Cryosectioning angränsande regionerna i samma mus skelettmuskulatur för genuttryck och histologiska analyser

Summary

Konsekutiva Cryo-sektioner samlas in för att göra det möjligt för histologiska applikationer och anrikning av RNA för genuttryck mätningar med angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Hög kvalitet RNA erhålls från 20 - 30 mg poolade kryosnitt och mätningar direkt jämföras mellan program.

Abstract

Med den här metoden är konsekutiva kryosnitt samlas in för att göra det möjligt för både mikroskopi applikationer för vävnads histologi och anrikning av RNA för genuttryck med hjälp av angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Normalt är det en utmaning att uppnå adekvat homogenisering av små skelettmuskelprover eftersom buffertvolymer kan vara för låg för effektiva sliptillämpningar, men utan tillräcklig mekanisk störning, den täta vävnad arkitektur muskel gränser penetration av buffertreagens, slutligen orsakar låg RNA avkastning. Genom att följa det protokoll som rapporteras här, är 30 | j, m sektioner uppsamlades och slogs samman vilket gör cryosectioning och efterföljande nål homogenisering för att mekaniskt störa muskeln, vilket ökar den yta som utsätts för buffert penetration. De primära begränsningarna i tekniken är att den kräver en kryostat, och det är relativt låg genomströmning. Däremot kan hög kvalitet RNA erhållas från små prover av poolade muscle kryosnitt, vilket gör denna metod tillgänglig för många olika skelettmuskler och andra vävnader. Dessutom möjliggör denna teknik matchade analyser (t.ex. vävnad histopatologi och genuttryck) från intilliggande regioner i en enda skelettmuskel så att mätningar kan direkt jämföras mellan program för att minska experimentell osäkerhet och att minska replikations djurförsök nödvändigt att köpa en liten vävnad för flera applikationer.

Introduction

Målet med denna teknik är att göra flera experimentella analyser av olika metoder, såsom histologi och genuttryck, tillgänglig från en enda liten skelettmuskulatur källvävnaden. Mikroskopi applikationer är mest känsliga för prov konserveringsmetoder, som måste kontrolleras noggrant för att begränsa bildandet av iskristall artefakter under frysförvaring. Således är metodutveckling baserad på tibialis anterior (TA) muskel frysta delvis täckt med inbäddning harts i en -140 ° C flytande kväve kyld 2-metylbutan bad som källmaterial för både immunofluorescensmikroskopi och genuttryck analyser.

Behovet av att använda samma källmaterial för olika tekniska tillvägagångssätt är särskilt viktigt för injektionsbaserade intramuskulära experiment där vänster och höger muskler representerar olika villkor, en experimentell och en kontroll. Till exempel i muskelregenereringsstudier, en muscle injiceras med ett toxin för att orsaka omfattande vävnadsskada, medan det kontralaterala muskeln fungerar som en fordons injicerad kontroll ^1. På samma sätt, genterapistudier för muskelsjukdomar börjar vanligtvis med validering av genterapivektor genom intramuskulär injektion att jämföras med tom vektor, orelaterade vektor eller vehikelkontroll på den kontralaterala sidan ^2. Därför är det inte möjligt att köpa varje TA muskler till ett annat program.

Gemensamma strategier för att ta itu med denna fråga är: i) att använda en annan muskelgrupp för varje applikation, ii) att använda ytterligare möss, eller iii) att skära av en bit av muskeln för varje applikation. Men betydande skillnader mellan muskelgrupper gör det svårt att jämföra data från olika applikationer, och ytterligare djur ökar kostnader och är dåligt motiverade om andra alternativ finns. Dela muskeln efter dissektion att köpa olika applikationer är det bästa alternativet in många fall. Men muskel bitar är ofta för små för att använda pulvrisering under flytande kväve eller mekaniska sliptekniker för homogenisering ^2-5. Muskel är en mycket strukturell vävnad packad med extracellulära matrix och sammandragande proteiner leder otillräcklig mekanisk homogenisering till ett lågt utbyte av efterföljande DNA, RNA eller protein. Metoden beskrivs här gör att små mängder av vävnad från en källa muskel för användning i flera tillämpningar, och införandet av cryosectioning och nål triturering förbättrar mekanisk homogenisering för bättre RNA avkastning.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of Georgia Institutional Animal Care och användning kommittén enligt djuranvändning protokoll A2013 07-016 (Beedle).

