Cryosectioning av tilstøtende områder av et enkelt muse Skeletal Muscle for Gene Expression og histologiske analyser

Summary

Sammenhengende kryo-seksjoner er samlet for å muliggjøre histologiske programmer og berikelse av RNA for genekspresjon målinger ved hjelp av naboregionene fra et enkelt museskjelettmuskulatur. Høy kvalitet RNA er hentet fra 20 - 30 mg av sammenslåtte frysesnitt og målinger sammenlignet direkte på tvers av applikasjoner.

Abstract

Med denne metoden blir påfølgende frysesnitt samles for å muliggjøre både mikroskopi applikasjoner for vev histologi og anrikning av RNA for genuttrykk ved bruk av tilstøtende områder fra et enkelt museskjelettmuskulatur. Vanligvis er det vanskelig å oppnå tilstrekkelig homogenisering av små skjelettmuskelprøver fordi buffervolum kan være for lavt for effektiv sliping, men uten tilstrekkelig mekanisk avbrudd, den tette vev arkitektur muskel grenser penetrasjon av buffer reagenser, slutt forårsaker lav RNA yield. Ved å følge protokollen angitt her, er 30 um seksjoner oppsamlet og slått sammen slik at cryosectioning og påfølgende nål homogenisering for å mekanisk å forstyrre muskelen, å øke overflatearealet som utsettes for buffer penetrasjon. De primære begrensninger av teknikken er at det krever en cryostat, og det er forholdsvis liten produksjon. Imidlertid kan høy kvalitet RNA fås fra små prøver av oppsamlet muscle frysesnitt, noe som gjør denne fremgangsmåte er tilgjengelig i mange forskjellige skjelettmuskler og annet vev. Videre muliggjør denne teknikken matchet analyser (f.eks vev histopatologi og genekspresjon) fra tilstøtende regioner i en enkelt muskel-skjelettlidelser, slik at målinger kan sammenlignes direkte på tvers av programmer for å redusere eksperimentell usikkerhet og for å redusere replikative dyreforsøk er nødvendig for å kilden en liten vev for flere programmer.

Introduction

Målet med denne teknikken er å gjøre flere eksperimentelle analyser av ulike modaliteter, for eksempel histologi og genuttrykk, tilgjengelig fra en enkelt liten skjelettmuskulatur kilde vev. Mikros programmer som er mest følsomme for å smake konserveringsmetoder, som må kontrolleres nøye for å begrense dannelsen av iskrystall gjenstander under nedfrysing. Således er metodeutvikling basert på den muskel tibialis anterior (TA) frosne delvis dekket med innstøping harpiks i en -140 ° C med flytende nitrogen avkjølte 2-metylbutan bad som kildemateriale for både immunfluorescens-mikroskopi og genekspresjon analyser.

Behovet for å bruke samme kildemateriale for ulike tekniske tilnærminger er spesielt viktig for intramuskulær injeksjon baserte eksperimenter der venstre og høyre musklene representerer ulike forhold, en eksperimentell og en kontroll. For eksempel i muskel regenerering studier, en muscle injiseres med en gift for å forårsake omfattende vevsskade mens kontralaterale muskelen fungerer som et redskap-injisert kontroll ^en. Tilsvarende genterapistudier for muskelforstyrrelser begynner vanligvis med validering av genterapi vektoren ved intramuskulær injeksjon for å bli sammenlignet med tom vektor, som ikke er relatert vektor eller bærerkontroll på den kontralaterale side ^2. Derfor er det ikke mulig å kilden hver TA muskelen til et annet program.

Vanlige strategier for å håndtere dette problemet er: i) å bruke en annen muskelgruppe for hvert program, ii) å bruke flere mus, eller iii) å kutte av et stykke av muskelen for hvert program. Men store forskjeller mellom muskelgrupper gjør det vanskelig å sammenligne data fra forskjellige programmer, og flere dyr øke utgiftene og er dårlig begrunnet dersom andre alternativer eksisterer. Splitte muskler etter disseksjon til kilden forskjellige applikasjoner er det beste alternativet in mange tilfeller. Imidlertid muskel stykkene er ofte for liten til å bruke pulverisering under flytende nitrogen eller mekaniske slipeteknikker for homogenisering ^2-5. Som muskel er et meget strukturell vev pakket med ekstracellulære matrise og kontraktile proteiner, fører utilstrekkelig mekanisk homogenisering til et lavt utbytte av påfølgende DNA, RNA eller protein. Metoden beskrevet her gjør at små mengder vev fra en kilde muskel for bruk i flere programmer, og inkludering av cryosectioning og nål finmaling forbedrer mekanisk homogenisering for bedre RNA yield.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of Georgia Institutional Animal Care og bruk komité i henhold til bruk dyr protokollen A2013 07-016 (Beedle).

