maksimere effektiviteten ved å ta opp et stort antall videoer samtidig og senere utføre disse videoene på et mer passende tidspunkt. En annen fordel med denne tilnærmingen er at videoene la etterforsker for å starte på nytt, bør scoring prosessen avbrytes, og gjøre det lettere for viewer å bli blindet for behandlingen for å redusere skjevhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Innsamling og klargjøring av testpersonene
- Samle riktig antall bier fra kolonien.
MERK: Antallet som trengs avhenger ikke bare av størrelsen og omfanget av forsøket, men også dyktighet av etterforsker. For eksempel, hvis det er 2 behandlingsgruppene med en ønsket utvalgsstørrelse på 10 bier per gruppe, kan en rimelig dyktig etterforsker samle minst 30 bier å gjøre rede for mislykkede disseksjoner og ender opp med 20 nyttige videoer for å score. - Minimere mengden av tid som går mellom oppsamling og disseksjon.
MERK: Selv om bier kan bli plassert i laboratoriet for dager før disseksjon, suksessrate på disseksjoner (dvs. sannsynligheten for å opprettholde en stabil puls i en dissekert rygg fartøy) har blitt observert å redusere i forhold til hvor mye tid som bier er plassert vekk fra kolonien.- Gi bier med en kilde til vann og mat mens huset i laboratoriet. for example, som et minimum, gir tilgang til en 50% (vekt / volum) oppløsning av sukrose i vann (dette er tilstrekkelig for varigheter på mindre enn 6 timer). For lengre perioder, gi bier tilgang til honning.
- Hus bier i laboratoriet natten over ved en temperatur på ca. 32 ° C og 60-80% relativ fuktighet for å redusere stress og unngå dehydrering.
- Før disseksjon, bedøve bier kort for å hjelpe til med håndtering.
MERK: Dette kan redusere suksessrate på disseksjoner og redusere gjennomstrømning.- Chill biene, enten ved å plassere dem på is eller i et kjøleskap for akkurat lenge nok til å redusere bevegelse for å hjelpe til med håndtering.
- Alternativt kort utsette bier til CO 2 for å hjelpe til med håndtering.
MERK: Utvidet eksponering for kulde kan redusere suksessrate på disseksjoner. Utvidet og gjentatt eksponering for CO 2 kan også redusere suksessrate på disseksjoner.
2. Dissectionav Dorsal bukvegg
MERK: Bees bør være i live på tidspunktet for disseksjon.
- Bruk pinsett og / eller mikrodisseksjon saks, fjerne bein og vinger for å lette disseksjon av magen. Hold et lite begerglass eller lignende beholder fylt med destillert vann i nærheten for det formål å skylle instrumenter mellom disseksjoner.
- Mens besøksforbud bee med pinsett, utnytte mikrodisseksjon saks for å klippe sidelengs langs rygg bukveggen mellom første og andre tergites (se figur 1).
Figur 1: Dorsal utsikt over bee magen. Den innledende snittet skal gjøres mellom de første og andre tergites, som vist ved den røde linje. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
- Mens lett å gripe den bakre kant av den andre tergite med pinsett, kuttet i lengderetningen langs hver side av bie fra den første snittet til den stinger (se figur 2). Vær forsiktig når du skjærer for å unngå punktering av mage-tarmkanalen.
Figur 2: Lateral visning av bee magen. Det andre og tredje innsnitt bør gjøres langs hver side av abdomen, som vist ved den røde linje. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bytt saksen for et ekstra sett med fin pinsett og bruke dem til å nøye skille rygg bukveggen fra resten of magen. Fjern forsiktig stinger og en hvilken som helst del av mage-tarmkanalen som forblir festet til rygg bukveggen. Unngå sprekker tarmen, som innholdet kan belegge bukveggen og vanskeliggjøre visualisering av dorsal fartøyet.