1. Frysförvaring av Ofixerad skelettmuskulatur

1. Förberedelse
   1. Skär kork i små fyrkanter (ca 1 cm x 1 cm) med ett rakblad, skriva på korken med en fin spets markör som är resistent mot 2-metylbutan att identifiera källan musen och muskler, och gör en mycket grunt snitt (ungefär 1 mm) över den övre ytan. Sätt en plasttäck i snittet som ska användas för att orientera vävnaden. Upprepa tills en kork är redo för varje vävnad som skall kryokonserveras.
   2. Skaffa flytande kväve, 2-metylbutan, bädda harts, låg temperatur termometer, korkar, dissektion verktyg och studie mus.
      VARNING: Flytande kväve är en komprimerad gas som kan explodera vid upphettning. Bära en labbrock, låg temperatur handskar och ansiktsskydd vid hantering av flytande nitrogen; kontakt med hud och ögon kan orsaka brännskador eller köldskador. 2-metylbutan är en brandfarlig, giftig, hälso- och miljöfarliga. Bär personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar, skyddsglasögon), öppna lagerbehållare i ett dragskåp, överföra den lilla mängd som behövs för frysning (typiskt 200 till 400 ml) till en separat behållare som kan väl tillsluten, och undvika inandning .
   3. Euthanize möss med en godkänd metod för dödshjälp under narkos. I korthet, sätter musen i en inandningskammare med 2,5% isofluran i syre från en isofluran förångare, vänta tills 20 sekunder efter musen är stilla för att kontrollera om en pedal reflex. När pedalen reflex är negativ, avliva studien musen genom halsdislokation ^6.
      OBS: Eutanasi metoder kräver godkännande av institutionella etiska kommittén.
   4. Ta bort hud som ligger över den distala bakbenen och skär de distala främre senor alldeles ovanför vristen med fin-punkts dissection sax. Ta tag i distala senor med fin pincett och dra försiktigt uppåt och mot knät samtidigt minska lateral fascia att släppa muskeln. Dra muskeln ut vinkelrätt från knäet och göra en final cut att skära TA muskeln ^7.
      OBS: TA muskeln används här som ett exempel, men vilken som helst musen skelettmuskel eller hjärtat kan användas i stället för TA i detta protokoll om så är lämpligt till användarens experimentella mål. Den enda begränsningen är att en vävnad måste vara tillräckligt liten för att uppnå snabb frysförvaring genom dess djup; en maximal vävnads storlek på 1 cm x 1 cm rekommenderas.
   5. Upprepa på motsatta benet, och dissekera ut några andra vävnader som skall samlas in. Utför dissekering så snabbt som möjligt för att begränsa vävnadsnedbrytning före frysförvaring.
   6. Orient varje muskel för tvärsnitt på sin pre-märkt kork. Stå muskeln vinkelrät mot korken med den distala senan röra korken och toppen av muskeln extslutar bort, hålls upprätt av täck.
   7. Cryopreserve alla vävnader för histologisk analys så snart som möjligt efter dissektion, företrädesvis inom 5 minuter, men definitivt inte mer än 15 min tid som förflutit sedan eutanasi av källdjuret.
2. Frysförvaring
   1. Börjar kylning av frysförvaring badet fem minuter före slutet av dissekering. Pour 2-metylbutan i en öppen metallbägare till ett djup av ca 3 cm. Hälla flytande kväve i en isolerad behållare till ett djup av 2 till 4 cm. Ställ bägaren av 2-metylbutan i vätske kväve; kvävet kommer att börja koka. Undvik kväve stänk i 2-metylbutan bägare.
      VARNING: Förbered frysning bad i ett dragskåp eller en väl ventilerad plats.
   2. Sätt en låg temperatur termometer i 2-metylbutan att kontrollera temperaturen och rör ofta med en gaffel för att säkerställa jämn kylning. Fortsätt att röra och svalna tills 2-methylbutane når -140 ° C, lägga till nya flytande kväve till den yttre bad vid behov.
      OBS: -140 ° C är den optimala temperaturen för att minimera iskristall artefakter i tvärstrimmig muskulatur; andra vävnader kan cryopreserve bäst vid olika temperaturer (t.ex., hjärna, -90 ° C).
   3. Tillämpas inbäddning harts endast till den undre 35-50% av muskeln där den möter korken och omedelbart släppa korken in i 2-metylbutan vid -140 ° C. Snabbt upprepa för upp till 8 vävnader per frys parti. Rör om under 30 sek, skrapning av botten av bägaren för att garantera att vävnader inte fryser in den stelnande 2-metylbutan.
   4. Använd en gaffel, hålslev eller stora pincett för att dra varje vävnad kork från 2-metylbutan. Snabbt ta bort täck, badda bort överflödigt 2-metylbutan i bägaren, och sedan släppa vävnaden korken i den yttre kvävebadet. Upprepa för alla återstående korkar i bägaren.
   5. Överför proverna i flytande kväve eller på torris tillen -80 ° C frys för förvaring.
   6. Om några vävnader kvar under frysförvaring, upprepa steg 1.2.3 till 1.2.4. Lägg till ytterligare två-metylbutan till bägaren eller flytande kväve till den yttre bad vid behov och åter kyla till -140 ° C. Avyttra används två-metylbutan som farligt avfall.

2. Samla Kryosnitt för histologi och RNA Applications

1. Förberedelse.
   1. Pre-väga DNas / RNas-fri autoklaveras röret på en analytisk våg. Därefter flyttar den i kryostat kammaren för att förkyla. Upprepa tills rören är redo för alla poolade kryosektion prover som skall samlas in.
   2. För skelettmuskulaturen sektionering, bekräftar att kryostat kammartemperaturen är -21 till -22 ° C genom sin interna termostat. Överföra några behållare med vävnader som skall skäras in i kammaren och tillåta behållaren (s) till jämvikt till kryostat temperatur i minst 15 minuter innan den öppnas.
   3. Sätt i ett nytt engångs kryostat blad. Alternativt, ta bort den befintliga kniven, spraya med RNas sanering lösning, skölj med DDH ₂ O, och sätt in kryostaten svalna. Spraya en ren vävnad med 70% etanol och torka noga bladet och bladkläm plattform.
      1. Spraya en ren vävnad med en RNas sanering lösning och torka kryostat penslar. Spraya en vävnad med DDH ₂ O, torka borstarna igen och ställa dem i kryostat kammare på en ren yta.
         VARNING: kryostat bladet bör omfattas av knivskyddet när de inte används. Dessutom är RNas dekontamineringslösning toxiska och kommer att frysa att bilda en fällning i den kalla kryostaten kammaren. Därför hanteras varsamt och undvika dess användning i kryostaten kammaren.
   4. Inom kryostat kammaren, placera en dime -stora droppe (ca 300 l) för att bädda harts på en varm prov chuck, som en vävnad kork ovanpå hartset, tryck ner, och sedan ställa in chucken i FReezing järnväg eller på en snabb frysning inslag om det finns.
   5. Efter inbäddning harts stelnar (vita), lägga till ytterligare inbäddning harts ovanpå korken, runt nedre 35% av vävnaden och tryck kylelementet i inbäddning harts för en snabb frysning för att bättre stabilisera vävnaden. Vänta fem minuter innan snittning för att tillåta hartset att härda helt.
   6. Säkerställa att preparatklämman befinner sig i sitt mest tillbakadragna läge, längst bort från bladet. Sätt vävnadsprovet chucken i preparatklämman.
2. Kryosektion förberedelse.
   1. Lossa på knivbäraren hållaren, ställ in släppningsvinkeln för bladet till 10 ° (eller en vinkel lämplig för bladbäraren används), och dra åt. Släpp bromsen och vrid handhjulet för att sänka muskeln mot bladet. Uppskatta det kortaste avståndet mellan vävnaden och strå och sedan flytta vävnad bort från bladet och engagera handhjulet bromsen.
   2. Lossa höjdjusterings lever och flytta bladhållaren framåt eller bakåt, respektive, om slutet av vävnaden är mer än ca 2 mm från bladet eller om klingan slår vävnaden. Dra och sänka vävnaden igen för att kontrollera avstånd från bladet. Upprepa justeringar tills bladet är en till två mm från änden av vävnaden genom visuell uppskattning.
   3. Sänk vävnaden mot bladet och bedöma vävnads vinkel för tvärsektioner. Dra åt handhjulet och släpp preparatklämspaken. Skjut preparatklämman vänster eller höger tills den horisontella orienteringen av vävnaden är vinkelrät mot bladet.
   4. Tryck av preparatet Fäst uppåt eller nedåt för att justera "y" orientering, så att vävnadssnitt kommer att vara vinkelrät mot den långa axeln av muskeln. Dra preparatklämspaken.
   5. Använd kurs och fina frammatning för att föra provet tills det bara rör bladet. Om söker delar från en speciell vävnad djup, återställa summan av sektionstjocklekar till noll (toppen av vävnad).
   6. Ställ in kryostat till trimfunktion med snittjocklek på 30 um. Klipp ut och kassera delar tills den förvalda djupet för vävnadsuppsamlings uppnåtts (t.ex. 400 pm från toppen).
3. Samla kryosnitt för RNA-extraktion.
   1. Öppna röret för att samla sektioner och placera den nära bladbäraren. Använd en förkyld, ren pensel för att plocka upp varje avsnitt som det skärs från bladet och överföra kryosektion i röret. Upprepa tills de sammanslagna delarna väger 30 mg eller den önskade vävnaden djup uppnåtts.
      OBS: För en vuxen mus tibialis anterior, samling från vävnad djup av cirka 400 till 4000 pm ger typiskt 25 - 40 mg. Använda metall pincett för att överföra delar till uppsamlingsröret rekommenderas inte eftersom sektionerna tenderar att fastna och klumpa på metallytan.
   2. Om bädda harts omger muskeln kryosektion, låsa handbromsen och använda ett rakblad tillraka av små bitar av harts till dess att det finns endast ett tunt skikt runt toppen av muskeln. Alltid klippa harts med bladet vinklad bort från muskeln.
      OBS: Ett tunt lager av bädda harts inte väsentligt försämrar nedströms RNA-preparation. Om tjockare bädda harts är närvarande, använder borstar för att retas bort från muskeln innan du flyttar kryosektion i provröret.
   3. Alternativt, pool avsnitt om bladhållaren och överföring i bulk till uppsamlingsröret.
      OBS: Dock tenderar denna metod att vara långsammare, och avsnitten är mer benägna att hålla och klumpa ihop sig, vilket kan minska effektiviteten av nål homogenisering i senare steg.
   4. Snabbt placera den poolade kryosektion röret i en analytisk balans och spela röret vikt. Omedelbart åter röret till den kalla kryostat kammaren att hålla avsnitt temperatur nära -20 ° C. Beräkna vikten av de poolade sektioner.
      OBS: Om RNA-isolering kommer att ske på annonsifferent dag, lagra den poolade kryosektion röret vid -80 ° C fram till användning.
4. Samla kryosnitt för histologi.
   1. Tryck på snittjocklek knappen för fina sektione och använda pilarna för att ställa in kryostat snittjocklek till 7 pm (eller annan lämplig snittjocklek, typiskt 6-10 um).
      NOT: Förtunning sektioner (6 till 10 | j, m) bör användas för histologiska tillämpningar för att säkerställa att färgreagenser kan penetrera djupet av vävnadssnittet. Tunna sektioner kan tas från alla djup under cryosectioning, men djupare sektioner är att föredra, eftersom inbäddning harts, som ökar med djup i vävnaden, inte försämrar histologisk färgning.
   2. Klipp ut och kasta 4 till 7 sektioner för att erhålla ett konsekvent, även vävnadsytan. Anteckna vävnadsdjupet.
   3. Skär ett snitt och orientera det på ytan av bladhållaren. Plocka upp avsnittet genom att snabbt och försiktigt röra en varm (rumstemperatur) objektglastill avsnittet på bladbäraren. Återgå bilden till rumstemperatur. Fortsätt tills önskat antal objektglas erhålles. Anteckna den slutliga vävnadsdjupet.
      OBS: Samla en sekund (duplikat) avdelning för varje vävnad rekommenderas.
   4. Med sektionering klar engagera handhjulsbromsen, återsända exemplaret till den bakre positionen och ta bort vävnaden chucken. Använd kryostat värmeelementet att smälta bädda harts håller vävnaden kork på prov chucken. Ta bort vävnad kork, torka med vävnad, och återvända till lagring.
   5. Upprepa från steg 2.1.2 för varje återstående vävnad. Låt objektglasen torka i 20 min efter den sista vävnaden är monterad. Använd sedan diabilder för histologisk eller immunofluorescerande färgning eller frysa vid -80 ° C i en glidlåda tills det behövs.