1. kryokonservering fiksert Skeletal Muscle

1. Preparat
   1. Skjær kork i små firkanter (ca. 1 cm x 1 cm) med et barberblad, skrive på korken med en fin spiss markør som er resistent mot to-methylbutane å identifisere kilden mus og muskler, og gjør en veldig grunt kutt (ca. 1 mm) over den øvre overflate. Sett en plastglass i snittet som skal brukes for å orientere vevet. Gjenta til en kork er klar for alle vev som skal fryses ned.
   2. Skaff flytende nitrogen, 2-metylbutan, embedding harpiks, lav temperatur termometer, korker, disseksjon verktøy, og studere mus.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen er en komprimert gass som kan eksplodere hvis de varmes opp. Bruk laboratoriefrakk, lav temperatur hansker og ansiktsvern ved håndtering av flytende niTrogen; kontakt med hud eller øyne kan forårsake brannskader eller frostskader. 2-methylbutane er en brannfarlig, giftig, helse og miljøfare. Bruk personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker, vernebriller), åpne lager container i en avtrekkshette, overføre den lille mengden som trengs for å fryse (vanligvis 200 til 400 ml) til en egen beholder som kan være tett lukket, og unngå innånding .
   3. Avlive mus med en godkjent metode for aktiv dødshjelp under anestesi. Kort fortalt, sett musen i en innånding kammer med 2,5% isofluran i oksygen fra en isofluran vaporizer, vente til 20 sek etter musa slutter å bevege seg for å se etter en pedal refleks. Når pedalen refleks er negativ, avlive studien mus ved cervikal dislokasjon ^6.
      MERK: Eutanasi metoder krever godkjenning av institusjonelle etiske komité.
   4. Fjern skinnet liggende den distale bakben og kutte de fjerne fremre sener like over ankelen med fin-point disseDette skjer saks. Ta tak i distale sener med fin pinsett og dra forsiktig opp og mot kneet mens kutte lateral fascia å frigjøre muskelen. Trekk muskel ut vinkelrett fra kneet og ta en endelig kuttet til eksisere TA muskel ^7.
      MERK: TA muskelen brukes her som et eksempel, men noen mus skjelettmuskulatur eller hjertet kan erstatte TA i denne protokollen eventuelt til brukerens eksperimentelle mål. Den eneste begrensningen er at en vevet må være liten nok til å oppnå rask nedfrysing i hele sin dybde; en maksimal vev størrelse på 1 cm x 1 cm anbefales.
   5. Gjenta på motsatt ben, og dissekere ut eventuelle andre vev som skal samles inn. Utfør disseksjon så raskt som mulig for å begrense vev degradering før nedfrysing.
   6. Orient hver muskel for tverrgående seksjoner på sin pre-merket kork. Stå muskelen vinkelrett på kork med den distale sene berøre kork og toppen av muskelen extslutter unna, holdt oppreist av dekkglass.
   7. Fryse ned alle vev for histologisk analyse så snart som mulig etter disseksjon, fortrinnsvis innen 5 minutter, men definitivt ikke mer enn 15 min tiden som har gått siden euthanization av kilden dyret.
2. nedfrysing
   1. Begynne avkjøling kryokonserveringsfremgangsmåten badekaret fem minutter før slutten av disseksjon. Hell 2-metylbutan inn i et åpent begerglass metall til en dybde på ca. 3 cm. Hell flytende nitrogen inn i en isolert beholder til en dybde på 2 til 4 cm. Still beger av 2-metylbutan i det flytende nitrogen; nitrogen vil begynne å koke. Unngå nitrogen sprut i 2-methylbutane beger.
      FORSIKTIG: Forbered iskaldt bad i en avtrekkshette eller et godt ventilert område.
   2. Sette inn et lav-temperatur-termometer i 2-metylbutan for å overvåke temperaturen og rør ofte med en gaffel for å sikre jevn kjøling. Fortsett å røre og kjølig inntil to-methylbutane når -140 ° C, tilsetning av nytt flytende nitrogen til den ytre badet etter behov.
      MERK: -140 ° C er den optimale temperaturen for å minimere iskrystall artefakter i tverrstripet muskulatur; andre vev kan cryopreservere best ved forskjellige temperaturer (for eksempel hjerne, -90 ° C).
   3. Gjelder innbygging harpiks bare til den nedre 35 - 50% av muskelen der den møter kork og umiddelbart slippe kork i 2-metylbutan ved -140 ° C. Raskt gjenta for opptil 8 vev per fryse batch. Omrør i 30 sek, skraping bunnen av begeret slik at vevet ikke fryser i den størknende 2-metylbutan.
   4. Bruk en gaffel, hullsleiv eller store tang for å trekke hver vev kork fra 2-methylbutane. Raskt fjerne dekkglass, DAB av overflødig 2-methylbutane i begerglasset, og deretter slippe vevet kork i det ytre nitrogen bad. Gjenta for alle gjenværende korker i begeret.
   5. Overfør prøvene i flytende nitrogen eller på tørris tilen -80 ° C fryser for lagring.
   6. Hvis noen vev forblir for nedfrysing, gjenta trinn 1.2.3 til 1.2.4. Tilsett ytterligere 2-metylbutan til begerglasset eller flytende nitrogen til den ytre bad som er nødvendig og gjen avkjøl til -140 ° C. Kast brukte to-methylbutane som farlig avfall.

2. Samle frysesnitt for histologi og RNA-programmer

1. Preparat.
   1. Pre-veie et DNase / RNase-fritt autoklavert rør på en analytisk vekt. Deretter flytter den inn i cryostat kammer for å kjøle. Gjenta til rør er klar for alle sammenslåtte cryosection prøvene som skal samles inn.
   2. For skjelettmuskulatur seksjonering, bekrefter at kryostaten kammertemperaturen er -21 til -22 ° C ved den interne termostat. Overføre noen beholdere med vev som skal skjæres inn i kammeret og tillater beholder (e) for å ekvilibrere til kryostaten temperatur i minst 15 minutter før åpning.
   3. Sett inn en ny engang cryostat blad. Alternativt fjerne den eksisterende blad, spray med RNase dekontaminering løsning, skyll med DDH ₂ O, og sett inn kryostaten avkjøles. Spray en ren klut med 70% etanol og tørk nøye bladet og bladklem plattform.
      1. Spray en ren klut med en RNase dekontaminering løsning og tørk Kryostat børster. Spray en vev med DDH ₂ O, tørk børster igjen og sette dem i cryostat kammer på en ren overflate.
         FORSIKTIG: Kryostaten blad bør dekkes av knivbeskyttelsen når den ikke er i bruk. Dessuten er RNase dekontaminering løsning giftig og vil fryse til å danne en utfelling i kulde kryostaten kammeret. Derfor behandles forsiktig og unngå bruken i kryostaten kammeret.
   4. Innenfor cryostat kammer, plasserer en krone-størrelse dråpe (ca. 300 mL) for å bygge harpiks på en varm eksemplar chuck, sette en vev kork på toppen av harpiks, trykk ned, og deretter sette chucken i freezing rail eller på en rask fryse element hvis tilgjengelig.
   5. Etter innebygging harpiks stivner (hvite), legge til ekstra innebygging harpiks på toppen av korken, rundt nedre 35% av vev og trykk på varmeavlednings inn i innebygging harpiks for en rask fryse til bedre stabilisere vev. Vent i 5 minutter før seksjonering for å tillate harpiksen å herde fullstendig.
   6. Påse at prøveklemmen er i sin mest tilbaketrukket posisjon, lengst fra bladet. Sett vevet prøven chucken i prøveklemmen.
2. Cryosection forberedelse.
   1. Løsne knivbæreren holderen, sett klaringsvinkel av bladet til 10 ° (eller en vinkel som passer for bladet carrier brukes), og skru. Slipp bremsen og vri håndhjulet for å senke muskel mot bladet. Beregn den nærmeste avstanden mellom vev og strå, så flytter vev bort fra bladet og sett på håndhjulbremsen.
   2. Løsne høydejustering lever og bevege knivbæreren fremover eller tilbake, henholdsvis, hvis enden av vev er mer enn ca. 2 mm fra bladet eller hvis bladet treffer vev. Stram og senk vev igjen for å sjekke avstand fra bladet. Gjenta justeringer til kniven er 1 til 2 mm fra enden av vev ved øyemål.
   3. Senk vev mot bladet og vurdere vev vinkel for tverrgående seksjoner. Lås håndhjulet og slipp prøveklemmen spaken. Skyver prøveklemmen høyre eller venstre til den horisontale orientering av vevet er vinkelrett i forhold til bladet.
   4. Skyv prøveklemme opp eller ned for å justere "y" orientering slik at vevssnitt vil være vinkelrett på lengdeaksen av muskelen. Stram prøveklemmen spaken.
   5. Bruke kurset og fine fremførings å avansere prøven til den bare berører bladet. Dersom søker seksjoner fra en bestemt vev dybde, null summen av seksjons tykkelser til null (Toppen av vev).
   6. Sett kryostaten til trim-funksjonen med § tykkelse på 30 mikrometer. Klipp og forkaste deler til forhåndsvalgt dybde for vev samling er nådd (for eksempel 400 mikrometer fra toppen).
3. Samle frysesnitt for RNA ekstraksjon.
   1. Åpne røret for å samle deler og plassere den i nærheten bladet carrier. Bruke en på forhånd avkjølt, ren børste for å plukke opp hver seksjon som det er kuttet fra bladet og overføre cryosection inn i røret. Gjenta til de sammenslåtte seksjoner veie 30 mg eller ønsket vev dybde er nådd.
      MERK: For en voksen mus tibialis anterior, samling fra vev dybde på ca 400 til 4000 nm gir vanligvis 25 - 40 mg. Ved hjelp av metall pinsett til å overføre deler av samlingen røret er ikke anbefalt som seksjonene har en tendens til å feste og klumpe seg på metalloverflaten.
   2. Hvis embedding harpiks omgir muskel cryosection, låse håndbremsen og bruke et barberblad for årake av små biter av harpiks inntil det er bare et tynt lag rundt toppen av muskelen. Alltid skjære harpiks med bladet vinklet bort fra muskelen.
      NB: Et tynt lag av innstøping harpiks ikke i vesentlig grad svekker den nedstrøms RNA-fremstilling. Hvis tykkere embedding harpiks er til stede, bruker børster for å erte den vekk fra muskelen før du flytter cryosection inn i oppsamlingsrøret.
   3. Alternativt basseng seksjoner på bladet carrier og transport i bulk til samlingen røret.
      MERK: Men tendens denne metoden til å være tregere, og delene er mer sannsynlig til å feste og klumpe seg sammen, noe som kan redusere effektiviteten av nålen homogenisering i senere trinn.
   4. Raskt plasser samles cryosection rør inn en analytisk balanse og ta opp røret vekt. røret umiddelbart tilbake til den kalde kryostaten kammeret for å opprettholde avsnitt temperatur nær -20 ° C. Beregn vekten av de samlede seksjonene.
      MERK: Hvis RNA isolering vil skje på annonsenifferent dag, lagre den samlede cryosection røret ved -80 ° C inntil bruk.
4. Samle frysesnitt for histologi.
   1. Trykk på snittykkelsen knappen for fine snitt og bruke pilene til å angi kryostatsnitt tykkelsen til 7 pm (eller andre aktuelle delen tykkelse, typisk 6-10 mikrometer).
      MERK: Tynner seksjoner (6 til 10 um) skal brukes for histologiske anvendelser for å sikre at Fargingsreagensmidlene kan trenge inn i dybden av vevet delen. Tynne deler kan tas fra en hvilken som helst dybde under cryosectioning, men dypere seksjoner er å foretrekke fordi innstøping harpiks, som øker med dybden vev, ikke svekker histologisk farging.
   2. Klipp og forkaste 4 til 7 seksjoner for å få en konsistent, selv vev overflaten. Noter vevet dybde.
   3. Skjære en seksjon og orientere det på overflaten av bladbæreren. Plukk opp seksjonen ved raskt og forsiktig berøre en varm (romtemperatur) objektglasstil avsnittet om bladet carrier. Returner raset til romtemperatur. Fortsett til antall ønskede lysbilder oppnås. Noter den endelige vev dybde.
      MERK: Samle en andre (duplikat) seksjon for hvert vev anbefales.
   4. Med seksjonering komplett, engasjere håndhjulbremsen, returnerer prøven til bakerste posisjon, og ta ut vevet chucken. Bruk kryostaten varmeelement for å smelte innebygging harpiks holder vevet kork på prøven chuck. Fjerne vev kork, tørke med vev, og gå tilbake til lagring.
   5. Gjenta fra trinn 2.1.2 for hver gjenværende vev. Tillat lysbilder for å tørke i 20 minutter etter at den siste vev er montert. Deretter bruker lysbilder for histologiske eller immunfluorescens farging eller fryse ved -80 ° C i et lysbilde boks inntil nødvendig.

3. RNA Isolation av oppsamlet frysesnitt

1. RNA ekstraksjon
   1. Flytte rør (r) av sammenslåtte frysesnitt til is. Umiddelbart legge enorganiske RNA ekstraksjon reagens i et forhold på omtrent 1 ml reagens pr 50 mg cryosection vekt, typisk 600 ul per rør.
      FORSIKTIG: RNA isolering reagenser er giftige, etsende og irriterende. Følg produsentens instruksjoner for sikker håndtering.
   2. Anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 18 gauge nål, trekke RNA-ekstraksjon væsken opp og skyll veggene av røret inntil alt vev suspenderes i oppløsningen. Prøv å minimere luftbobler under nålen homogenisering.
   3. Bruk tuppen av nålen til mos og spre noen klumpet frysesnitt og stykker fester seg til rørveggen. Triturate å homogenisere ved å sende prøven opp og ned gjennom nålen for fem slag, og deretter tilbake prøven til is. Gjenta begge trinn tre til fem ganger, eller så mange ganger som er nødvendig for å forstyrre alle klumper og bestå prøven lett gjennom nålen.
   4. Fjern 18 gauge nål og erstatte den med en 22 gauge nål. nøye triturate prøven for fem slag, og deretter tilbake prøven til is. Gjenta gnidning tre til fire ganger for å oppnå en meget fint dispergert vev homogenat.
      MERK: Hvis vev partikler begynner å blokkere nålen når du tegner opp prøven, fordrive alle prøve fra sprøyten og bytte tilbake til 18 gauge nål for ytterligere homogenisering. En ytterligere triturering trinn med en 25 eller 26 gauge nål kan tilsettes for å oppnå maksimal utbytte. Imidlertid kan nålen bli tilstoppet slik at det er en fare for søl prøve.
   5. Bevege prøve fra is til romtemperatur. Inkuber i 5 min for å forstyrre molekylære komplekser.
   6. I et avtrekksskap, tilsett 0,1 ml 1-brom-3-klorpentan (BCP) per 1 ml av RNA isolering reagens som anvendes (trinn 3.1.1), typisk 60 mikroliter per rør. Rist røret kraftig for hånd i 15 sekunder (ikke vortex). Inkuber prøven ved romtemperatur i 2 til 3 min. Deretter, sentrifuger i 15 minutter ved 12000 xg og 4 ° C.
      FORSIKTIGHET:
   7. Samle forsiktig det øvre vandige fase (fargeløst) inneholdende RNA og overføre den til et rent rør. Legge til et likt volum av 70% etanol (i DEPC vann) og vortex å blande. Inkuber ved romtemperatur i opp til 10 min.
      MERK: det midtre og nedre inter fenol-BCP faser kan bli behandlet for genomisk DNA og protein, henholdsvis, i henhold til produsentens instruksjoner eller samles i en fenol-BCP farlig avfall beholder for hensiktsmessig avhending.
2. RNA rensing.
   1. Følg produsentens anvisninger for prøve binding, vasking og eluering med mindre variasjoner ^8. For eksempel:
   2. Plasser en delmengde av DNase / RNase-fritt vann til et 37 ° C bad eller rugemaskin for å pre-varme for trinn 3.2.4.
   3. Tilsett RNA prøven fra 3.1.8 ovenfor til en rensekolonne og sentrifuger prøven i 15 sekved 12.000 xg ved romtemperatur. Hell strømmen gjennom tilbake i den samme kolonne og re-sentrifuge. Gjenta en ekstra gang for å maksimere RNA bindende, og deretter kaste den endelige strømmen gjennom.
   4. Utfør vasketrinn i henhold til produsentens instruksjoner ^8. Påfør 700 mL av vaskebuffer (ingen etanol) til kolonnen, ring for 15 sek på 12 000 xg, og kast flyten gjennom.
   5. Legg 500 mL av vaskebuffer (med etanol) til kolonnen, ring for 15 sek på 12 000 xg, og kast flyten gjennom. Gjenta dette trinnet en gang.
   6. Spinn tom kolonne i 1 min ved 12.000 xg å tørke membranen.
   7. Overfør spinnkolonne til en ren RNase-, DNase-frie rør. Legg 40 ul forvarmet DNase / RNase-fritt vann (fra 3.2.1) til midten av kolonnen membran på. Ved romtemperatur, inkuberes i 2 minutter og deretter sentrifuger i 2 minutter ved 12000 x g.
      MERK: 40 ul elueringsvolum er ca 1,3 mL per mg av originalevev for 30 mg sammenslåtte frysesnitt. Juster elueringsvolumet som passer for forskjellige start vev vekter, men ikke redusere under 32 mikroliter. En andre eluering ved bruk av ca 0,7 ul per mg av opprinnelig vev, kan tilsettes for å øke total RNA utbytte.
   8. Analyser RNA (kolonne-eluering) for konsentrasjon og renhet ved hjelp av et spektrofotometer, elektroforese, og / eller en Bioanalyzer. Oppbevar RNA ved -80 ° C inntil nødvendig for nedstrøms applikasjoner, for eksempel revers transkripsjon for kvantitativ PCR ^4.
      MERK: En DNase behandling anbefales før du bruker RNA i nedstrømsapplikasjoner. Denne behandlingen kan utføres på noen RNA rensningskolonner før vasketrinnet, i dette bestemte punkt etter kolonne-eluering, eller på en aliquot av RNA som det første trinnet i en hvilken som helst nedstrøms søknad. RNA bør være stabilt i flere år.

4. Histologisk analyse av Immunofluorescent Staining Muscle frysesnitt

1. Enkelt immunfluorescens protokollen.
   1. Bruk en hydrofob penn til sirkelen gruppen av seksjonene på hvert lysbilde. Forsiktig slippe PBS inn i sirklet området (ca. 80 mL for et lite areal opp til 500 ul i en stor overflate), være forsiktig med å ta på vev. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
      MERK: Hvis du bruker frosne lysbilder, fjerne lysbilder fra -80 ° C fryser og inkuberes ved romtemperatur i 20 til 30 minutter å tine og tørke, deretter fortsetter som ovenfor. Minst to lysbilder er nødvendig: en eksperimentell lysbilde som skal inkuberes i primær og sekundær antistoff; og en kontroll lysbilde som primært antistoff er utelukket, den "sekundær bare" kontroll.
   2. Tips lysbildet å helle av PBS. Tilsett 5% esel serum i PBS (blokkeringsløsning) til den sirkel området; være forsiktig for å sikre at muskel deler ikke tørker ut. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter (eller opp til flere timer i et fuktighetskammer).
   3. Forbered primær antistoff løsning for å analysere muskel regenerasjon. Bland blokkeringsløsning, med en eMHC antistoff (1:40) og en ColVI antistoff (1: 1000). Forbered ca 150 mL, 300 mL eller 500 mL for små, mellomstore eller store lysbilde områder, henholdsvis. Vortex i 5 sekunder, og deretter sentrifuger i 2 minutter ved 15.000 x g for å pelletere eventuell utfelling.
   4. For eksperimentelle lysbilder, tips lysbildet å helle av blokkering løsning og deretter legge primær antistoff løsning fra 4.1.3. For sekundær kontroll lysbilde, tips lysbildet å helle av blokkering løsning og deretter legge fersk blokkering løsning (uten antistoff). Inkuber glir i et fuktighetskammer ved 4 ° C over natten.
      MERK: Ved pipettering av antistoffløsninger på objektglass, alltid trekke væske fra toppen av den primære antistoffløsning rør, ikke forstyrre eventuell utfelling på bunnen av røret.
   5. Tips glir å helle av løsning. Legg PBS dråpevis til sirklet regionen i hvert bilde for å vaske, til tips helleoff, og deretter legge mer PBS og inkuberes i 3 til 5 min. Gjenta til totalt tre vaskinger.
      MERK: Vasketiden er ganske fleksibel og kan forlenges opp til 20 min hvis det er ønskelig. Generelt er antall endringer løsnings viktigere enn tiden.
   6. Fremstille sekundært antistoff løsning for alle bakker (inkludert den sekundære styreskyveren) under anvendelse av en 1: 500 fortynning av røde og grønne fluoroforen koblet sekundære antistoffer for påvisning av mus lgG1 (eMHC) og kanin-IgG (ColVI) og 1: 10000 fortynning av DAPI atom flekk.
      1. For eksempel, bland 1 mL av DAPI med 9 mL av DDH ₂ O for å lage en 1:10 fortynning av DAPI. Så, for en 500 mL endelig volum, tilsett 1,0 mL anti-mus IgG1-rød + 1,0 mL anti-kanin IgG-grønn + 0,5 mL 01:10 DAPI til 447.5 mL av blokkering løsning. Vortex å blande og sentrifuge i 2 minutter ved 15.000 x g for å pelletere eventuell utfelling.
         MERK: Ideelt sett alle sekundære antistoffer bør være fra de samme vertsart.
   7. Tips lysbildene å helle av den siste PBS vask. Legg sekundært antistoff løsning for å dekke alle vev. Dekk lysbilder for å beskytte dem mot lys og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
      MERK: Alle sekundære antistoffer skal valideres for å ha minimal kryssreaksjon med andre arter i doble merking eksperimenter.
   8. Vask lysbildene som beskrevet i 4.1.5. Etter siste vask, tips lysbildet å helle av PBS og sette lysbildet på en vev. Legg 3 til 4 dråper av en vandig monteringsmateriale langs en side.
   9. Still kanten av en glass dekkglass bare til den ytre kant av monterings media. Bruk pinsett, sakte senke dekkglass mot vev, da slipper dekkglass og banke forsiktig på den på plass. Til slutt, trykk forsiktig hvert hjørne av dekkglass for å stabilisere den.
   10. Beskytt lysbildene fra lys og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
       MERK: For langtidslagring, påfør et tynt lag med neglelakk langs kanten av the dekkglass for å hindre lysbildet fra tørking.
2. Histologisk evaluering.
   1. Bilde lysbilder ved hjelp av en epifluorescent eller konfokalmikroskop med passende filtre for å oppdage eMHC (rød); ColVI (grønn); og DAPI-farget kjerner (blå), vanligvis ved hjelp av en 20X objektiv ^1,5.
   2. Bekrefte at det fluorescente signalet fra eksperimentelle lysbilder er forskjellig fra den sekundære styreskyveren for å demonstrere spesifisiteten av eMHC og ColVI deteksjon ^4.
      MERK: eMHC positive Regenererende fibrene skal være synlig fra ca 2 til 7 dager etter en muskelskade og trinnløst i mus med muskeldystrofi. Kollagen VI er tilstede i den ekstracellulære matriks som omgir muskelfibre, blodkar, og nerver og i større bindevev bunter av peri- og epimysium. DAPI nukleær flekk er nyttig for å identifisere muskelfibre på sentralkjerner versus periferikjerner som angir fiber regenerering, og tilstedeværelsen av infiltrating celler. Nekrotiske eller skadde fibre kan farge svakt med mus IgG sekundært antistoff grunnet påvisning av endogent IgG som penetrerer fibrene gjennom ødelagte muskelmembraner.
   3. For å kvantifisere regenerering, ta overlappmikroskopbilder med hver fluorescerende filter over hele bildet. Flett eMHC, ColVI og DAPI bilder for hvert sted, og deretter justere bildene for å rekonstruere et kart over hele avsnitt ^1,5.
   4. Ved hjelp av analyse programvare, telle antall eMHC positive fibre og det totale antallet fibre å beregne siste regenerering (100 * (# eMHC + fiber / # Total fiber)). Også telle antall sentralt kjerneholdige fibre ut av de totale fibre for å måle regenerering over en lengre periode (100 * (# CN + fibre / # totale fiber)) ^1,5.

Representative Results

Muscle cryosection RNA er høy kvalitet og gir tilstrekkelig avkastning for de fleste bruksområder

Analyser av seksten skjelettmuskel RNA- preparater er vist i tabell 1 under anvendelse av 19,4 til 41 mg av samle tibialis anterior (TA) muskel fra 8 kontrollmus. Både venstre (L) og høyre (R) TA muskler ble utarbeidet i regenerering eksperimenter med muskler samlet 3 dager etter lengdeintramuskulær injeksjon av 25 ul av saltvann eller 10 mm Cardiotoxin å forårsake muskel skader ved hjelp av metoder som tidligere er rapportert ^ett. Som vist i tabell 1, har A260 / 280-forhold for muskel cryosection RNA er vanligvis i nærheten av to eller høyere i disse representative prøver. Som "ren" RNA anses å ha A260 / 280 på 2,0 og A260 / 280 på 1,8 til 2,2, er utmerket ⁹ renheten av cryosection RNA prøver. Total RNA utvinning var vanligvis over 10 ug per prøve med utbytter på 0,18 til over 1 ug total RNA pr mg utgangs vev, og gir tilstrekkelig materiale for de fleste nedstrømsapplikasjoner. Spesielt, RNA-konsentrasjon, total RNA ekstrahert og RNA utbytte pr mg utgangs vev fra muskler TA 3 dager post-toksin skade var vesentlig høyere enn fra saltvann-injiserte TAS. Dette tyder på at det ikke er forbedret homogenisering når muskelstruktur blir forstyrret av omfattende skader og / eller at det er en økning i gentranskripsjon og / eller RNA-stabilitet i tre dagers regenererende muskel. Utholdenhet av RNA-kvalitet ble vurdert ved enkel 1 x TAE / 1,5% agarose-gel elektroforese av 1 pl av muskel cryosection RNA etter at prøvene ble lagret ved -20 ° C i 18 måneder. Prominente 18S og 28S rRNA band er fortsatt tydelig i prøver som viser høy RNA kvalitet, selv under suboptimale lagringsforhold (Figur 1a).

Muskel cryosection RNAstøtter nedstrømsapplikasjoner

Ett mikrogram RNA pr sammenslåtte cryosection prøve ble behandlet med DNase og revers transkribert fra oligo dT primere. Etter RNase-behandling, det totale volumet av den reverstranskribert cDNA var 30 ul. Enkel ikke-kvantitativ PCR med overskudd av amplifikasjon ble kjørt for å bekrefte levedyktigheten av cDNA. Myogenic regulerende faktor 4 (Mrf4), en transkripsjonsfaktor oppregulert med muskel differensiering, ble forsterket ved hjelp av tidligere rapporterte muse primere, sanse 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC og antisense 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG ^10, fra 2 mL av malen med standard PCR. Det var sterk, spesifikk amplifikasjon av 234 bp Mrf4 fragment fra både høyre og venstre TA cDNA-prøver, men ikke RT- (RNA inkludert, men ingen revers transkriptase), RT DDH ₂ O (revers transkripsjon med ingen RNA-templat) eller DDH ₂ O PCR kontroller (Figur 1b).De samme prøver ble kjørt i triplikat for Mrf4 og mOaz1 henvisning kontroll ⁴ kvantifisering ved hjelp av relativ forsterkning og passiv fluorescens referanse på en sanntids-PCR-system. Mrf4 ble uttrykt på 0,097 ganger i toksinproduserende injisert rett TA i forhold til saltvann-injisert venstre TA, beregnet av ΔΔCt metode ^4. Dette ligner på tidligere rapporter om lav Mrf4 uttrykk 3 dager etter toksin skade på grunn av tap av modne muskelfibre ^11. Å sammenligne konsistensen av cryosection RNA for kvantitativ PCR, ble Ct-verdier i forhold til mOaz1 referansen genet. Fra seks prøver ble mOaz1 transkripsjon oppdaget med en gjennomsnittlig Ct av 17,242 ± 1,483 sd, mens den gjennomsnittlige Ct var 36,332 ± 3,61 sd i RT-kontrollprøver (n = 4). Den stramme gruppering av mOaz1 Ct signaler over prøvene tyder på at RNA isolert fra TA muskelfrysesnitt opptrer som forventet i nedstrøms RNA uttrykk analyser.

Eksempler på indirekte immunfluorescens farging av 7 mikrometer tibialis anterior muskel seksjoner fra kull kontroll mus 3 dager etter injeksjon toksin er vist å detektere regenererende fibre (figur 2). Begge delene ble samlet fra muskel mindre enn 150 um fra regionen som skal brukes for RNA-analyse på en dybde på 4,5 til 4,6 mm fra den proksimale muskelen overflate. Embryonic myosin tung kjede (eMHC, rød) oppdager regenererende fiber, kollagen VI (ColVI, grønn) skisserer muskelfibre, og DAPI flekker kjerner blå, ifølge protokollen 4. Regioner med konsentrert atom infiltrat (blå signal) indikerer områder av toksinet skader , slik det fremgår ved aktivering av eMHC positive nylig regenererende muskelceller. Hel del kart som dette eksemplet brukes for kvantifisering av regenerering ved å beregne hvor stor andel av embryonic myosin tung kjede-uttrykke fibre (rød, nylig regenereres) eller sentralt kjerneholdige fibre som rapportert tidligere ^en. Spesielt er det overraskende liten skade på muskelen i figur 2A. Mens det er variasjon mellom injeksjonene, typiske toxin injeksjoner påvirke en mye større andel av muskelen kammer ^1, som vist i figur 2B. Derfor foreslår dette histologisk analyse at toksinet skader i figur 2A var minimal og gir et viktig verktøy for å tolke genuttrykk data fra sammenhengende muskel cryosection RNA prøven. Hvis hele muskelen hadde blitt brukt for RNA forberedelse av standard slipemetoder, ville uventet liten skade område av denne prøven gjør det en avvikende som ville skew nedstrøms analyser. I stedet sammenkobling histologisk kvantifisering fra samme muskel tillater direkte måling av omfanget av skaden fra tilstøtende seksjoner. Dette muliggjør bruk av inklusjon / eksklusjonskriterier for å sikre at alle prøvene som inngår i nedstrøms RNA analyser møte et minimum skade terskel eller normalisering av RNA-analyser i henhold til skade størrelse.

Figur 1: kvalitetsvurdering av RNA av oppsamlet Muscle frysesnitt. A) 18S og 28S ribosomale RNA band er fremtredende i RNA fra sammenslåtte muskelfrysesnitt 18 måneder etter RNA forberedelse. B) Ikke-kvantitativ PCR for Mrf4 følgende revers transkripsjon. 200 og 300 bp bånd av en DNA-stige, er angitt. RT-, revers transkripsjon omsetning med RNA-templat, men ingen revers transkriptase. RT-H ₂ O, revers transkripsjon med DDH ₂ O, ingen RNA-templat. H ₂ O, ikke-templat PCR-kontroll med DDH ₂ O. I disse forsøk toksin ble injisert i høyre tibialis anterior (RTA) og saltvann was sprøytet inn i den venstre (LTA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Eksempel på Histologiske Maps for muskelregenerasjonenen Studies. A, B) Kompilerte kart enkelt tibialis anterior muskelen §§ 3 dager etter toksin injeksjon viser eksempler på dårlig (A) og normal (B) toksin-indusert skade. Hvite eske regioner i hver seksjon kartet er vist som innfelte bilder for høyere forstørrelse visning, Red, embryonale myosin tung kjede; grønn, kollagen VI ekstracellulære matrix protein; blå, DAPI atom flekken. Scale bar, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Representant RNA utbytte og renhet Målinger fra Sammenslåtte Muscle frysesnitt. Seksten tibialis anterior (TA) muskler ble seksjonert og sammenslåtte cryosection prøver ble behandlet for RNA. Renset RNA (1 ul) ble analysert med en nanospectrophotometer. Kolonne statistikk ble utført i et regneark, ble gruppesammenligninger utført ved hjelp av statistisk programvare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT