Summary
健康的な実験室飼育の生産は、ダニの生物学の研究、およびダニ病原体相互作用に不可欠であるダニ。ここでは、費用対効果およびマウスにストレスの少ないです未熟ダニ供給のための単純なプロトコルを示しています。
Abstract
マダニのscapularis、ライム病のベクトルは、東部と中西部米国で最も重要な病気のベクトルのうちの1つです。この種は、各開発段階のための脊椎動物宿主からの血液の食事を必要とする3つのホストダニで、成人女性は、再生のための血液の食事を必要とします。給餌のための5日間、完全に充血したときにホストを降ろし - 幼虫は3のために自分のホストに接続ティック。いくつかの異なるホスト上のこの依存性や充血のための長い添付ファイルの時間は、実験室の設定で飼育ダニを複雑にします。しかし、生物学をダニやダニ - 病原体相互作用を理解するために、健康、研究室飼育の生産が不可欠であるダニ。ここでは、マウスを餌未熟ダニのための簡単な、費用対効果の高いプロトコルを示しています。我々は、マウスで減少し、ストレスのための既存のプロトコルを変更し、ダニのwiの接触を避けるために、メッシュボトムなし使い捨てケージを使用して、成功と生存を供給増加ダニマウスの尿や糞で汚染された水。
Introduction
ティックは、脊椎動物の必須の赤血球性外部寄生虫であり、世界中に分布している。米国では、少なくとも11種のダニは公衆衛生上重要な病原菌のベクターである1 。 Ixodes肩甲介は、ライム病（ Borrelia burgdorferi ）再発熱（ B. miyamotoi）、ヒト顆粒球アナプラズマ症（ Anaplasma phagocytophilum ）、およびバベシア症（Babesia spp。）の原因物質のようないくつかの病原体の伝達に関与する。疾病ベクターとしての肩甲介の重要性にもかかわらず、研究室での研究のためにこれらのクモ形類を野生から豊富に収集することは、必ずしも実現可能ではない。したがって、健全な実験室で飼育されたダニの生産は、ダニ生物学およびダニ病原体の相互作用に関する研究にとって不可欠である。
I. scapularisを含むすべての硬ダニ（Ixodidae科）の生活環は、卵と3つの活性成分eステージ：幼虫、ニンフ、および成体。各活性段階は、脊椎動物の宿主に供給される。付着と摂食の数日にわたってダニとその宿主との間で起こる複雑な相互作用は人工フィーダーを用いて複製することはほとんど不可能であり、大量飼育のために十分な数の飼養されたダニを提供する可能性は低い2、3、4 。したがって、生きたマウスおよびウサギは、未成熟（幼虫および幼虫）およびダニの成熟段階（成虫）をそれぞれ飼育するための宿主として最も頻繁に使用される。各発達段階の間に複数の宿主が血液供給のために必要であるため、ダニの飼育が複雑になり、時間とコストが掛かる5,6,7。ほとんどのダニ飼育プロトコルでは、マウスを吊り下げられたワイヤーグリッドの床ケージ7,8または円筒状のカード動物は自由に移動し、それ自体6、9、10をグルーミングすることができないような寸法のGE。
これらの円筒形のケージは、後のワイヤグリッドで靴箱ケージに転送されます。充血し、剥離ダニは、次いで下水から収集されます。しかし、連邦準備制度を露光におけるこの方法の結果は、真菌の増殖を増加させ、死亡率9をチェックすることができ、尿及び糞便で汚染された水ティック。また、ダニ水トラフから脱出、ならびにマウスにストレスを引き起こす可能性が高くなります。これらの問題を回避するために、我々はここではプラスチック製の靴箱型の使い捨てケージ内でマウスの幼虫ダニの摂食を示しています。この方法は、マウスの正常な動作を可能に充血ダニ回復を増加し、汚染によるダニの死亡率を減少させます。
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Protocol
下記に概説プロトコル（数-00682）は、ネバダ大学リノ校で施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、ネバダ大学、リノの動物研究倫理委員会のガイドラインに従っています。手短に言えば、マウスをイソフルランで麻酔し、ノーズコーンを20分間連続イソフルランレベルを維持するために使用しました。獣医軟膏は、麻酔下で、目の乾燥を防ぐために使用されました。つま先のピンチは、麻酔のレベルを確認するために使用され、呼吸数は、プロシージャ全体で測定しました。マウスは、個々のケージに保管し、意識を取り戻したまで監視しました。マウスは、ダニの供給のために一度だけ使用し、ポストティック回復を安楽死させました。安楽死は、動物医療スタッフの人員の研究室で行いました。 CO 2及び頸椎脱臼は、動物を安楽死させるために使用されました。
注：ティックで作業が完了個人用保護EQを使用する必要がありますuipment。未成熟ダニをカウントするため、ゴムバンド、及び閉鎖つま先靴でキャップ白衣のスリーブ開口部を覆うように白白衣、長いニトリル手袋を着用します。ダニをマウスに寄生するために、ヘアネット、使い捨てカバーオール、袖オーバー長袖手袋、フットカバーを使用しています。わがままなダニを検出するために、白や明るい色のカバーオールを使用してください。定期的にダニ用手袋と袖を確認してください。
動物住宅用1.準備室
- ダニが寄生し、家のマウスに別の部屋を指定します。偶発チック脱出を防ぐために、外部のドアの内側に粘着マットまたは両面カーペットテープを置きます。
2.カウントはマウス加害ティック
- すべての7" ×5" ×14" プラスチック容器の上縁の周りに両面テープを入れて、約2cmまで水で満たします。
- ＆容器の中心に別の小さなボックスまたはペトリ皿を置き、作成1センチメートルまで水で満たします＃34;堀 "
- ペトリ皿の中に幼虫やニンフを含むバイアルを保管します。
- バイアルから幼虫または幼虫を取り除き、顕微鏡下で数えるために、細かいペイントブラシを使用してください。 50匹の幼虫または25匹のニンバを別々のシンチレーションバイアルに数える。バイアルをナイロンメッシュまたはオルガンディッシュのスクリーンで直ちに覆い、ゴムバンドで閉めます。
3.未成熟なティックでマウスに感染する
- 白または薄い色の作業台を使用し、両面テープを作業エリアの周辺に貼り付けます。
- イソフルランでマウスを麻酔する。つま先をつまんで麻酔のレベルを確認してください。麻酔を終えたら、マウスをペーパータオルで覆われた加熱パッドに移し、継続的なイソフルラン供給のためにノーズコーンに取り付けます。
- 乾燥を避けるために石油ゼリーベースの眼軟膏を塗布する。イソフルランレベルを調節するためのマウスの呼吸パターンに注意してください（毎分80~230回の呼吸が正常です）。もしbrであればイソフルランレベルを下げてくださいeathing率）は、動物を殺す避けるために毎分80未満の呼吸です。
- 50幼虫または若虫25の1つのバイアルを取り、場所はペイントブラシ（ 図1）と耳の間の頭部に毛下ティック。ダニは添付するのに十分な時間を与えるために配置した後20分間麻酔下でマウスを保管してください。
- 静的蓋と白の寝具標準、プラスチック製の靴箱型の使い捨てマウスケージにマウスを移動します。正常なマウスケアに従っておもちゃ、水、および食品を自由に提供します。
- トップエッジの周りに両面粘着テープと並ぶ大きなラットやスナネズミケージ内にマウスケージを保管してください。水3センチ（ 図2）と外側のケージを埋めます。
4.マウスからダニの収集
- 未熟ティックは日3及び摂食の6の間で切り離します。 3日後に毎日充血ダニのためのケージと水の堀を確認してください。
- 日4および6.痛みの間にケージから取り外したダニを集めますtブラシまたは軟らかい鉗子を使用してゴムバンドで固定されたナイロンメッシュ布でキャップされたきれいなシンチレーションバイアルに保管してください。
- 7日目にマウスに麻酔をかけ、残りの付着したダニを確認する。
- 7日目に詰まったダニについて寝具、フードトラフ、水筒を点検する。上記の手順に従ってマウスを安楽死させる。使い捨てケージ、寝具、ウォーターボトル、フードトラフをオートクレーブして、脱落しないようにします。
5. Fed Ticksの保管
- 90％の湿度で虫歯を防ぎ、20 湿潤および温度制御されたインキュベーター中で脱皮が起こるまで、12：12の明暗サイクルを繰り返す。これには約12〜18週間かかります。
- 湿度が高いとダニの生存が促進されるが、ダニは真菌の過増殖を起こしやすい。少なくとも1週間に1回、顕微鏡下で飼育されたダニを金型検査する。検出された場合、生存者を70％エタノールで5回洗浄する分、乾燥するためにろ紙に移し、水ですすぎ、そして新しい、きれいなバイアルに移します。
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Representative Results
我々は、改善された給電効率を既存のダニ飼育プロトコル6、10を変更し、マウス宿主へのストレスを低減します。結果は、標準的なシューボックススタイルのマウスのケージは、ダニの飼育に適していることを示しています。白い寝具は、供給されたダニの容易な収集のための良好なコントラストを提供します。ほとんどのダニは、給餌後、容器の壁を登っおよび収集することが容易でした。また、（日常UNRでハウジングマウス用）、使い捨てプラスチックの箱の緊密な嵌合蓋は、ボックスからの脱出をチェック防ぎます。さらに、当社は、ダニの侵入（ 図1）のためのマウスを剃るませんでした。公表されたプロトコルにおけるこれらの変化は重要なダニの添付ファイル、充血、および生存しました。
それは、これらのalreadの外に特別なマウスのケージを必要としないため、このプロトコルは、費用効果的ですy使用中です。私たちが毎日虫歯を摘出する必要がないので、労働集約的でもありません。感染後4日目から6日目までにダニを集めました。ほとんどのダニは4日目に剥がれ、残りのいくつかは5日目に分離した.7日目までに全てのマウスにダニがなかった。私たちは平均67％（52〜92％の範囲）の虫歯を回復することができました（ 表1 ）。すべてのマウスは健康であり、不快感の兆候は見られなかった。
図1：マウスのIxodes肩甲骨幼虫への給餌。マウスには、50匹の幼虫ダニを個々に感染させた。虫歯が4〜6日の間にマウスから落ちた。7日目に残ったダニについてケージをチェックし、その後廃棄した。 A：未成熟幼虫ダニを有するマウスに蔓延する。 B：マウスの耳に付く幼虫のダニ。 C：アンマウスの耳に付着した繁殖した幼虫ダニ、3日後の寄生。 D：稚魚と完全に繁殖したダニの幼虫。
図2：ダニ寄生虫のためのマウスケージセットアップ。 2つの使い捨てマウスケージをスナネズミケージの中に入れた。約3cm。スナネズミケージに水を加えて堀を作った。ダニの脱出を避けるために、両面粘着性のカーペットテープをスナネズミケージの上端の周りに貼り付けた。
| 動物（マウス） | 回収された幼虫ダニの総数 | 回復した幼虫の斑点の百分率 |
| 1 | 34 | 68％ |
| 2 | 32 | 64％ |
| 3 | 38 | 76％ |
| 4 | 28 | 56％ |
| 5 | 39 | 78％ |
| 6 | 26 | 52％ |
| 7 | 46 | 92％ |
| 8 | 29 | 58％ |
| 9 | 29 | 58％ |
| 10 | 33 | 66％ |
| 平均 | 66.8パーセント |
表1： 麻酔マウスのホストに研究所寄生後に回収 充血 マダニscapularis 幼虫 の数 。各マウスは、50幼虫が寄生しました。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
偶発的な逃げを避けるためにダニを飼育するときは、いくつかのレベルの安全対策が必要です。粘着テープと水面を使用することは、安全性を確保する上で重要です。体温を一定に保つために、麻酔したマウスをヒーティングパッド上に置くことが重要です。我々はまた、マウスをシェービングしても、ダニ付着のための特別な利益は得られないことも分かった。個々のマウスは、指定された「ティックルーム（tick room）」内で同じケージ内で1週間保持することができ、これにより、ダニと人員との接触がさらに制限される。
変更とトラブルシューティング
ダニ生物学およびダニ - 病原体相互作用の研究には、高品質で実験室で飼育されたダニの生産が必要である。以前の栄養補給プロトコルは、マウスを不動に保つために懸架式ワイヤーフロア8または円筒形ケージを使用した6,10であり、動物へのストレスと同様に余分なコストもかかる。さらに、懸架されたワイヤーケージは、虫歯を起こしたダニをマウスの尿および糞便で汚染された水中にワイヤーを介して落下させ、したがってカビの増殖のリスクを増加させる。
技術の限界
データに示されているように、平均65％（最大92％）のダニを正常に回復しました。私たちはマウスケージの外にある水底でダニを見つけましたが、何も逃げませんでした。第2の容器の外壁の粘着テープは、ダニが逃げないようにした。
既存/代替法に関する技術の意義
靴箱型の使い捨て可能なマウスケージを使用する我々のプロトコルは、自由な動作範囲を可能にし、ダニの摂食を可能にするためにマウスを拘束する必要がないことを実証する。ほとんどの飼育されたダニは透明なケージの壁から容易に見られ、収集され、残りのダニは容易に給餌サイクルの終わりに寝具の中で検出された。このプロトコルはカスタムマウスケージを必要とせず、したがって費用効果が高い。
文献によれば、ダニの50％未満がマウスに付着し、付着したダニがすべて完了するとは限らないことが示唆されている。平均して、我々は〜60％の虫歯の幼虫ダニを集めた。私たちは、逃げた、または餌をつけたダニを見つけませんでした。時には、水鳥の堀に1つか2つの虫歯が出現したが、粘着テープには見つからなかったことがある。我々の結果は、すべてのダニが宿主に付着するわけではなく、摂食をせずに死ぬ可能性があることを示唆している。手つかずの死んだダニは、ごみの中で見つけにくかった。時折、我々はまた、白い寝具に血液のしみがあることを発見しました。これは、いずれかのマウスが落ちたか傷がついた後に虫歯を起こしたダニを殺したことを示唆しています。我々のデータおよびケージの毎日の観察では、虫歯の壁がケージの上に移動するか、マウスの手の届かないところにベッドの下に隠れるかのいずれかが示唆されます。したがって、同封のケージにはダニ生存率に負の影響を与える。
このテクニックを習得した後の将来のアプリケーションまたは方向
私たちの議定書は、追加費用をかけることなく、動物を扱う人員の安全性を低下させることなく、ダニを大量に飼育するための簡単な代替手段を提供しています。今後の実験では成人I型肩甲骨腺への給餌方法の改善に焦点を当てる予定である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
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