3. RNA Isolering från sammanslagna Kryosnitt

1. RNA-extraktion
   1. Flytta röret (er) av poolade kryosnitt till is. Omedelbart lägga till enorganiska RNA-extraktion reagenset vid ett förhållande av ca 1 ml reagens per 50 mg kryosektion vikt, typiskt 600 ^ il per rör.
      VARNING: RNA isoleringsreagens är giftiga, frätande och irriterande. Följ tillverkarens instruktioner för säker hantering.
   2. Med användning av en 1 ml spruta med en 18 gauge nål, rita RNA extraktionsvätskan upp och skölj väggarna i röret tills all vävnad suspenderas i lösningen. Försök att minimera luftbubblor under nålen homogenisering.
   3. Använd spetsen på nålen att mosa och skingra alla hopklumpade kryosnitt och bitar som ansluter sig till rörväggen. Finfördela att homogenisera genom att leda provet upp och ned genom nålen för fem slag, och sedan tillbaka provet till is. Upprepa båda stegen tre till fem gånger, eller så många gånger som är nödvändigt för att störa alla klumpar och sålla provet lätt genom nålen.
   4. Ta bort 18 gauge nål och ersätta den med en 22 gauge nål. noggrant triturate provet för fem slag, och sedan tillbaka provet till is. Upprepa triturering tre till fyra gånger för att uppnå en mycket findispergerad vävnadshomogenat.
      OBS: Om vävnadspartiklar börjar blockera nålen vid utarbetandet av provet, utvisa alla prov från sprutan och växla tillbaka till 18 gauge nål för ytterligare homogenisering. Ett ytterligare triturering steg med en 25 eller 26 gauge nål kan tillsättas för att erhålla maximal avkastning. Emellertid kan nålen bli igensatta så det finns en risk för prov spill.
   5. Flytta provet från isen till rumstemperatur. Inkubera i 5 min för att störa molekylkomplex.
   6. I ett dragskåp, tillsätt 0,1 ml av 1-brom-3-klorpentan (BCP) per 1 ml av RNA-isolering reagens som används (steg 3.1.1), typiskt 60 pl per rör. Skaka röret kraftigt för hand under 15 sek (inte vortex). Inkubera provet vid rumstemperatur under 2 till 3 min. Då, centrifugera i 15 min vid 12000 xg och 4 ° C.
      FÖRSIKTIGHET:
   7. Samla den övre vattenfasen (färglös) innehållande RNA och överför den till ett rent rör. Tillsätt en lika volym av 70% etanol (i DEPC vatten) och skaka för att blanda. Inkubera vid rumstemperatur under upp till 10 min.
      OBS: mellaninter och lägre fenol BCP faser kan behandlas för genomisk DNA och protein, respektive, enligt tillverkarens anvisningar eller samlas i en fenol-BCP farligt avfall behållare för lämpligt bortskaffande.
2. RNA-rening.
   1. Följ tillverkarens anvisningar för prov bindning, tvättning och eluering med smärre variationer ^8. Till exempel:
   2. Placera en alikvot av DNas / RNas-fritt vatten i en 37 ° C bad eller inkubator i förväg varm för steg 3.2.4.
   3. Lägga RNA-provet från 3.1.8 ovan till en reningskolonn och centrifugera provet under 15 sekvid 12.000 xg vid rumstemperatur. Pour flödet genom tillbaka in i samma kolumn och re-centrifug. Upprepa en ytterligare tid för att maximera RNA-bindande, och sedan kasta den slutliga flödet genom.
   4. Utför tvättsteg enligt tillverkarens anvisningar ^8. Applicera 700 pl av tvättbuffert (ingen etanol) till kolonnen, spin för 15 sek vid 12000 xg, och kassera flödet genom.
   5. Tillsätt 500 pl av tvättbuffert (med etanol) och kolonnen, spin för 15 sek vid 12000 xg, och kassera flödet genom. Upprepa detta steg en gång.
   6. Snurra den tomma kolumnen för en min vid 12000 xg att torka membranet.
   7. Överföra spinnkolonn till en ren RNase-, DNas-fritt rör. Tillsätt 40 pl förvärmda DNas / RNas-fritt vatten (från 3.2.1) till mitten av kolonnen membranet. Vid rumstemperatur, inkubera under 2 min och centrifugera sedan i 2 min vid 12000 x g.
      OBS: 40 l elueringsvolymen är ca 1,3 l per mg originalvävnad för 30 mg poolade kryosnitt. Justera elueringsvolymen som är lämpligt för olika startvävnads vikter, men inte minskar under 32 pl. En andra eluering, med användning av cirka 0,7 | j, l per mg ursprunglig vävnad, kan tillsättas för att öka den totala RNA-utbytet.
   8. Analysera RNA (kolumn eluering) för koncentration och renhet genom en spektrofotometer, elektrofores, och / eller en Bioanalyzer. Förvara RNA vid -80 ° C tills det behövs för tillämpningar efter, till exempel omvänd transkription för kvantitativ PCR ^4.
      OBS: En DNas behandling rekommenderas innan du använder RNA i tillämpningar nedströms. Denna behandling kan utföras på vissa RNA-reningskolonner före tvättsteget, i denna specifika punkt efter kolonn eluering, eller på en alikvot av RNA som ett första steg i någon nedströms tillämpning. RNA bör vara stabil under flera år.

