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Biology

जीन एक्सप्रेशन और histological विश्लेषण के लिए एक एकल माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्र के Cryosectioning

Published: December 12, 2016 doi: 10.3791/55058
Automatic Translation
1
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

Summary

लगातार क्रायो वर्गों जीन अभिव्यक्ति एक माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्रों का उपयोग माप के लिए ऊतकीय अनुप्रयोगों और आरएनए के संवर्धन के लिए सक्षम करने के लिए एकत्र कर रहे हैं। उच्च गुणवत्ता शाही सेना 20 से प्राप्त होता है - जमा cryosections और माप के 30 मिलीग्राम सीधे आवेदन भर में तुलना कर रहे हैं।

Abstract

इस विधि के साथ, लगातार cryosections जीन अभिव्यक्ति के लिए ऊतक ऊतक विज्ञान और आरएनए के संवर्धन के लिए दोनों माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों एक माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्रों का उपयोग कर सक्षम करने के लिए एकत्र कर रहे हैं। आमतौर पर, यह छोटा सा कंकाल की मांसपेशी के नमूने की पर्याप्त homogenization के लक्ष्य को हासिल करने के लिए क्योंकि बफर मात्रा में कुशल पीस अनुप्रयोगों के लिए बहुत कम हो सकता है, अभी तक पर्याप्त यांत्रिक व्यवधान के बिना चुनौती दे रहा है, बफर अभिकर्मकों की पेशी सीमा प्रवेश के घने ऊतक वास्तुकला, अंततः कम शाही सेना उपज के कारण। प्रोटोकॉल यहां बताया पालन करके, 30 माइक्रोन वर्गों और एकत्र की इजाजत दी cryosectioning और बाद सुई homogenization यंत्रवत् मांसपेशियों को बाधित करने के लिए जमा, सतह बफर प्रवेश के लिए उजागर क्षेत्र बढ़ रही हैं। तकनीक के प्राथमिक सीमाओं कि यह एक cryostat की आवश्यकता है, और यह अपेक्षाकृत कम throughput है। हालांकि, उच्च गुणवत्ता शाही सेना जमा मीटर के छोटे नमूनों से प्राप्त किया जा सकताuscle cryosections, कई अलग अलग कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों के लिए इस विधि सुलभ बना रही है। इसके अलावा, इस तकनीक से मिलान के लिए सक्षम बनाता विश्लेषण (जैसे, ऊतक ऊतकविकृतिविज्ञानी और जीन अभिव्यक्ति) एक कंकाल की मांसपेशी के सटे क्षेत्रों से इतना है कि माप सीधे आवेदन पत्र प्रयोगात्मक अनिश्चितता को कम करने के लिए और स्रोत के लिए एक छोटा सा ऊतक आवश्यक replicative पशु प्रयोगों को कम करने के लिए भर में तुलना की जा सकती कई अनुप्रयोगों।

Introduction

इस तकनीक का लक्ष्य ऐसे ऊतक विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति के रूप में विभिन्न तौर तरीकों, एक एकल छोटे कंकाल की मांसपेशी स्रोत के ऊतकों से सुलभ द्वारा कई प्रयोगात्मक विश्लेषण कर रहा है। माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों सबसे संवेदनशील संरक्षण के तरीकों, जो ध्यान cryopreservation के दौरान बर्फ क्रिस्टल कलाकृतियों के गठन को सीमित करने की नियंत्रित किया जाना चाहिए नमूने के लिए कर रहे हैं। इस प्रकार, विधि विकास tibialis पूर्वकाल पर आधारित है (टीए) मांसपेशी आंशिक रूप से दोनों immunofluorescence माइक्रोस्कोपी और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए स्रोत सामग्री के रूप में एक -140 डिग्री सेल्सियस तरल नाइट्रोजन ठंडा 2-methylbutane स्नान में राल embedding के साथ कवर जमे हुए।

विविध तकनीकी दृष्टिकोण के लिए एक ही स्रोत सामग्री का उपयोग करने की आवश्यकता इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन आधारित प्रयोगों जहां छोड़ दिया और सही मांसपेशियों को अलग अलग परिस्थितियों, एक प्रयोगात्मक और एक नियंत्रण प्रतिनिधित्व करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, मांसपेशियों उत्थान के अध्ययन में, एक म्यूscle व्यापक ऊतकों को नुकसान पैदा करने के लिए है, जबकि contralateral मांसपेशी एक वाहन इंजेक्शन नियंत्रण 1 के रूप में कार्य करता है एक विष के साथ इंजेक्शन है। इसी तरह, मांसपेशियों विकारों के लिए जीन थेरेपी के अध्ययन के लिए आम तौर पर खाली वेक्टर, वेक्टर असंबंधित या contralateral ओर 2 पर वाहन पर नियंत्रण के साथ तुलना की जा इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा जीन थेरेपी वेक्टर के सत्यापन के साथ शुरू करते हैं। इसलिए, यह एक अलग आवेदन करने के लिए स्रोत के लिए प्रत्येक टीए पेशी संभव नहीं है।

इस मुद्दे से निपटने के लिए आम रणनीतियों रहे हैं: i), प्रत्येक आवेदन के लिए एक अलग पेशी समूह का उपयोग करने के द्वितीय) अतिरिक्त चूहों का उपयोग करने के लिए, या iii) प्रत्येक आवेदन के लिए पेशी का एक टुकड़ा काट करने के लिए। हालांकि, मांसपेशी समूहों के बीच काफी मतभेद यह मुश्किल अलग अनुप्रयोगों से डेटा की तुलना करने के लिए बनाते हैं, और अतिरिक्त जानवरों खर्च में वृद्धि और खराब जायज़ है, तो अन्य विकल्प मौजूद हैं। विच्छेदन के बाद मांसपेशियों डिवाइडिंग स्रोत के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सबसे अच्छा विकल्प है मैंn कई मामले हैं। हालांकि, मांसपेशियों टुकड़े अक्सर homogenization 2-5 के लिए तरल नाइट्रोजन या यांत्रिक पीस तकनीक के तहत दलन का उपयोग करने के लिए बहुत छोटे हैं। मांसपेशियों में एक अत्यधिक संरचनात्मक ऊतक बाह्य मैट्रिक्स और सिकुड़ा प्रोटीन के साथ पैक किया जाता है के रूप में, अपर्याप्त यांत्रिक homogenization के बाद डीएनए, आरएनए या प्रोटीन की कम उपज की ओर जाता है। विधि यहाँ विस्तृत कई अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए एक स्रोत पेशी से ऊतक की छोटी मात्रा की अनुमति देता है, और cryosectioning और सुई विचूर्णन के शामिल किए जाने के लिए बेहतर शाही सेना उपज के लिए यांत्रिक homogenization में सुधार।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं पशु का उपयोग प्रोटोकॉल A2013 07-016 (Beedle) के तहत जॉर्जिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. unfixed कंकाल की मांसपेशी के Cryopreservation

  1. तैयारी
    1. छोटे वर्गों एक धार के साथ (लगभग 1 सेमी एक्स 1 सेमी) में काग कटौती, एक अच्छी टिप मार्कर है कि स्रोत माउस और मांसपेशियों की पहचान है, और एक बहुत उथले कटौती करने के लिए 2-methylbutane के लिए प्रतिरोधी है साथ काग पर लिखने (लगभग 1 मिमी) ऊपर की सतह के पार। ऊतक orienting के लिए उपयोग करने के लिए कटौती में एक प्लास्टिक coverslip डालें। दोहराएँ जब तक एक काग के लिए तैयार है के लिए हर ऊतक cryopreserved किया जाना है।
    2. तरल नाइट्रोजन, 2-methylbutane, embedding राल, कम तापमान थर्मामीटर, corks, विच्छेदन उपकरण, और अध्ययन माउस प्राप्त करते हैं।
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन एक संकुचित गैस यदि गरम किया विस्फोट हो सकता है। एक प्रयोगशाला कोट, कम तापमान के दस्ताने, और चेहरे संरक्षण पहन जब तरल नी निपटनेtrogen; त्वचा के साथ संपर्क या आंखों जलता है या शीतदंश का कारण बन सकता है। 2-Methylbutane एक ज्वलनशील, विषाक्त, स्वास्थ्य और पर्यावरण के लिए खतरा है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, सुरक्षा चश्मा) पहनते हैं, एक धूआं हुड में शेयर कंटेनर खोलने के लिए, एक अलग कंटेनर कि कसकर बंद किया जा सकता करने के लिए ठंड (आमतौर पर 200 से 400 मिलीलीटर) के लिए आवश्यक छोटी राशि के हस्तांतरण, और साँस लेना से बचने ।
    3. संज्ञाहरण के तहत इच्छामृत्यु की अनुमोदित विधि के साथ चूहों euthanize। संक्षेप में, एक isoflurane vaporizer से ऑक्सीजन में 2.5% isoflurane के साथ एक साँस लेना कक्ष में माउस डालें, इंतजार बंद हो जाता है जब तक माउस के बाद 20 सेकंड के एक पेडल पलटा के लिए जाँच करने के लिए घूम रहा है। जब पेडल पलटा नकारात्मक है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था 6 से अध्ययन माउस euthanize।
      ध्यान दें: इच्छामृत्यु तरीकों संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदन की आवश्यकता होती है।
    4. त्वचा बाहर का hindlimb overlying निकालें और बस ठीक-बिंदु disse साथ टखने के ऊपर बाहर का पूर्वकाल tendons कटौतीction कैंची। ठीक संदंश के साथ बाहर का tendons समझ और धीरे से ऊपर खींचने के लिए और घुटने की दिशा में पेशी जारी करने के लिए पार्श्व प्रावरणी जबकि काटने। मांसपेशी बाहर सीधा घुटने से खींच और एक अंतिम टीए पेशी 7 आबकारी करने काट कर।
      नोट: टीए मांसपेशी एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रयोग किया जाता है, लेकिन किसी भी माउस कंकाल की मांसपेशी या दिल करता है, तो उपयोगकर्ता की प्रयोगात्मक लक्ष्यों के लिए उपयुक्त इस प्रोटोकॉल में प्रादेशिक सेना के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। केवल सीमा यह है कि एक ऊतक काफी छोटा इसकी गहराई भर में तेजी से cryopreservation प्राप्त करने के लिए होना चाहिए; 1 सेमी एक्स 1 सेमी की एक अधिकतम ऊतक आकार की सिफारिश की है।
    5. विपरीत पैर पर दोहराएँ, और किसी भी अन्य ऊतकों एकत्र होने के लिए बाहर काटना। cryopreservation से पहले ऊतक गिरावट सीमित करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में विच्छेदन प्रदर्शन।
    6. ओरिएंट अपने पूर्व लेबल काग पर अनुप्रस्थ वर्गों के लिए प्रत्येक मांसपेशी। बाहर का पट्टा काग और मांसपेशियों ext के शीर्ष को छूने के साथ काग को सीधा पेशी खड़े हो जाओदूर समाप्त, coverslip द्वारा ईमानदार का आयोजन किया।
    7. विच्छेदन के बाद जितनी जल्दी हो सके ऊतकीय विश्लेषण के लिए सभी ऊतकों cryopreserve, अधिमानतः 5 मिनट, लेकिन निश्चित रूप से नहीं अधिक से अधिक 15 मिनट का समय स्रोत जानवर की euthanization के बाद से गुजरे भीतर।
  2. cryopreservation
    1. विच्छेदन के अंत से पहले पांच मिनट ठंडा cryopreservation स्नान शुरू करो। लगभग 3 सेमी की गहराई के लिए एक खुला धातु बीकर में 2-methylbutane डालो। 2 से 4 सेमी की गहराई तक एक अछूता कंटेनर में तरल नाइट्रोजन डालो। तरल नाइट्रोजन में 2-methylbutane की बीकर सेट करें; नाइट्रोजन फोड़ा करने के लिए शुरू हो जाएगा। 2-methylbutane बीकर में नाइट्रोजन splashing से बचें।
      चेतावनी: एक धूआं हुड या एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में ठंड स्नान तैयार करें।
    2. तापमान पर नजर रखने और एक कांटा के साथ अक्सर हलचल भी ठंडा सुनिश्चित करने के लिए 2-methylbutane में एक कम तापमान थर्मामीटर डालें। हलचल करने के लिए और जारी रखें जब तक शांत 2-मेरेthylbutane -140 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, बाहरी स्नान के रूप में आवश्यक करने के लिए नए तरल नाइट्रोजन जोड़ने।
      नोट: -140 डिग्री सेल्सियस धारीदार मांसपेशियों में बर्फ के क्रिस्टल कलाकृतियों को कम करने के लिए अधिकतम तापमान है; अन्य ऊतकों अलग तापमान पर सबसे अच्छा cryopreserve सकता है (जैसे, मस्तिष्क, -90 डिग्री सेल्सियस)।
    3. पेशी के लिए जहां यह काग से मिलता है और तुरंत -140 डिग्री सेल्सियस पर 2-methylbutane में काग ड्रॉप की 50% - केवल कम 35 embedding राल लागू करें। तेजी से फ्रीज बैच प्रति अप करने के लिए 8 ऊतकों के लिए दोहराएँ। 30 सेकंड के लिए हिलाओ, बीकर के नीचे scraping कि यह सुनिश्चित करने के ऊतकों solidifying 2-methylbutane में स्थिर नहीं है।
    4. एक कांटा का उपयोग करें, 2-methylbutane से प्रत्येक ऊतक काग खींचने के लिए चम्मच या बड़े संदंश रखा। जल्दी, coverslip हटाने बीकर में अतिरिक्त 2-methylbutane बंद थपका, और फिर बाहरी नाइट्रोजन स्नान में ऊतक काग ड्रॉप। बीकर में सभी शेष corks के लिए दोहराएँ।
    5. तरल नाइट्रोजन में या करने के लिए सूखी बर्फ पर स्थानांतरण के नमूनेएक -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए फ्रीजर।
    6. किसी भी ऊतकों cryopreservation के लिए रहते हैं, दोहराने 1.2.4 के लिए 1.2.3 कदम। बीकर या बाहरी स्नान के रूप में आवश्यक और -140 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर से शांत करने के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए अतिरिक्त 2-methylbutane जोड़ें। खतरनाक कचरे के रूप में इस्तेमाल किया 2-methylbutane के निपटान के।

2. प्रोटोकॉल और आरएनए अनुप्रयोगों के लिए cryosections लीजिए

  1. तैयार करना।
    1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर एक DNase / RNase मुक्त autoclaved ट्यूब पूर्व तौलना। तो फिर, यह cryostat कक्ष में स्थानांतरित करने के लिए precool। दोहराएँ जब तक नलियों तैयार हैं सभी जमा cryosection के नमूने एकत्र करने के लिए।
    2. कंकाल की मांसपेशी सेक्शनिंग के लिए, इस बात की पुष्टि है कि cryostat कक्ष तापमान -21 -22 डिग्री सेल्सियस अपनी आंतरिक थर्मोस्टेट के द्वारा होता है। ऊतकों के साथ किसी भी कंटेनरों स्थानांतरण कक्ष में कटौती करने के लिए और कंटेनर (s) खोलने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए cryostat के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. एक नया डिस्पोजेबल cryostat ब्लेड डालें। वैकल्पिक रूप से, मौजूदा ब्लेड हटाने, RNase परिशोधन समाधान के साथ स्प्रे, DDH 2 हे से कुल्ला, और cryostat शांत करने में डालें। 70% इथेनॉल के साथ एक साफ ऊतक स्प्रे और ध्यान से ब्लेड और ब्लेड clamping मंच पोंछे।
      1. एक RNase परिशोधन समाधान के साथ एक साफ ऊतक स्प्रे और cryostat ब्रश साफ कर लें। DDH 2 हे के साथ एक ऊतक स्प्रे, ब्रश फिर से पोंछ और cryostat कक्ष में एक स्वच्छ सतह पर उन्हें सेट।
        चेतावनी: cryostat ब्लेड जब उपयोग में नहीं चाकू गार्ड द्वारा कवर किया जाना चाहिए। इसके अलावा, RNase परिशोधन समाधान विषैला होता है और ठंड cryostat कक्ष में एक वेग फार्म को जमा करेंगे। इसलिए, देखभाल के साथ संभाल और cryostat कक्ष में इसके उपयोग से बचें।
    4. cryostat कक्ष के भीतर, एक सिक्के के आकार ड्रॉप एक गर्म नमूना चक पर राल embedding के (लगभग 300 μl) जगह है, नीचे राल के शीर्ष पर, प्रेस पर एक ऊतक काग सेट, और फिर fr में चक सेटरेल या यदि उपलब्ध हो तो एक तेजी से फ्रीज तत्व पर eezing।
    5. embedding राल solidifies (सफेद) के बाद, काग के शीर्ष पर अतिरिक्त एम्बेडिंग राल जोड़ने के आसपास ऊतक के निचले 35% और एक तेजी से फ्रीज बेहतर ऊतक को स्थिर करने के लिए embedding राल में गर्मी चिमटा दबाएँ। राल पूरी तरह से कड़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए सेक्शनिंग से पहले 5 मिनट रुको।
    6. सुनिश्चित करें कि नमूना दबाना इसकी सबसे मुकर स्थिति, ब्लेड से सब से अधिक दूर है। नमूना दबाना में ऊतक नमूना चक डालें।
  2. Cryosection तैयारी।
    1. ब्लेड वाहक धारक ढीला, 10 डिग्री (या एक कोण ब्लेड का इस्तेमाल किया वाहक के लिए उपयुक्त) के लिए ब्लेड की निकासी कोण सेट, और फिर से कस लें। ब्रेक रिलीज और ब्लेड की दिशा में पेशी कम करने के लिए हाथ पहिया बारी है। ऊतक और ब्लेड के बीच करीबी दूरी का अनुमान है, तो ब्लेड से दूर ऊतक के लिए कदम और हाथ पहिया ब्रेक संलग्न हैं।
    2. ऊंचाई समायोजन छुट्टी ढीलाआर और ब्लेड वाहक आगे या पीछे ले जाते हैं, क्रमशः, अगर ऊतक के अंत ब्लेड से लगभग 2 मिमी से अधिक है या ब्लेड ऊतक हमलों हैं। कसो और ब्लेड से दूरी की जांच करने के लिए ऊतक फिर से कम है। समायोजन दोहराएँ जब तक ब्लेड दृश्य अनुमान से ऊतक के अंत से 1 से 2 मिमी है।
    3. ब्लेड की ओर ऊतक के निचले हिस्से और अनुप्रस्थ वर्गों के लिए ऊतक कोण का आकलन करें। हाथ व्हील लॉक और नमूना दबाना लीवर जारी। पुश नमूना दबाना छोड़ दिया है या सही है जब तक ऊतक के क्षैतिज अभिविन्यास ब्लेड को सीधा है।
    4. इतना है कि ऊतक वर्गों मांसपेशियों की लंबी अक्ष को सीधा किया जाएगा "वाई" उन्मुखीकरण को समायोजित करने के लिए नीचे धक्का या नमूना अप दबाना। नमूना दबाना लीवर मजबूत करनी होगी।
    5. नमूना अग्रिम करने के लिए जब तक यह सिर्फ ब्लेड से छू पाठ्यक्रम और ठीक आगे फ़ीड का प्रयोग करें। अगर एक विशेष ऊतक गहराई से वर्गों की मांग, शून्य करने के लिए की धारा मोटाई योग रीसेट (ऊतक के ऊपर)।
    6. 30 माइक्रोन से कम मोटाई के साथ खंड ट्रिम समारोह के लिए cryostat सेट करें। कट और जब तक ऊतक संग्रह के लिए चुने हुए गहराई तक पहुँच जाता है वर्गों त्यागने (जैसे, 400 ऊपर से माइक्रोन)।
  3. आरएनए निकासी के लिए cryosections लीजिए।
    1. एकत्रित वर्गों के लिए ट्यूब खुला और ब्लेड वाहक के पास जगह है। के रूप में यह ब्लेड से कट जाता है प्रत्येक अनुभाग लेने के लिए और ट्यूब में cryosection हस्तांतरण करने के लिए एक पूर्व ठंडा, साफ ब्रश का उपयोग करें। दोहराएँ जब तक जमा वर्गों 30 मिलीग्राम तौलना या वांछित ऊतक गहराई तक पहुँच जाता है।
      नोट: - 40 मिलीग्राम एक वयस्क माउस tibialis पूर्वकाल के लिए, लगभग 400 से 4,000 मीटर की गहराई ऊतक से संग्रह आमतौर पर 25 पैदावार। धातु संदंश का प्रयोग संग्रह ट्यूब के लिए वर्गों को हस्तांतरण करने की सिफारिश नहीं है के रूप में वर्गों चिपके रहते हैं और धातु की सतह पर पेड़ों का झुरमुट के लिए करते हैं।
    2. embedding राल पेशी cryosection चारों ओर से घेरे है, तो handbrake के लॉक और एक रेजर ब्लेड का उपयोगराल के छोटे टुकड़े दाढ़ी तक वहां केवल मांसपेशियों के ऊपर चारों ओर एक पतली परत है। ब्लेड के साथ राल हमेशा कटौती पेशी से दूर angled।
      नोट: राल embedding काफी हद तक नीचे की ओर आरएनए तैयारी ख़राब नहीं करता है की एक पतली परत। अगर मोटा embedding राल मौजूद है, ब्रश का उपयोग संग्रह ट्यूब में cryosection जाने से पहले यह मांसपेशियों से दूर तंग करने के लिए।
    3. वैकल्पिक रूप से, ब्लेड वाहक और संग्रह ट्यूब के लिए थोक में हस्तांतरण पर पूल वर्गों।
      नोट: हालांकि, इस पद्धति धीमी हो जाता है, और वर्गों अधिक चिपके रहते हैं और एक साथ पेड़ों का झुरमुट, जो बाद के चरणों में सुई homogenization की क्षमता को कम कर सकते हैं की संभावना है।
    4. जल्दी से एक विश्लेषणात्मक संतुलन और रिकॉर्ड ट्यूब वजन में जमा cryosection ट्यूब जगह। तुरंत ठंडे cryostat चैम्बर ट्यूब वापसी -20 डिग्री सेल्सियस के पास अनुभाग तापमान बनाए रखने के लिए। जमा वर्गों के वजन की गणना।
      ध्यान दें: शाही सेना अलगाव विज्ञापन पर घटित होगा तोifferent दिन, उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस -80 में जमा cryosection ट्यूब की दुकान।
  4. ऊतक विज्ञान के लिए cryosections लीजिए।
    1. ठीक सेक्शनिंग और उपयोग तीर 7 माइक्रोन (या अन्य उपयुक्त अनुभाग मोटाई, आम तौर पर 6 से 10 माइक्रोन के लिए) के लिए cryostat खंड मोटाई स्थापित करने के लिए खंड मोटाई बटन दबाएँ।
      नोट: पतली वर्गों (6 से 10 माइक्रोन के लिए) ऊतकीय अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने धुंधला अभिकर्मकों ऊतक अनुभाग की गहराई घुसना कर सकते हैं। पतली वर्गों cryosectioning के दौरान किसी भी गहराई से लिया जा सकता है, लेकिन गहरी वर्गों पसंद कर रहे हैं क्योंकि embedding राल, जो ऊतकों को गहराई के साथ बढ़ जाती है, ऊतकीय धुंधला ख़राब नहीं करता है।
    2. कट और एक सुसंगत, यहां तक ​​कि ऊतक सतह प्राप्त करने के लिए 4 से 7 वर्गों त्यागें। ऊतक गहराई के नोट करें।
    3. एक खंड कट और ब्लेड वाहक की सतह पर यह उन्मुख। जल्दी से और धीरे से एक गर्म (कमरे के तापमान) खुर्दबीन स्लाइड छू अनुभाग द्वारा उठाओब्लेड वाहक पर अनुभाग के लिए। कमरे के तापमान को स्लाइड लौटें। जारी रखें जब तक वांछित स्लाइड्स की संख्या प्राप्त की है। अंतिम ऊतक गहराई के नोट करें।
      नोट: प्रत्येक ऊतक के लिए एक दूसरे (डुप्लिकेट) धारा एकत्रित की सिफारिश की है।
    4. पूरा सेक्शनिंग के साथ, हाथ पहिया ब्रेक संलग्न रियर सबसे स्थिति के लिए नमूना वापस, और ऊतक चक हटा दें। embedding राल नमूना चक पर ऊतक काग पकड़े पिघल करने के लिए cryostat गर्मी तत्व का प्रयोग करें। ऊतक काग निकालें, ऊतक के साथ सूखी, और भंडारण के लिए वापसी।
    5. प्रत्येक शेष ऊतक के लिए कदम 2.1.2 से दोहराएँ। बाद पिछले ऊतक मुहिम शुरू की है स्लाइड 20 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें। फिर, एक स्लाइड बॉक्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकीय या immunofluorescent धुंधला या फ्रीज के लिए स्लाइड का उपयोग करें जब तक की जरूरत है।

3. जमा cryosections से शाही सेना अलगाव

  1. शाही सेना निष्कर्षण
    1. हटो ट्यूब (s) करने के लिए बर्फ जमा cryosections की। इसके तत्काल बाद एक जोड़नेप्रति 50 मिलीग्राम cryosection वजन लगभग 1 मिलीलीटर अभिकर्मक, आम तौर पर ट्यूब प्रति 600 μl के अनुपात में जैविक आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक।
      चेतावनी: शाही सेना अलगाव अभिकर्मकों, विषाक्त संक्षारक, और परेशान कर रहे हैं। सुरक्षित हैंडलिंग के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. एक 18 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, शाही सेना निकासी तरल तैयार करने और ट्यूब की दीवारों कुल्ला जब तक सभी ऊतक समाधान में निलंबित कर दिया है। सुई homogenization के दौरान हवाई बुलबुले को कम करने की कोशिश करें।
    3. मुहब्बत और किसी भी clumped cryosections और टुकड़े ट्यूब दीवार का पालन करने को फैलाने के लिए सुई की नोक का प्रयोग करें। Triturate पांच स्ट्रोक के लिए सुई के माध्यम से नमूना ऊपर और नीचे से गुजर रहा homogenize करने के लिए, और फिर बर्फ के लिए नमूना वापसी। दोहराएँ दोनों तीन से पांच गुना, या के रूप में कई बार के कदम के रूप में सभी गुच्छों को बाधित और सुई के माध्यम से आसानी से नमूना पारित करने के लिए आवश्यक है।
    4. 18 गेज सुई निकालें और एक 22 गेज सुई के साथ बदलें। ध्यान से टीआरपांच स्ट्रोक के लिए नमूना iturate, और फिर बर्फ के लिए नमूना वापसी। एक बहुत ही भावपूर्ण छितरी ऊतक homogenate प्राप्त करने के लिए विचूर्णन दोहराएँ तीन से चार गुना।
      नोट: ऊतक कणों जब नमूना ड्राइंग सुई ब्लॉक करने के लिए शुरू करते हैं, सिरिंज से सभी नमूना निष्कासित और वापस आगे homogenization के लिए 18 गेज सुई के लिए स्विच। एक 25 या 26 गेज सुई के साथ एक अतिरिक्त विचूर्णन कदम अधिक से अधिक उपज प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है। हालांकि, सुई भरा हो सकता है तो वहाँ नमूना spilling के एक जोखिम है।
    5. बर्फ से कमरे के तापमान को नमूना ले जाएँ। 5 मिनट के लिए सेते आणविक परिसरों को बाधित करने के लिए।
    6. एक धूआं हुड में, ट्यूब प्रति शाही सेना अलगाव अभिकर्मक का इस्तेमाल किया 1-ब्रोमो-3-chloropentane (बीसीपी) 1 मिलीलीटर प्रति (कदम 3.1.1) के 0.1 मिलीलीटर, आम तौर पर 60 μl जोड़ें। 15 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती ट्यूब हिला (भंवर नहीं है)। 2 से 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना सेते हैं। फिर, 12,000 XG पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र।
      सावधान:
    7. ध्यान से ऊपरी जलीय चरण (बेरंग) युक्त शाही सेना को इकट्ठा करने और एक स्वच्छ ट्यूब को हस्तांतरण। 70% इथेनॉल (DEPC पानी में) और मिश्रण करने के भंवर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें। अप करने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      नोट: मध्य और निचले अंतरावस्था फिनोल-बीसीपी चरणों निर्माता के निर्देशों के या उचित निपटान के लिए एक फिनोल-बीसीपी खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में एकत्र अनुसार जीनोमिक डीएनए और प्रोटीन, क्रमशः के लिए कार्रवाई की जा सकती है।
  2. आरएनए शुद्धि।
    1. बाध्यकारी नमूना, कपड़े धोने और मामूली बदलाव के साथ 8 क्षालन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। उदाहरण के लिए:
    2. पूर्व गर्म करने के लिए कदम 3.2.4 के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस स्नान या इनक्यूबेटर में DNase / RNase मुक्त पानी के एक विभाज्य रखें।
    3. एक शुद्धि स्तंभ के ऊपर 3.1.8 से शाही सेना नमूना जोड़ें और 15 सेकंड के लिए नमूना अपकेंद्रित्रकमरे के तापमान पर 12,000 XG पर। पीठ के माध्यम से प्रवाह उसी स्तंभ और फिर से सेंट्रीफ्यूज में डालो। आरएनए बाध्यकारी को अधिकतम, और उसके बाद के माध्यम से अंतिम प्रवाह त्यागने के लिए एक अतिरिक्त समय दोहराएँ।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 8 धोने चरणों का प्रदर्शन। 12,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्तंभ को धो बफर के 700 μl (कोई इथेनॉल), स्पिन लागू करें, और के माध्यम से प्रवाह त्यागें।
    5. 12,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्तंभ को धोने बफर (इथेनॉल के साथ) के 500 μl, स्पिन जोड़ें, और के माध्यम से प्रवाह त्यागें। यह कदम एक बार दोहराएँ।
    6. 12,000 XG पर 1 मिनट के लिए खाली स्तंभ स्पिन झिल्ली को सुखाने के लिए।
    7. एक साफ RNase-, DNase मुक्त करने के लिए ट्यूब स्पिन स्तंभ स्थानांतरण। स्तंभ झिल्ली के केंद्र के लिए (3.2.1) से पूर्व गर्म DNase / RNase मुक्त पानी के 40 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर, 2 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 12,000 एक्स जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
      नोट: 40 μl क्षालन मात्रा मूल के मिलीग्राम प्रति लगभग 1.3 μl हैजमा cryosections के 30 मिलीग्राम के लिए ऊतक। अलग प्रारंभिक ऊतक वजन के लिए के रूप में उपयुक्त क्षालन मात्रा समायोजित करें, लेकिन 32 μl नीचे कम नहीं है। एक दूसरे क्षालन, मूल ऊतक के मिलीग्राम प्रति लगभग 0.7 μl का उपयोग कर, कुल शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता है।
    8. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, वैद्युतकणसंचलन, और / या एक bioanalyzer से एकाग्रता और पवित्रता के लिए आरएनए (स्तंभ क्षालन) का विश्लेषण। -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना को स्टोर जब तक इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर 4 के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों, के लिए की जरूरत है।
      नोट: एक DNase उपचार बहाव के अनुप्रयोगों में शाही सेना के उपयोग से पहले की सिफारिश की है। इस इलाज के कुछ आरएनए शुद्धि स्तंभों पर धोने कदम से पहले, इस विशिष्ट बिंदु पर स्तंभ क्षालन निम्न या किसी बहाव के आवेदन में पहले कदम के रूप में शाही सेना के एक विभाज्य पर प्रदर्शन किया जा सकता है। आरएनए कई वर्षों के लिए स्थिर होना चाहिए।

4. histological विश्लेषण Immunofluorescent Stainin द्वारास्नायु cryosections जी

  1. सरल इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल।
    1. प्रत्येक स्लाइड पर वर्गों के समूह सर्कल के लिए एक हाइड्रोफोबिक कलम का प्रयोग करें। धीरे परिक्रमा क्षेत्र में पीबीएस ड्रॉप (लगभग 80 एक बड़े सतह क्षेत्र के लिए 500 μl अप करने के लिए एक छोटे से सतह क्षेत्र के लिए μl), ऊतकों को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: यदि जमे हुए स्लाइड्स का उपयोग कर, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से स्लाइड्स निकालें और कमरे के तापमान पर सेते 20 से 30 मिनट पिघलना और सूखी है, तो ऊपर के रूप में आगे बढ़ने के लिए। कम से कम दो स्लाइड्स की जरूरत है: एक प्रयोगात्मक स्लाइड प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में incubated किया जा सके; और जो प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक नियंत्रण स्लाइड बाहर रखा गया है, "माध्यमिक केवल" नियंत्रण।
    2. पीबीएस टपकना करने के लिए स्लाइड युक्ति। पीबीएस (अवरुद्ध समाधान) परिक्रमा क्षेत्र में 5% गधा सीरम जोड़ें; यह सुनिश्चित करने के लिए कि मांसपेशियों वर्गों बाहर सूखी नहीं सावधान रहना होगा। कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता चैम्बर में कई घंटे तक 30 मिनट के लिए सेते हैं (या)।
    3. पेशी उत्थान विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। अवरुद्ध समाधान, एक eMHC एंटीबॉडी (01:40) और एक ColVI एंटीबॉडी (: 1,000 1) के साथ मिक्स। लगभग 150 μl, 300 μl या 500 μl छोटे, मध्यम या बड़े स्लाइड क्षेत्रों के लिए क्रमश: तैयार करें। 5 सेकंड के लिए भंवर, और फिर 15,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र किसी भी वेग गोली।
    4. प्रयोगात्मक स्लाइड्स के लिए, समाधान को रोकने के लिए रवाना डालना और फिर 4.1.3 से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने स्लाइड टिप। माध्यमिक नियंत्रण स्लाइड के लिए, अवरुद्ध समाधान डालना और फिर नए सिरे से अवरुद्ध समाधान (कोई एंटीबॉडी) जोड़ने के लिए स्लाइड टिप। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड्स सेते हैं।
      नोट: जब स्लाइड पर एंटीबॉडी समाधान pipetting, हमेशा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ट्यूब के ऊपर से तरल पुल, ट्यूब के नीचे किसी भी वेग को बाधित न करें।
    5. टिप समाधान टपकना करने के लिए स्लाइड। प्रत्येक स्लाइड की परिक्रमा क्षेत्र के लिए पीबीएस dropwise जोड़े धोने के लिए, टिप डालनाबंद, तो अधिक पीबीएस जोड़ने और 3 से 5 मिनट के लिए सेते हैं। तीन washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
      नोट: धो समय काफी लचीला है और अगर वांछित 20 मिनट तक lengthened जा सकता है। आम तौर पर, समाधान परिवर्तन की संख्या समय की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है।
    6. (माध्यमिक नियंत्रण स्लाइड सहित) सभी स्लाइड्स के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार एक 1 का उपयोग: DAPI परमाणु के 10,000 कमजोर पड़ने: माउस IgG1 (eMHC) और खरगोश आईजीजी (ColVI) और 1 पता लगाने के लिए लाल और हरे रंग की fluorophore युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 500 कमजोर पड़ने दाग।
      1. उदाहरण के लिए, DDH 2 हे के 9 μl साथ DAPI की 1 μl मिश्रण DAPI की एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाने के लिए। फिर, एक 500 μl अंतिम मात्रा के लिए, अवरुद्ध समाधान के 447.5 μl 1.0 μl विरोधी माउस IgG1 लाल + 1.0 μl विरोधी खरगोश आईजीजी ग्रीन + 0.5 1:10 DAPI की μl जोड़ें। भंवर 15,000 XG पर मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के लिए किसी भी वेग गोली करने के लिए।
        नोट: आदर्श रूप में, सभी माध्यमिक एंटीबॉडी ही मेजबान प्रजातियों से होना चाहिए।
    7. स्लाइड युक्ति पिछले पीबीएस धोने बंद डालना। सभी ऊतकों को कवर करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। स्लाइड कवर उन्हें प्रकाश से रक्षा के लिए और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      नोट: सभी माध्यमिक एंटीबॉडी दोहरी लेबलिंग प्रयोगों में अन्य प्रजातियों के साथ कम से कम पार जेट राशि के लिए मान्य किया जाना चाहिए।
    8. 4.1.5 में वर्णित के रूप में स्लाइड्स धो लें। पिछले धोने के बाद, पीबीएस बंद डालना और एक ऊतक पर स्लाइड स्थापित करने के लिए स्लाइड टिप। एक जलीय बढ़ते मीडिया के 3 से 4 बूँदें एक पक्ष के साथ जोड़ें।
    9. सिर्फ बढ़ते मीडिया के बाहरी किनारे करने के लिए एक गिलास coverslip के किनारे सेट करें। संदंश का प्रयोग, धीरे-धीरे ऊतकों की ओर coverslip कम है, तो, coverslip जारी है और धीरे स्थिति में यह नल। अंत में, धीरे इसे स्थिर करने के लिए coverslip के प्रत्येक कोने दबाएँ।
    10. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से स्लाइड को सुरक्षित रखें।
      नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, वीं की बढ़त के साथ नेल पॉलिश की एक पतली परत लागूई coverslip सूखने से स्लाइड को रोकने में मदद करने के लिए।
  2. Histological मूल्यांकन।
    1. छवि उपयुक्त फिल्टर के साथ एक epifluorescent या confocal खुर्दबीन का उपयोग कर स्लाइड eMHC (लाल) का पता लगाने के लिए; ColVI (हरा); और DAPI से सना हुआ नाभिक (नीला), आम तौर पर एक 20x उद्देश्य 1,5 का उपयोग कर।
    2. पुष्टि करें कि प्रयोगात्मक स्लाइड से फ्लोरोसेंट संकेत eMHC और ColVI का पता लगाने 4 की विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए माध्यमिक नियंत्रण स्लाइड से अलग है।
      नोट: eMHC सकारात्मक regenerating फाइबर एक मांसपेशी की चोट के बाद और अस्थायित्व पेशी dystrophy के साथ चूहों में लगभग 2 से 7 दिन से दिखाई जानी चाहिए। कोलेजन छठी मांसपेशी फाइबर, रक्त वाहिकाओं, और नसों आसपास के बाह्य मैट्रिक्स में और पेरी और epimysium के बड़े संयोजी ऊतक बंडलों में मौजूद है। DAPI परमाणु दाग ​​फाइबर उत्थान का संकेत परिधीय नाभिक बनाम केंद्रीय नाभिक के साथ मांसपेशी फाइबर, और मैं की उपस्थिति की पहचान के लिए उपयोगी हैकोशिकाओं nfiltrating। परिगलित या घायल फाइबर अंतर्जात आईजीजी का पता लगाने कि क्षतिग्रस्त मांसपेशियों के फाइबर झिल्ली के माध्यम से प्रवेश करने के कारण माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमजोर दाग सकता है।
    3. उत्थान यों, पूरी छवि भर में एक फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ अतिव्यापी माइक्रोस्कोप तस्वीरें ले लो। प्रत्येक स्थान के लिए eMHC, ColVI और DAPI छवियों मिलाएं और फिर चित्र संरेखित पूरे खंड 1,5 के एक नक्शे को फिर से संगठित करने के लिए।
    4. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, eMHC सकारात्मक फाइबर की संख्या और कुल फाइबर की संख्या में हाल के उत्थान (100 * (# eMHC + फाइबर / # कुल फाइबर)) की गणना करने के लिए गिनती। इसके अलावा, एक लंबी अवधि में पुनर्जनन को मापने के लिए (100 * (# सीएन + फाइबर / # कुल फाइबर)) 1,5 कुल फाइबर के बाहर केन्द्र केन्द्रक फाइबर की संख्या गिनती।

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Representative Results

स्नायु cryosection शाही सेना गुणवत्ता में उच्च है और सबसे अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त उपज प्रदान करता है

सोलह कंकाल की मांसपेशी शाही सेना की तैयारी का विश्लेषण तालिका 1 8 नियंत्रण चूहों से जमा tibialis पूर्वकाल (टीए) पेशी के 19.4 से 41 मिलीग्राम का उपयोग करने में दिखाए जाते हैं। दोनों को छोड़ दिया (एल) और दाएँ (आर) टीए मांसपेशियों एकत्र 3 दिन खारा या 10 माइक्रोन के cardiotoxin के 25 μl के अनुदैर्ध्य इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद तरीकों का उपयोग मांसपेशी की चोट के कारण होने की मांसपेशियों के साथ उत्थान प्रयोगों में तैयार किए गए पहले से 1 की सूचना दी। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, मांसपेशियों cryosection शाही सेना के लिए A260 / 280 के अनुपात में आम तौर पर इन प्रतिनिधि नमूने में 2 के करीब या अधिक कर रहे हैं। के रूप में "शुद्ध" आरएनए A260 / / 2.2 करने के लिए 2.0 और A260 के 280 1.8 के 280 माना जाता है, cryosection शाही सेना के नमूने की पवित्रता उत्कृष्ट 9 है। कुल शाही सेना वसूली आम तौर पर ove थाआर 10 1 ऊतक शुरू, सबसे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराने की मिलीग्राम प्रति कुल शाही सेना के माइक्रोग्राम से अधिक के लिए 0.18 की पैदावार के साथ नमूना प्रति माइक्रोग्राम। विशेष रूप से, आरएनए एकाग्रता, कुल शाही सेना निकाली गई, और प्रादेशिक सेना की मांसपेशियों को 3 दिनों के बाद विष चोट से शुरू ऊतक के मिलीग्राम प्रति शाही सेना उपज खारा इंजेक्शन TAs से की तुलना में काफी अधिक था। यह पता चलता है कि वहाँ homogenization सुधार हुआ है जब मांसपेशियों संरचना व्यापक चोट 3 दिन regenerating मांसपेशियों में जीन प्रतिलेखन और / या आरएनए स्थिरता में वृद्धि हुई है और / या उस से बाधित है। शाही सेना गुणवत्ता के हठ सरल 1x TAE / 1.5% की मांसपेशी cryosection शाही सेना के 1 μl के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन के बाद नमूनों की 18 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। प्रमुख 18S और 28S rRNA बैंड भी सबऑप्टिमल भंडारण की स्थिति (चित्रा 1 ए) के तहत, उच्च शाही सेना गुणवत्ता का प्रदर्शन नमूनों में स्पष्ट भी कर रहे हैं।

स्नायु cryosection आरएनएबहाव के अनुप्रयोगों का समर्थन करता है

प्रति जमा cryosection नमूना शाही सेना के एक माइक्रोग्राम DNase के साथ इलाज किया गया था और oligo डीटी प्राइमरों से लिखित उल्टा। RNase उपचार के बाद, रिवर्स लिखित सीडीएनए की कुल मात्रा 30 μl था। सरल अतिरिक्त प्रवर्धन के साथ गैर मात्रात्मक पीसीआर सीडीएनए की व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए चलाया गया था। Myogenic नियामक कारक 4 (Mrf4), एक प्रतिलेखन कारक पेशी भेदभाव के साथ upregulated, पहले की रिपोर्ट माउस प्राइमरों का उपयोग, भावना 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC और antisense 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10 परिलक्षित किया गया था, मानक पीसीआर का उपयोग टेम्पलेट के 2 μl से। मजबूत, दोनों को छोड़ दिया और सही टीए सीडीएनए नमूनों से 234 बीपी Mrf4 टुकड़ा के विशिष्ट प्रवर्धन था, लेकिन RT- नहीं (आरएनए शामिल है, लेकिन कोई रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस), आर टी DDH 2 हे (कोई आरएनए टेम्पलेट के साथ प्रतिलेखन रिवर्स), या DDH 2 हे पीसीआर नियंत्रण (चित्रा 1 बी)।एक ही नमूने तीन प्रतियों में Mrf4 और mOaz1 संदर्भ नियंत्रण के लिए एक वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम पर रिश्तेदार प्रवर्धन और निष्क्रिय प्रतिदीप्ति संदर्भ का उपयोग 4 मात्रा का ठहराव चलाए जा रहे थे। Mrf4 खारा इंजेक्शन बाईं टीए, ΔΔCt विधि 4 द्वारा गणना की तुलना में विष इंजेक्शन सही प्रादेशिक सेना में 0.097 गुना पर व्यक्त की गई थी। यह परिपक्व मांसपेशी फाइबर 11 के नष्ट होने के कारण कम Mrf4 अभिव्यक्ति 3 दिन विष चोट के बाद की पिछली रिपोर्टों के समान है। मात्रात्मक पीसीआर के लिए cryosection RNAs की निरंतरता की तुलना करने के लिए, सीटी मूल्यों mOaz1 संदर्भ जीन के लिए की तुलना में थे। छह नमूनों से, mOaz1 प्रतिलेख 17.242 ± 1.483 एसडी के एक औसत सीटी के साथ पाया गया, जबकि औसत सीटी था RT- नियंत्रण नमूनों में 36.332 ± 3.61 एसडी (एन = 4)। नमूने भर में mOaz1 सीटी संकेतों के तंग समूह का सुझाव टीए मांसपेशी cryosections से पृथक शाही सेना उम्मीद के रूप में नीचे की ओर आरएनए अभिव्यक्ति में विश्लेषण करता है कि।

3 दिन विष इंजेक्शन के बाद littermate नियंत्रण चूहों से 7 माइक्रोन tibialis पूर्वकाल मांसपेशी वर्गों के अप्रत्यक्ष immunofluorescence धुंधला के उदाहरण regenerating फाइबर (चित्रा 2) का पता लगाने के लिए दिखाए जाते हैं। दोनों वर्गों पेशी क्षेत्र से अधिक से कम 150 माइक्रोन समीपस्थ मांसपेशियों की सतह से 4.6 मिमी के लिए 4.5 की गहराई पर शाही सेना के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से एकत्र किए गए थे। भ्रूण मायोसिन भारी श्रृंखला (eMHC, लाल) regenerating फाइबर, कोलेजन छठी का पता लगाता है (ColVI, हरा) मांसपेशी फाइबर की रूपरेखा, और DAPI दाग नीले नाभिक प्रोटोकॉल के अनुसार, 4. केंद्रित परमाणु घुसपैठ (नीला संकेत) के साथ क्षेत्र विष चोट की जगहों का संकेत , के रूप में eMHC सकारात्मक नव regenerating मांसपेशी कोशिकाओं की सक्रियता से स्पष्ट है। इस उदाहरण की तरह पूरे अनुभाग नक्शे embryoni का अनुपात की गणना के द्वारा उत्थान की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंग मायोसिन भारी श्रृंखला व्यक्त फाइबर (लाल, नव पुनर्जीवित) या केन्द्र केन्द्रक फाइबर पहले से 1 की सूचना दी। विशेष रूप से, वहाँ चित्रा 2A में प्रादेशिक सेना की मांसपेशी में आश्चर्यजनक रूप से कम क्षति है। जबकि वहाँ इंजेक्शन के बीच भिन्नता है, ठेठ विष इंजेक्शन के रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, मांसपेशियों डिब्बे 1 का एक बहुत बड़ा अनुपात प्रभावित करते हैं। इसलिए, इस ऊतकीय विश्लेषण से पता चलता है कि चित्रा 2A में विष चोट कम से कम था और सन्निहित पेशी cryosection आरएनए नमूना से जीन अभिव्यक्ति डेटा की व्याख्या करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है। पूरे पेशी मानक पीस विधियों द्वारा शाही सेना को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तो इस नमूने के अप्रत्याशित रूप से छोटी सी चोट क्षेत्र में यह एक ग़ैर कि बहाव विश्लेषण तिरछा होता होगा। इसके बजाय, एक ही पेशी से ऊतकीय मात्रा का ठहराव बाँधना आसन्न वर्गों से चोट की हद तक के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है। इस inclu का उपयोग सक्षम बनाता हैसायन / अपवर्जन मानदंड सुनिश्चित करने के लिए कि सभी नमूनों नीचे की ओर शाही सेना में शामिल एक न्यूनतम सीमा चोट या आरएनए को सामान्य बनाने सफर का विश्लेषण करती चोट के आकार के अनुसार विश्लेषण करती है।

आकृति 1
चित्रा 1: जमा स्नायु cryosections से शाही सेना की गुणवत्ता के आकलन। ए) 18S और 28S ribosomal शाही सेना के बैंड के 18 महीने आरएनए तैयारी के बाद जमा पेशी cryosections से शाही सेना में प्रमुख हैं। बी) गैर मात्रात्मक Mrf4 के लिए पीसीआर रिवर्स प्रतिलेखन के बाद। 200 और 300 एक डीएनए सीढ़ी के बीपी बैंड संकेत कर रहे हैं। RT-, आरएनए टेम्पलेट लेकिन कोई रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस साथ प्रतिलेखन प्रतिक्रिया रिवर्स। आर टी-एच 2 ओ, DDH 2 हे, कोई आरएनए टेम्पलेट के साथ रिवर्स प्रतिलेखन। एच 2 हे, DDH 2 ओ के साथ कोई टेम्पलेट पीसीआर नियंत्रण इन प्रयोगों में, विष सही tibialis पूर्वकाल (आरटीए) और खारा पानी में इंजेक्ट किया गया थाछोड़ दिया (एलटीए) में इंजेक्शन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मांसपेशियों की पुनर्जनन अध्ययन के लिए ऊतकीय मैप्स नमूना। ए, बी) एकल tibialis पूर्वकाल मांसपेशी वर्गों के संकलित नक्शे 3 दिन गरीब (ए के उदाहरण दिखा विष इंजेक्शन) और सामान्य (बी) के विष से प्रेरित चोट के बाद। प्रत्येक अनुभाग के नक्शे के व्हाइट बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च बढ़ाई देखने, लाल, भ्रूण मायोसिन भारी श्रृंखला के लिए इनसेट छवियों के रूप में दिखाया जाता है; हरे, कोलेजन छठी बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन; नीले, DAPI परमाणु दाग। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: जमा स्नायु cryosections से प्रतिनिधि आरएनए उपज और पवित्रता माप। सोलह tibialis पूर्वकाल (टीए) की मांसपेशियों sectioned थे और जमा cryosection नमूने शाही सेना के लिए प्रोसेस किया गया। शुद्ध शाही सेना (1 μl) एक nanospectrophotometer के साथ विश्लेषण किया गया था। स्तंभ के आँकड़े एक स्प्रेडशीट में प्रदर्शन किया गया, समूह तुलना सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

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Discussion

इस विधि के साथ सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, ऊतक cryopreservation के दौरान कम तीसरे या मांसपेशियों के आधे तक ही सीमित राल embedding रखने के कारण अतिरिक्त राल जमा cryosections के संग्रह धीमी हो जाएगी और आरएनए अलगाव में राल संदूषण embedding वृद्धि हो सकती है। इसके अलावा, सुई homogenization के दौरान सावधान ध्यान उपज को अधिकतम और सुई clogging की संभावना को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल नमूना नुकसान के खिलाफ की रक्षा के लिए अगर सुई अवरुद्ध और रोकना बेदखल करने के लिए उच्च दबाव की आवश्यकता हो जाता है एक Luer-लोक सिरिंज का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है। एक 25 या 26 गेज सुई के साथ एक अतिरिक्त सुई homogenization के कदम भी एक महीन ऊतक निलंबन आगे शाही सेना उपज बढ़ाया करने के लिए उत्पादन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। क्लोरोफॉर्म बीसीपी लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यह अनुशंसित नहीं है के रूप में बीसीपी कम विषैला होता है और आरएनए 12 के जैविक निकासी के दौरान जलीय चरण में जीनोमिक डीएनए संदूषण के निचले स्तर में परिणाम है। बढ़ रहा30 माइक्रोन से अधिक जमा cryosections के लिए खंड मोटाई भी सिफारिश नहीं के रूप में homogenization कम कुशल हो जाएगा।

शाही सेना उपज वांछित स्तर से नीचे है, तो विभिन्न रणनीतियों जैसे वसूली बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है: i) में वृद्धि संभव पैदावार बढ़ाने के लिए सामग्री शुरू की मिलीग्राम मात्रा; ii) ऊतक के यांत्रिक homogenization में सुधार के लिए 30 माइक्रोन से नीचे अनुभाग मोटाई कम; iii) यांत्रिक और रासायनिक ऊतक व्यवधान को बेहतर बनाने के लिए जैविक निष्कर्षण अभिकर्मक में नमूना ऊष्मायन और सुई homogenization की अवधि बढ़ाने; और iv) यदि ऊतक हिस्सा बने हुए हैं, और अधिक कठोर सुई homogenization के साथ एक दूसरे निष्कर्षण कदम प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, वहाँ इस तरह के उच्च proteoglycan सामग्री 13 के साथ नमूने के लिए अतिरिक्त चरण जुदाई और वर्षा कदम के रूप में ऊतक विशेष कारणों से हो सकता है। आरएनए स्तंभ शुद्धि के दौरान, एक बड़ा क्षालन मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है और एक दूसरे क्षालन प्रदर्शन कर सकते हैं माकुल शाही सेना वसूली ximize, लेकिन आरएनए एकाग्रता की कीमत पर। एक के बाद स्तंभ शराब वर्षा आरएनए ध्यान केंद्रित करने की है, तो कम एकाग्रता इस संशोधन के साथ एक चिंता का विषय है इस्तेमाल किया जा सकता है। आरएनए गिरावट एक समस्या है, विच्छेदन के दौरान cryopreservation करने के समय को कम करता है, तो cryostat सतहों और उपकरणों की अधिक कठोर सफाई RNase जोखिम को कम करने के लिए, एक ठंडे कमरे में सुई homogenization कदम है, cryosections से 14 एक RNase अवरोध अभिकर्मक के अलावा, और लगातार प्रदर्शन RNase मुक्त समाधान के प्रतिस्थापन प्रत्येक को रोकने या RNases के लिए जोखिम को कम करने और दरार गतिविधि को कम करने में मदद कर सकता है। ऐसा नहीं है कि संक्षेप में विच्छेदन के बाद एक RNase अवरोध अभिकर्मक में ऊतक स्नान, लेकिन cryopreservation से पहले, आगे नमूना गिरावट कम हो सकता है संभव है। हालांकि, प्रारंभिक प्रयोगों सुनिश्चित करने के लिए कि किसी भी तरह के उपचार cryopreservation के दौरान बर्फ क्रिस्टल या अन्य कलाकृतियों वृद्धि नहीं करता है किया जाना चाहिए।

जबकि भ्रूणमायोसिन भारी श्रृंखला / कोलेजन छठी अप्रत्यक्ष immunofluorescence चोट की पेशी के विश्लेषण के लिए एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रयोग किया जाता है, पतली cryosections माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की इन प्रयोगों के किसी भी प्रासंगिक ऊतकीय दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि जमे हुए वर्गों पर आयोजित किया जा सकता पोस्ट के साथ immunofluorescent तकनीकों सहित, से स्लाइड -fixation और hematoxylin / eosin धुंधला हो जाना। दरअसल, यहाँ प्रदान सरल immunofluorescent प्रोटोकॉल के रूपांतरों आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी एक माउस प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, eMHC) का पता लगाने के लिए भी लक्ष्य ऊतक में अंतर्जात माउस इम्युनोग्लोबुलिन पता लगा सकता है इस्तेमाल किया। इस तरह के अंतर्जात एंटीबॉडी आम तौर पर पृष्ठभूमि immunofluorescent धुंधला के कारण घायल या dystrophic मांसपेशियों में क्षतिग्रस्त या परिगलित मांसपेशी फाइबर में जमा है। एक माध्यमिक नियंत्रण स्लाइड (लोप प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ) हमेशा धुंधला की विशिष्टता का आकलन करने के लिए जांच की जानी चाहिए। यदि अंतर्जात एंटीबॉडी पृष्ठभूमि समस्याग्रस्त है, पूर्व ब्लॉक कदम होना चाहिएरोकने के लिए या अंतर्जात माउस इम्युनोग्लोबुलिन 15 का पता लगाने के लिए कम से कम करने के लिए प्रोटोकॉल के लिए कहा।

विधि का मुख्य सीमाओं कि यह एक cryostat की आवश्यकता है और यह समय लगता है, जो यह अपेक्षाकृत कम throughput बनाता है। उदाहरण के लिए, तकनीक में एक विशेषज्ञ के लगभग 9 से 10 घंटे में जमा cryosections और खुर्दबीन स्लाइड के लिए 16 मांसपेशियों (सभी 16 ऊतकों की डुप्लीकेट वर्गों के साथ 8 स्लाइड) तक की प्रक्रिया में सक्षम था। novices cryosectioning करने के लिए, 2 से 4 नमूनों से जमा cryosections के संग्रह यथोचित cryostat प्रशिक्षण और एक या दो अभ्यास सत्र के बाद महारत हासिल किया जा सकता है, इसके बजाय, ऊतक विज्ञान के लिए प्राप्त करने के गुणवत्ता cryosections अधिक अनुभव लिया। इसलिए, उपकरण, समय, या प्रशिक्षण कारकों नरम ऊतकों है कि अच्छी तरह से एक मैनुअल मूसल homogenizer के साथ homogenized हो सकता है के लिए इस विधि कम उपयोगी बना सकते हैं।

गैर cryostat homogenization के तरीकों के साथ तुलना में, धारीदार मांसपेशी आरएनए तैयारीएस पेशी 16 वर्ष की 0.7 माइक्रोग्राम आरएनए पूर्व मिलीग्राम और हाल 0.27 1.08 माइक्रोग्राम को पेशी 17 मिलीग्राम प्रति आरएनए के लिए 0.05 की शाही सेना पैदावार के साथ पेशी बायोप्सी से सूचित किया गया है। इसलिए, तकनीक यहाँ वर्णित के रूप में अच्छा या बनती ऊतकीय सक्षम करने के लिए एक ही नमूने के एक सन्निहित क्षेत्र से विश्लेषण का जोड़ा लाभ के साथ गैर cryostat तरीकों की तुलना में बेहतर पैदावार आरएनए प्रदान करता है। उल्लेखनीय है कि पिछले एक अध्ययन में यह भी कशेरुकी ऊतकों में homogenization के लिए cryosectioning इस्तेमाल किया और इसी पाया cryosectioning ऊतक शाही सेना अलगाव 13 के लिए बढ़ाया कि homogenization दक्षता। जब इस तकनीक गोजातीय कंकाल की मांसपेशी के नमूनों में परीक्षण किया गया था, नमूना तैयार करने के प्रति औसत शाही सेना उपज सामान्य श्रेणी के यहां 13 सूचना के अंत में कम 4.09 ± 0.36 माइक्रोग्राम था। लेजर कब्जा microdissection एक cryosection से शाही सेना निकासी के लिए ऊतक के संग्रह के लिए एक और विकल्प है। लेजर कब्जा जमा में इस cryosection विधि से बेहतर हैकि यह अनुमति देता है विशिष्टता अनुभाग से कोशिकाओं का केवल एक वांछित सबसेट एकत्र करने के लिए और यह 50 माइक्रोन मोटी 18 तक एक भी ऊतक अनुभाग पर किया जा सकता है। कठिन और उपयुक्त हालांकि, एक माइक्रो विच्छेदित नमूने का संग्रह हो सकता उपकरण शोधकर्ताओं के लिए जमा cryosection homogenization अधिक सुलभ बनाने के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है। जब दोनों तरीके उपलब्ध हैं, एक प्राथमिकता एक आवेदन केवल छोटे आरएनए मात्रा की आवश्यकता होगी, लेजर कब्जा microdissection पक्ष में होगा, जबकि जमा cryosection homogenization सबसे अच्छा है जब उप क्षेत्र विश्लेषण कम महत्वपूर्ण है और शाही सेना की उच्च मात्रा की जरूरत है के लिए एक ऊतक उप क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए।

जबकि ऊतकीय और आरएनए अलगाव तरीके यहाँ ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, जमा cryosection विधि आसानी से पश्चिमी धब्बा के लिए विश्लेषण करती है या एंजाइम गतिविधि माप प्रोटीन lysates तैयार करने के लिए अनुकूलित है। उदाहरण के लिए, दिल से जमा cryosections पश्चिमी धब्बा के लिए solubilized थे विश्लेषण 4 एकएन डी टी ए से जमा cryosections mitochondrial समारोह 5 succinate डिहाइड्रोजनेज गतिविधि assays के लिए homogenized थे। वैकल्पिक रूप से, जीनोमिक डीएनए और प्रोटीन भिन्न शाही सेना के अलगाव के बाद जैविक निकासी के दौरान अन्य चरणों से अलग किया जा सकता है, संभावित एक भी cryostat सत्र के बाद एक भी ऊतक से जीनोमिक डीएनए, प्रोटीन, आरएनए और ऊतकीय माप प्राप्त करने के लिए की पेशकश की।

कुल मिलाकर, इस विधि का मुख्य लाभ कई विश्लेषणात्मक एक भी ऊतकों से अलग नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है दृष्टिकोण को सक्षम करने से प्रयोगात्मक लचीलापन बढ़ाने के लिए है। विधि मांसपेशियों और व्यापक अंतर या बाह्य संरचना है कि मूसल आधारित ऊतक homogenization की क्षमता कम कर देता के साथ अन्य ऊतकों के लिए सबसे उपयुक्त है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cork VWR Scientific 23420-708 Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip Fisher Scientific 12-547 Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer VWR Scientific 89370-158
2-methylbutane Sigma M32631-4L Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix" Thermo Fisher Scientific 6769006 Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat Thermo Fisher Scientific microm HM550 with disposable blade carrier Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade Thermo Fisher Scientific 3052835 Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap" Thermo Fisher Scientific AM9780
Analytical balance Mettler Toledo XS64
Paint brush Daler Rowney 214900920 Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade VWR Scientific 55411-050
Microscope slide VWR Scientific 48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol Thermo Fisher Scientific 15596026 Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle VWR Scientific BD305185
22 gauge needle VWR Scientific BD305155
26 gauge needle VWR Scientific BD305115 Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe VWR Scientific BD309659 For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP) Sigma B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol Decon Laboratories, Inc. +M18027161M Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. 
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water Thermo Fisher Scientific AM9922 Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit Thermo Fisher Scientific 12183018A Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water  Gibco 10977 DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Dnase I Thermo Fisher Scientific AM2222 Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen Thermo Fisher Scientific 8899
Dulbecco's PBS Gibco 14190 PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc 017-000-121 Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank F1.652
Collagen VI antibody Fitzgerald Industries #70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 Thermo Fisher Scientific A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 Thermo Fisher Scientific A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher Scientific D1306
Aqueous mounting media: Permafluor Thermo Fisher Scientific TA-030-FM Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip VWR Scientific 16004-314 Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress Media Cybernetics, Inc. Image-Pro Express, or more advanced products Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop Adobe Photoshop
Cardiotoxin Sigma C9659 Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18080051 Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system Promega M8298 Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green Thermo Fisher Scientific S7585 For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM BioResearch Technologies, Inc. Novato CA SR-1000-10 SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR Applied Biosystems 7900HT

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 118 स्नायु tibialis पूर्वकाल cryosection शाही सेना निकासी ऊतक विज्ञान immunofluorescence जीन अभिव्यक्ति
जीन एक्सप्रेशन और histological विश्लेषण के लिए एक एकल माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्र के Cryosectioning
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Beedle, A. M. Cryosectioning of… More

Beedle, A. M. Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses. J. Vis. Exp. (118), e55058, doi:10.3791/55058 (2016).

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