Figur 3: Utsikt over rygg fartøyet. Når tarmen og sentreringsrøret er fjernet, er den dorsale fartøyet synlig langs midtlinjen av den dissekerte dorsal bukveggen. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Ordne den dorsale bukveggen i den ønskede orientering under kameraet slik at den dorsale fartøyet er synlig (se figur 3). Utnytte mikrodisseksjon saks til å klippe bort overflødig abdominal vegg som hindrer visualisering av dorsal fartøyet. Formen på rygg bukveggen skal ligne en grunne kopp eller skål når de er riktig plassert.
- Siden den dorsale fartøyet ikke strekker seg inn i den bakerste abdominal segment av bie, fjerne den siste tergite for å forbedre synliggjøring av dorsal fartøyet.
- Ved å benytte en justerbar volum mikropipette, dekker den dorsale fartøyet med 10 ul av en isotonisk oppløsning for å opprettholde fysiologiske betingelser og lette en jevn hjerteslag.
MERK: anbefalte løsningen er kvart styrke Ringers løsning (0,120 g / l kalsiumklorid, 0,105 g / l kaliumklorid, 0,050 g / l natriumbikarbonat, og 2,250 g / l natriumklorid), som er blitt funnet å lette en stabil, kontinuerlig hjerterytme.
3. Observasjon og Modulation av hjertefrekvens
- Tillat den dorsale fartøyet for å stå rolig til en stabil, kontinuerlig hjerteslag er oppnådd(Vanligvis i løpet av 300 sek).
MERK: Heartbeat er visualisert som rytmiske sammentrekninger i rygg fartøyet. Til å begynne med, kan det synes å være noen hjerterytme, særlig hvis det bie ble bedøvd, men hjertet vil vanligvis fortsette slo etter hvile i isotonisk oppløsning i flere minutter, og kan fortsette å slå i flere timer, forutsatt at den forblir badet i oppløsning. - Mål pulsen når det gjelder antall slag per minutt (BPM).
- Registrere antall sammentrekninger observert under en 60 sek periode. Bruk en hånd tally teller og en timer for å lette denne prosessen.
- Mål endring i hjerterytmen ved å registrere den observerte BPM før og etter behandling med en cardiomodulatory sammensatte.
MERK: Selv om den nødvendige tid for å observere en virkning på hjertefrekvensen kan variere avhengig av forbindelsen som testes, kan endringer i hjertehastighet vanligvis observeres i løpet av minutter.- Bestemme referansepuls umiddelbart førtilsetning av noe testforbindelse.
MERK: Post-behandling hjertefrekvens kan vanligvis bestemmes etter 90-120 sek. - Forbered potensielle cardiomodulators (f.eks oktopamin) ved å oppløse forbindelsen i det samme isotonisk oppløsning brukes til å bade dorsal fartøyet.
- Legg testforbindelsene til oppløsningen som omgir ryggbeholderen ved å benytte et micropipetter.
- Bestemme referansepuls umiddelbart førtilsetning av noe testforbindelse.
- For større nøyaktighet og høyere gjennomstrømning, lage et videoopptak av hver testperson og deretter bruke videoene å score pulsen på et senere tidspunkt.
MERK: Dette gjør at en enkelt etterforsker å rave disseksjoner for å lette nesten kontinuerlig produksjon av videoer. Når du tar opp video, er minimum anbefalt lengde ca 240 sek med noen testforbindelse blir lagt på 60 sek mark. Dette sikrer at etterforskeren har en 60 sek vindu for å oppnå baseline hjertefrekvens og deretter en annen 60 sek vindu for å utføre etterbehandling hjertefrekvens 120 seketter behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden mange av de farmakologisk aktive forbindelser som kan bli testet ved hjelp av denne protokollen er ikke oppløselige i vann, er det nødvendig å ha et pålitelig oppløsningsmiddel som vil tillate testforbindelsene som skal leveres via isotonisk oppløsning anvendt til å bade dorsal fartøyet. Dimetylsulfoksid (DMSO) er et løsemiddel som er ofte brukt som et redskap for å levere eksperimentelle medikamenter og andre forbindelser i dyr 8, og det har vært brukt med hell for dette formålet i studier som undersøker effekten av plantevernmidler på honningbie hjerteaktivitet 9. Følgelig DMSO ble valgt som en mulig bærer for levering av testforbindelser til dorsal fartøyet, som kreves for at den først skal testes for cardiomodulatory aktivitet. Ved denne protokollen blir dissekert dorsale kar som opprinnelig badet i 10 ul kvart styrke Ringers oppløsning og deretter pulsen blir bestemt før tilsetning av testforbindelser. Test forbindelser are levert ved en kjent konsentrasjon i 10 ul DMSO oppløst i kvart styrke Ringers løsning og deretter dorsal fartøyet er observert for de påfølgende endringer i hjertehastighet.