4. Histologisk Analys genom Immunofluorescerande Staining Muscle Kryosnitt

1. Enkel immunofluorescens-protokollet.
   1. Använd en hydrofob penna för att ringa gruppen av avsnitten om varje bild. Försiktigt släppa PBS i det inringade området (cirka 80 l för en liten yta på upp till 500 l för en stor yta), var noga med att inte röra vävnaderna. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
      OBS: Om du använder frysta bilder, ta bort bilder från -80 ° C frys och inkubera vid rumstemperatur i 20 till 30 minuter för att tina och torka och fortsätt sedan som ovan. Minst två bilder behövs: en experimentell bild till inkuberas i primär och sekundär antikropp; och en styrglid som primär antikropp är utesluten, den "sekundära bara" kontroll.
   2. Tips bilden för att hälla bort PBS. Tillsätt 5% åsna serum i PBS (blockeringslösning) till det inringade området; vara noga med att se till att muskelsektionerna inte torkar ut. Inkubera vid rumstemperatur under 30 min (eller upp till flera timmar i en fuktighetskammare).
   3. Förbered primära antikroppen lösning för att analysera muskler förnyelse. Blanda blockerande lösningen, med en eMHC antikropp (1:40) och en ColVI antikropp (1: 1000). Förbered cirka 150 l, 300 l eller 500 ^ för små, medelstora eller stora glidområden, respektive. Vortex under 5 sekunder, och centrifugera sedan i två minuter vid 15.000 xg för att pelletera eventuell fällning.
   4. För experimentella diabilder, tippa bilden för att hälla bort blockerande lösningen och sedan lägga till primär antikroppslösning från 4.1.3. För det sekundära reglaget, tippa bilden för att hälla bort blockerande lösningen och sedan tillsätta färsk blockeringslösning (ingen antikropp). Inkubera objektglasen i en fuktkammare vid 4 ° C över natten.
      ANMÄRKNING: När pipettering antikroppslösningar på objektglas, alltid dra vätska från toppen av den primära antikroppen lösning röret, inte störa eventuell fällning på botten av röret.
   5. Tips glider att hälla ut lösningen. Lägg PBS droppvis till det inringade området av varje bild för att tvätta, att spetsen hällaoff, sedan lägga till mer PBS och inkubera under tre till fem minuter. Upprepa för totalt tre tvättar.
      OBS: Disktiden är ganska flexibel och kan förlängas upp till 20 minuter om så önskas. I allmänhet är viktigare än tiden det antal ändringar lösning.
   6. Förbered sekundär antikropp lösning för alla bilder (inklusive andra kontroll slide) med en 1: 500 utspädning av röda och gröna fluoroforen kopplade sekundära antikroppar för att detektera mus lgG1 (eMHC) och kanin-IgG (ColVI) och 1: 10000 utspädning av DAPI nukleära fläck.
      1. Till exempel mixa 1 il DAPI med 9 pl av DDH ₂ O för att göra en 1:10 utspädning av DAPI. Då, för en 500 | j, l slutlig volym, tillsätt 1,0 | il anti-mus-IgG1-röd + 1,0 | il anti-kanin IgG-grön + 0,5 pl av 01:10 DAPI till 447,5 | il blockeringslösning. Vortex för att blanda och centrifugera under två minuter vid 15.000 xg för att pelletera eventuell fällning.
         OBS: Helst ska alla sekundära antikroppar vara från samma värdarten.
   7. Tips bilderna att hälla ut den sista PBS tvätt. Lägg sekundär antikropp lösning för att täcka alla vävnader. Täck objektglasen för att skydda dem från ljus och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
      OBS: Alla sekundära antikroppar bör valideras för att ha minimal korsreaktivitet med andra arter i dubbla märkningsexperiment.
   8. Tvätta bilderna som beskrivs i 4.1.5. Efter den sista tvättningen, tippa bilden för att hälla bort PBS och ställa bilden på en vävnad. Tillsätt 3 till 4 droppar av en vatten montering media längs ena sidan.
   9. Ställa kanten av ett täckglas precis till den yttre kanten av monteringsmedia. Använd pincett, sakta sänka täck mot vävnaderna, då släpper täck och försiktigt knacka den på plats. Slutligen, tryck försiktigt varje hörn av täck att stabilisera den.
   10. Skydda bilderna från ljus och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
       OBS: För långtidsförvaring, applicera ett tunt lager av nagellack längs kanten av the täck för att förhindra glid torkar.
2. Histologisk utvärdering.
   1. Bild bilderna med hjälp av en epifluorescent eller konfokalmikroskop med lämpliga filter för att upptäcka eMHC (röd); ColVI (grön); och DAPI-färgade kärnor (blå), typiskt med hjälp av en 20X mål ^1,5.
   2. Kontrollera att den fluorescerande signalen från experimentella diabilder skiljer sig från den andra kontroll bilden för att demonstrera specificiteten hos eMHC och ColVI upptäckt ^fyra.
      OBS: eMHC positiva regenereringsfibrer ska vara synlig från cirka 2 till 7 dagar efter en muskelskada och variabelt i möss med muskeldystrofi. Kollagen VI är närvarande i den extracellulära matrisen som omger muskelfibrer, blodkärl och nerver och i de större bindvävs buntar av peri- och epimysium. DAPI nukleära fläcken är användbara för att identifiera muskelfibrer med central kärnor kontra perifera kärnor som anger fiberregenere, och närvaron av infiltrating celler. Nekrotiska eller skadade fibrer kan färgas svagt med mus IgG sekundär antikropp på grund av detektering av endogen IgG som penetrerar fibrerna genom skadade muskelmembran.
   3. För att kvantifiera förnyelse, ta lappande mikroskop bilder med varje fluorescerande filter över hela bilden. Slå samman eMHC, ColVI och DAPI bilder för varje plats och sedan rikta in bilderna för att rekonstruera en karta över hela sträckan ^1,5.
   4. Med hjälp av analysmjukvara, räkna antalet eMHC positiva fibrer och det totala antalet fibrer för att beräkna senaste regenerering (100 * (# eMHC + fibrer / totalt # fibrer)). Dessutom, räkna antalet centralt kärn fibrer av det totala antalet fibrer för att mäta regenerering över en längre period (100 * (# CN + fibrer / # Totalt fibrer)) ^1,5.

Representative Results

Muscle kryosektion RNA är hög kvalitet och ger tillräcklig avkastning för de flesta applikationer

Analyser av sexton skelettmuskel RNA-beredningar visas i tabell 1 med användning av 19,4 till 41 mg av poolade tibialis anterior (TA) muskler från 8 kontrollmöss. Både vänster (L) och höger (R) TA muskler framställdes i regenereringsförsök med muskler som samlats 3 dagar efter längd intramuskulär injektion av 25 pl koksaltlösning eller 10 iM cardiotoxin att orsaka muskelskada med hjälp av metoder som tidigare rapporterats ^en. Som framgår av tabell 1, A260 / 280-förhållanden för muskel kryosektion RNA är vanligtvis nära 2 eller högre i dessa representativa prover. Som "ren" RNA anses ha A260 / 280 av 2,0 och A260 / 280 av 1,8 till 2,2, är renheten hos kryosektion RNA-prover utmärkt ^9. Total RNA återhämtning var typiskt over 10 mikrogram per prov med utbyten av 0,18 till över 1 pg av total RNA per mg utgångsvävnad, vilket ger tillräckligt underlag för de flesta tillämpningar nedströms. Notably, RNA-koncentration, total-RNA extraherades, och RNA avkastning per mg utgångsvävnad från TA muskler 3 dagar post-toxinskada var signifikant högre än från saltlösning-injicerade terapi. Detta tyder på att det är bättre homogenisering när muskelstruktur störs av omfattande skador och / eller att det finns en ökning av gentranskription och / eller RNA-stabilitet i tre dag regenererande muskler. Den ihållande RNA kvalitet bedömdes genom enkel 1x TAE / 1,5% agarosgelelektrofores av 1 pl muskel kryosektion RNA efter prover vid -20 ° C förvarades i 18 månader. Framstående 18S och 28S rRNA-banden är fortfarande påtaglig i prover visar hög RNA kvalitet, även under suboptimala lagringsförhållanden (Figur 1A).

Muskel kryosektion RNAstöder tillämpningar nedströms

Ett mikrogram av RNA per poolade kryosektion prov behandlades med DNas och omvänt transkriberat från oligo dT primers. Efter RNas behandling, den totala volymen av den omvänt transkriberade cDNA var 30 pl. Enkel, icke-kvantitativ PCR med överskott förstärkning kördes för att bekräfta lönsamhet cDNA. Myogenic reglerande faktor 4 (Mrf4), en transkriptionsfaktor uppregleras med muskeldifferentiering, förstärktes genom att använda tidigare rapporterade mus primers, känner 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC och antisens 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG ^10, från 2 pl mall med hjälp av standard-PCR. Det fanns robust, specifik amplifiering av 234 bp Mrf4 fragment från både höger och vänster TA cDNA prover, men inte RT- (RNA ingår, men inget omvänt transkriptas), RT DDH ₂ O (omvänd transkription utan RNA-mall) eller DDH ₂ O PCR-kontroller (Figur 1B).Samma prover kördes i triplikat för Mrf4 och mOaz1 referenskontroll ⁴ kvantifiering med hjälp av relativ förstärkning och passiv fluorescens referens på en realtids-PCR-system. Mrf4 uttrycktes på 0,097-faldigt i toxin injicerade rätt TA jämfört med saltlösning injicerade vänster TA, beräknas med ΔΔCt metod ^4. Detta liknar tidigare rapporter om låg Mrf4 uttryck 3 dagar efter toxin skada på grund av en förlust av mogna muskelfibrer ^11. Att jämföra samstämmigheten kryosektion RNA för kvantitativ PCR, Ct-värden jämfördes för referensgenen mOaz1. Från sex prover var mOaz1 avskrift detekterades med en genomsnittlig Ct 17,242 ± 1,483 sd, medan den genomsnittliga Ct var 36,332 ± 3,61 sd i RT- kontrollprover (n = 4). Den täta gruppering av mOaz1 Ct signaler över prover tyder på att RNA isolerad från TA muskel kryosnitt presterar som förväntat i nedströms RNA uttryck analyser.