Forut for testing av hvilken som helst forbindelse, ble et konsentrasjonsområde av DMSO testet for noen effekt på hjertefrekvensen, i forhold til kvart styrke Ringers løsning med 0% DMSO. DMSO ble oppløst ved 0,2%, 2%, 10% og 20% volum / volum i kvart styrke Ringers løsning for å teste en sluttkonsentrasjon på 0,1%, 1%, 5% og 10% når det tilsettes i like stort volum for å løsningen allerede bading rygg fartøyet. Denne tilnærmingen ble anvendt, i motsetning til tilsetning av DMSO ved den ønskede konsentrasjon i de første 10 pl som brukes til å bade dorsal fartøyet, fordi ikke alle disseksjon gir en stabil hjerteslag. Hvis DMSO har en negativ effekt på hjerterytmen, kan denne effekten ikke kunne skilles fra en mislykket disseksjon. Hjertefrekvensen ble målt umiddelbart førtilsetning av DMSO, og deretter igjen 120 sekunder senere. Figur 4 viser resultatene av dette eksperiment viser at 0,1% og 1% DMSO i oppløsning hadde ingen signifikant effekt på hjertefrekvensen, i forhold til kvart styrke Ringers oppløsning uten DMSO, mens 5% og 10% DMSO betydelig redusert hjertefrekvens.
Figur 4: Effekt av DMSO på bee hjertefrekvens. Grafen viser den prosentvise endringen i basal hjertefrekvens, målt i slag per minutt. Behandling av honningbie rygg fartøy med 0,1% eller 1% DMSO v / v i kvart styrke Ringer løsning ikke signifikant øke eller redusere hjertefrekvensen, i forhold til kvartalet styrke Ringer løsning uten DMSO. Behandling med 5% eller 10% DMSO i oppløsning fører til en betydelig reduksjon i hjertefrekvensen. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 10). * P <0,05 mot 0% DMSO styre (Kruskal-Wallis test med Dunn multippel sammenligninger test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For denne analysen å være relevant, må det være mulig å observere endringer i hjertehastighet etter behandling med cardiomodulatory forbindelser. De biogene amin oktopamin er kjent for å opptre som en neuromodulator i virvelløse dyr og 10 har vist seg å virke som en cardioaccelerant i begge fruktfluer 11 og honningbier 7. Oktopamin ble testet mot bærer (1% DMSO i kvart styrke Ringers oppløsning) som beskrevet ovenfor ved konsentrasjoner på 100 nM, 10 uM og 100 uM. Figur 5 viser resultatene av dette eksperiment viser at 10 uM og 100 uM konsentrasjoner av oktopamin betydelig økt hjertefrekvens.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 5: Effekt av octopamine på bee hjertefrekvens. Grafen viser den prosentvise endringen i basal hjertefrekvens, målt i slag per minutt. Behandling av honningbie rygg fartøy med 100 nM octopamine ikke signifikant øke eller redusere hjertefrekvensen i forhold til kjøretøy (1% DMSO v / v i kvart styrke Ringers løsning). Behandling med 10 uM og 100 uM oktopamin signifikant øket hjertefrekvensen i forhold til kjøretøyet. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs kjøretøykontroll (Kruskal-Wallis test med Dunn multippel sammenligninger test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