Exempel på indirekt immunofluorescens färgning av 7 pm tibialis anterior sektioner från kullkontrollmöss 3 dagar efter toxin injektion visas att upptäcka regenere fibrer (Figur 2). Båda sektionerna uppsamlades från muskel mindre än 150 | im från regionen som skall användas för RNA-analys på ett djup på 4,5 till 4,6 mm från den proximala muskelytan. Embryonala myosin tung kedja (eMHC, röd) upptäcker regenererande fibrer, kollagen VI (ColVI, grön) beskriver muskelfibrer, och DAPI fläckar kärnor blå, enligt protokoll 4. Regioner med koncentrerad kärn infiltrat (blå signal) visar platser av toxinskada , som framgår av aktivering av eMHC positiva nyligen regenererande muskelceller. Hela avsnittet kartor som det här exemplet används för kvantifiering av regenerering genom att beräkna andelen embryonic myosin tung kedja-uttryckande fibrer (röd, nyligen regener) eller centralt kärn fibrer som tidigare ^ett rapporterats. Noterbart är att det är förvånansvärt lite skada i TA muskeln i figur 2A. Medan det finns variation mellan injektionerna, typiska toxin injektioner påverka en mycket större andel av muskeln utrymmet ^1, såsom visas i figur 2B. Därför föreslår denna histologiska analys att giftet skada i figur 2A var minimal och ger ett viktigt verktyg för att tolka genexpressionsdata från den angränsande muskel kryosektion RNA-prov. Om hela muskeln hade använts för RNA-beredning av standardslipmetoder, skulle oväntat liten skada område av detta prov gör det en avvikare som skulle förvränga analyser nedströms. Istället para histologiska kvantifiering från samma muskel möjliggör direkt mätning av omfattningen av skadan från intilliggande sektioner. Detta möjliggör användning av inklusionen / uteslutningskriterier för att säkerställa att alla prover som ingår i nedströms RNA analyser möter en minimiskada tröskel eller normaliseringen av RNA-analyser enligt skadestorleken.

Figur 1: kvalitetsbedömning av RNA från sammanslagna Muscle Kryosnitt. A) 18S och 28S ribosomala RNA band är framträdande i RNA från poolade muskel kryosnitt 18 månader efter RNA-beredningen. B) Icke-kvantitativ PCR för Mrf4 efter omvänd transkription. 200 och 300 bp band av en DNA-stege är indikerade. RT-, omvänd transkription reaktion med RNA-mall men ingen omvänt transkriptas. _RT-H2O, omvänd transkription med DDH ₂ O, ingen RNA-mall. _H2O, ingen mall PCR kontroll med DDH ₂ O. I dessa experiment var toxin injiceras i rätt tibialis anterior (RTA) och salt was injicerades i den vänstra (LTA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Exempel på Maps Histologiska för muskelregeneration studier. A, B) Sammanställt kartor över enstaka tibialis anterior avsnitt 3 dagar efter toxininjektion visar exempel på dålig (A) och normal (B) toxin-inducerad skada. Vita inramade regionerna i varje sektion karta visas som infällda bilder för högre förstoring visning, röd, embryonala myosin tung kedja; grön, kollagen VI extracellulärt matrisprotein; blå, DAPI nukleär färgning. Skalstock, 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Representativa RNA utbyte och renhet Mätningar från poolade Muscle kryosnitt. Sexton tibialis anterior (TA) muskler sektionerades och poolade kryosektion prover bearbetades för RNA. Renat RNA (1 | il) analyserades med en nanospectrophotometer. Kolonn statistik utfördes i ett kalkylprogram, var gruppjämförelser utförs med hjälp av statistisk programvara.

Discussion

För att uppnå bästa resultat med denna metod, hålla bädda harts begränsas till den nedre tredjedel eller hälften av muskeln under vävnadsfrysförvaring, eftersom överskott av harts kommer att bromsa insamlingen av poolade kryosnitt och kan öka bädda föroreningar harts i RNA-isolering. Dessutom är noggrann uppmärksamhet under nålen homogenisering viktigt att maximera avkastningen och minska risken för igensättning av nålen. Protokollet kan modifieras genom användning av en Luer-Lok spruta för att skydda mot provförlust om nålen blir blockerad och kräver högt tryck för att driva bort täppa. Ett ytterligare nål homogeniseringssteg med en 25 eller 26 gauge nål kan också tillsättas för att åstadkomma en finare vävnadssuspension till ytterligare förstärkta RNA utbyte. Medan kloroform kan ersätta BCP, är detta inte rekommenderas som BCP är mindre toxiska och resulterar i lägre nivåer av genomiskt DNA kontaminering i den vattenhaltiga fasen under organisk extraktion av RNA ^12. Ökandesnittjockleken utjämnings kryosnitt över 30 um är också rekommenderas inte eftersom homogenisering blir mindre effektiv.

Om RNA-utbytet är lägre än önskade nivåer, kan olika strategier användas för att öka återhämtning såsom: i) öka milligram kvantiteten av startmaterial för att öka möjliga utbyte; ii) minska snittjocklek nedan 30 ^ m för att förbättra mekanisk homogenisering av vävnad; iii) öka varaktigheten av prov inkubation och nål homogenisering i den organiska extraktionsreagens för att förbättra mekanisk och kemisk vävnads störningar; och iv) om vävnads bitar kvar, utföra en andra extraktionssteg med strängare nål homogenisering. Alternativt kan det finnas vävnadsspecifika överväganden, såsom ytterligare fasseparation och utfällningssteg för prover med höga proteoglykaninnehåll ^13. Under RNA kolonnrening, kan en större elueringsvolym användas och utföra en andra eluering kan maximize totalt RNA återhämtning, men på bekostnad av RNA-koncentrationen. En post-kolonn alkoholutfällning kan användas för att koncentrera RNA om låg koncentration är ett bekymmer med denna modifiering. Om RNA-nedbrytning är ett problem, vilket minskar tiden för kryokonservering under dissektion, för att mer rigorös rengöring av kryostat ytor och verktyg minimera RNas exponering, utför nålen homogeniseringssteget i ett kallt rum, tillsats av en RNas-inhibitor reagens till kryosnitten ^14, och frekvent byte av RNas fritt lösningar kan varje bidra till att förhindra eller minimera exponeringen för RNaser och minska klyvningsaktivitet. Det är möjligt att en kort stund bada vävnaden i en RNas-inhibitor-reagens efter dissektion, men före kryokonservering, ytterligare kan minska prov nedbrytning. Dock bör preliminära experiment utföras för att säkerställa att sådana behandling inte ökar iskristaller eller andra artefakter under frysförvaring.

medan embryonalamyosin tung kedja / kollagen VI indirekt immunofluorescens används här som ett exempel för muskel analys av skada, tunna kryosnitt monterade på objektglas från dessa experiment kan användas för alla relevanta histologiska fläck som kan genomföras på frusna sektioner, inklusive immunofluorescerande teknik med post -fixation och hematoxylin / eosin färgning. I själva verket kan anpassningar av enkla immunofluorescerande protokoll som avses här vara nödvändigt. Till exempel, anti-mus sekundära antikroppar användes för att detektera en mus primär antikropp (t.ex., eMHC) kan också detektera endogena musimmunoglobuliner i målvävnaden. Sådana endogena antikroppar ackumuleras typiskt i skadade eller nekrotiska muskelfibrer i skadade eller dystrofisk muskeln orsakar bakgrund immunofluorescerande färgning. En sekundär reglaget (med primär antikropp utelämnad) bör alltid undersökas för att bedöma specificiteten av färgningen. Om endogen antikroppsbakgrund är problematiskt, bör pre-block steg varaläggas till protokollet för att förhindra eller minimera detektion av endogena mus immunoglobuliner ^15.

De huvudsakliga begränsningarna med metoden är att den kräver en kryostat och det är tidskrävande, vilket gör det relativt låg genomströmning. Till exempel kan en expert på tekniken kunde behandla upp till 16 muskler för poolade kryosnitt och objektglas (8 diabilder med dubbla sektioner av alla 16 vävnader) i ungefär 9-10 timmar. För nybörjare till cryosectioning kunde samling av poolade kryosnitt från två till fyra prover rimligen bemästras efter kryostat utbildning och en eller två träningar i stället erhålla kvalitets kryosnitt för histologi tog mer erfarenhet. Därför kan utrustning, tid eller utbildnings faktorer gör denna metod mindre användbar för mjukare vävnader som kan vara väl homogeniseras med en manuell mortelstöt homogenisator.

I jämförelse med icke-kryostat homogenisering metoder, RNA tvärstrimmig muskulatur förberedelses har rapporterats från muskelbiopsier med RNA-utbyten av 0,05 till 0,7 mikrogram RNA pre mg muskler ¹⁶ och på senare tid från 0,27 till 1,08 mikrogram RNA per mg muskel ^17. Därför den teknik som beskrivs här ger RNA ger lika bra eller bättre än icke-kryostat metoder med den extra fördelen att den möjliggör parade histologiska analyser från en angränsande region av samma prov. Noterbart är en tidigare studie används också cryosectioning för homogenisering i ryggradsvävnad och liknande funnit att cryosectioning vävnad förbättrad homogenisering effektivitet för RNA-isolering ^13. När denna teknik testades i nötkreatur skelettmuskelprover, den genomsnittliga RNA avkastningen per provberedning var 4,09 ± 0,36 pg, i den lägre delen av det normala intervallet redovisas här ^13. Laser capture microdissection är ett annat alternativ för insamling av vävnad för RNA-extraktion från en kryosektion. Laser capture är överlägsen denna poolade kryosektion metodatt den tillåter specificitet för att samla in endast en önskad delmängd av celler från sektionen och den kan utföras på ett enda vävnadssektion upp till 50 ^ m tjock ^18. Däremot kan insamling av en mikro-dissekeras provet vara svårt och lämplig utrustning är inte allmänt tillgängliga, vilket gör sammanslaget kryosektion homogenisering mer tillgängliga för forskare. När båda metoderna finns, till en preferens analysera ett vävnads delregion för ett program behöver endast små RNA mängder skulle gynna laser capture microdissection medan poolade kryosektion homogenisering är bäst när delregion analys är mindre viktig och behövs större mängder av RNA.

Medan histologiska och RNA isoleringsmetoder är i fokus här, är den poolade kryosektion metoden enkelt anpassas för att förbereda proteinlysat för Western blot-analyser eller mätningar enzymaktivitet. Till exempel var poolade kryosnitt från hjärtat löses för Western blot-analyser ^4and poolade kryosnitt från TA homogeniserades för succinatdehydrogenas aktivitetsanalyser av mitokondriell funktion ^5. Alternativt kan genomiska DNA-och proteinfraktioner separeras från andra faser under organisk extraktion efter RNA-isolering, som erbjuder potential för att härleda genomiskt DNA, protein, RNA, och histologiska mätningar från en enda vävnad efter en enda kryostat session.

Totalt sett är den största fördelen med denna metod för att öka experimentella flexibilitet genom att möjliggöra flera analytiska metoder som kräver olika provberedning från en enda vävnad. Metoden är mest lämpliga för muskler och andra vävnader med omfattande inträ- eller extracellulär struktur som minskar effektiviteten i mortelstöt baserad vävnad homogenisering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT