Summary
La production de tiques élevées élevées en laboratoire est essentielle pour les études sur la biologie des tiques et les interactions tic-pathogène. Ici, nous démontrons un protocole simple pour l'alimentation de tiques immatures qui est rentable et moins stressant pour les souris.
Abstract
Ixodes scapularis , le vecteur de la maladie de Lyme, est l'un des vecteurs de maladies les plus importants dans l'est et le Midwest des États-Unis. Cette espèce est une tumeur de trois hôtes qui nécessite un repas sanguin provenant d'un hôte vertébré pour chaque étape de développement, et les femelles adultes ont besoin d'un repas sanguin pour la reproduction. Les tiques larvaires s'attachent à leur hôte pendant 3 à 5 jours pour nourrir et déposer l'hôte lorsqu'ils sont complètement engorgés. Cette dépendance à l'égard de plusieurs hôtes différents et le temps d'attachement prolongé pour engorgement complique l'élevage de tiques en laboratoire. Cependant, pour comprendre les interactions biologie et tick-pathogène, la production de tiques saines et élevées en laboratoire est essentielle. Ici, nous démontrons un protocole simple et rentable pour l'alimentation des tiques immatures sur les souris. Nous avons modifié les protocoles existants pour une diminution du stress sur les souris et une augmentation de la réussite et de la survie de l'attaque par utilisation de cages jetables sans fond de maille pour éviter le contact des tiques avecL'eau contaminée par les urines et les excréments de souris.
Introduction
Les tiques sont des ectoparasites hématophages obligés des vertébrés et sont distribués dans le monde entier. Aux États-Unis, au moins 11 espèces de tiques sont des vecteurs d'agents pathogènes d'importance pour la santé publique 1 . Ixodes scapularis est responsable de la transmission de plusieurs agents pathogènes tels que les agents responsables de la fièvre récurrente de la maladie de Lyme ( Borrelia burgdorferi ) ( B. miyamotoi), l'anaplasmose granulocytaire humaine ( Anaplasma phagocytophilum ) et la babésiose (Babesia spp.). Malgré l'importance de I. scapularis en tant que vecteur de maladie, la collecte de ces arachnides en abondance de la nature pour des études au laboratoire n'est pas toujours réalisable. Par conséquent, la production de tiques saines élevées en laboratoire est essentielle pour les études sur la biologie des tiques et les interactions tic-pathogène.
Le cycle de vie de toutes les tiques dures (famille Ixodidae), y compris I. scapularis, consiste en l'oeuf et trois activétapes e: larve, nymphe et adulte. Chaque phase active se nourrit d'un hôte vertébré. Les interactions complexes qui ont lieu entre les tiques et leurs hôtes pendant plusieurs jours de fixation et d' alimentation sont presque impossibles à reproduire en utilisant les mangeoires artificielles, et ne sont pas susceptibles de fournir suffisamment de numéros de fed tiques pour l' élevage de masse 2, 3, 4. Par conséquent, des souris vivantes et les lapins sont utilisés le plus souvent comme hôtes pour l'élevage immatures (larves et nymphes), et les stades matures (adultes) de tiques, respectivement. L'exigence de plusieurs hôtes pour l' alimentation du sang au cours de chaque stade de développement complique l' élevage de la tique, et il est long et coûteux 5, 6, 7. La plupart des protocoles d' élevage tiques exigent en gardant les souris dans une cage de plancher en treillis métallique suspendue 7, 8 ou dans un ca cylindriquege de dimensions telles que l'animal ne peut pas se déplacer librement et de se toiletter 6, 9, 10.
Ces cages cylindriques sont ensuite transférés dans une cage de boîte à chaussures avec une grille de fil. Engorgés, les tiques individuelles sont ensuite recueillies à partir de l'eau en dessous. Cependant, cette méthode conduit à exposer les tiques nourris à l' eau contaminée par des matières fécales et l' urine qui peuvent augmenter la croissance fongique et les tiques de la mortalité 9. De plus, il augmente la possibilité d'échapper à cocher du bac d'eau, ainsi que causer du stress à des souris. Pour contourner ces problèmes, nous démontrons ici l'alimentation des larves de tiques sur des souris dans des cages en plastique jetables de type boîte à chaussures. Cette méthode permet le comportement normal des souris, des augmentations engorgés récupération des tiques, et diminue la mortalité des tiques en raison de la contamination.
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Protocol
Le protocole (numéro-00682) décrit ci-dessous est approuvé par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l'Université du Nevada Reno et suit les directives de l'Université du Nevada, le comité d'éthique de la recherche animale de Reno. En bref, des souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et un cône de nez a été utilisé pour maintenir les niveaux continus isoflurane pendant 20 min. Une pommade vétérinaire a été utilisé pour éviter le dessèchement des yeux sous anesthésie. pincement de l'orteil a été utilisé pour déterminer le niveau d'anesthésie et le rythme respiratoire a été mesurée tout au long de la procédure. Les souris ont été gardés dans des cages individuelles et surveillés jusqu'à ce que a été repris conscience. Les souris ont été utilisées qu'une seule fois pour l'alimentation et les tiques ont été euthanasiés après récupération de la tique. Euthanasie a été réalisée par le laboratoire du personnel du personnel de médecine animale. CO 2 et luxation cervicale ont été utilisés pour euthanasier les animaux.
REMARQUE: Travailler sur les tiques nécessite l'utilisation de l'équation de protection individuelle complèteATION. Pour compter les tiques immatures, porter sarrau blanc, de longs gants en nitrile pour couvrir l'ouverture du manchon du sarrau coiffé avec des bandes en caoutchouc et des chaussures fermées. Pour les souris infester avec les tiques, utilisez un filet de cheveux, vêtements jetables, gants à manches longues sur les manches, et couvre-pieds. Utilisez une combinaison de couleur blanche ou la lumière pour détecter les tiques capricieuses. Vérifiez régulièrement des gants et des manches pour les tiques.
1. Chambre Préparation du logement des animaux
- Désigner une pièce séparée pour les souris domestiques infestés par les tiques. Placer un tapis collant ou de la bande de tapis double face à l'extérieur et à l'intérieur de la porte pour empêcher la fuite de la tique accidentelle.
2. Compter pour Tiques Souris Infestation
- Mettre ruban adhésif double face tout autour des bords supérieurs de 7" x 5" x 14" récipient en matière plastique et remplir avec de l'eau à environ 2 cm.
- Placer une autre petite boîte ou boîte de Petri dans le centre du récipient et remplir d'eau de 1 cm et la création d'un# 34; fossé "autour de ce conteneur
- Rangez le flacon contenant des larves ou des nymphes à l'intérieur de la boîte de Petri.
- Utilisez un pinceau fin pour enlever les larves ou nymphes du flacon et compter sous le microscope. Nommer 50 larves ou 25 nymphes dans des flacons de scintillation séparés. Couvrir les flacons immédiatement avec un tissu en maille de nylon ou d'organdie et fermer avec des bandes de caoutchouc.
3. Ingestion de souris avec des tiques immatures
- Utilisez un banc de travail blanc ou de couleur claire et collez le ruban double face autour du périmètre de la zone de travail.
- Anesthésier la souris avec de l'isoflurane. Vérifiez le niveau d'anesthésie par pincement. Une fois anesthésiés, transférez la souris sur un coussin chauffant recouvert de papier essuie-tout et attachez-le à un cône de nez pour continuer l'alimentation en isoflurane.
- Appliquer une pommade à base de pétrole à base de gelée pour éviter la sécheresse. Notez le mode de respiration de la souris pour ajuster les niveaux d'isoflurane (80 - 230 respirations par minute est normale., Réduisez le niveau d'isoflurane si brtaux eathing est inférieur à 80 respirations par minute pour éviter de tuer l'animal).
- Prendre un flacon de 50 larves ou nymphes 25 et placer les tiques sous la fourrure sur la tête entre les oreilles avec une brosse à peinture (Figure 1). Gardez la souris sous anesthésie pendant 20 minutes après le placement pour donner suffisamment de temps pour les tiques à joindre.
- Déplacer la souris pour une boîte de type fer standard, plastique cage de la souris jetable avec des couvercles statiques et de la literie blanche. Fournir des jouets, l' eau, et ad libitum alimentaire par les soins de la souris normale.
- Stocker la cage de la souris dans une cage d'un rat ou gerbille plus grande bordée de ruban adhésif double-face autour des bords supérieurs. Remplir la cage externe avec 3 cm d'eau (figure 2).
4. Collectionner Tiques de souris
- tiques immatures se détachent entre les jours 3 et 6 de l'alimentation. Vérifiez les cages et les douves de l'eau pour les tiques engorgées chaque jour après jour 3.
- Recueillir les tiques détaché de la cage entre les jours 4 et 6. A l'aide d'une douleurBrosse à t ou une pince souple pour ramasser les tiques gorgées et stocker dans des flacons de scintillation propres coiffés avec un tissu à mailles en nylon fixé avec des bandes de caoutchouc.
- Anesthésier et vérifiez la souris le jour 7 pour toutes les autres tiques attachées.
- Vérifiez la literie, bac alimentaire, et une bouteille d'eau pour les tiques engorgés le jour 7. souris euthanasier suivant la procédure décrite ci-dessus. Autoclaver les cages à usage unique, de la literie, bouteille d'eau, et le creux de la nourriture afin d'éviter tout fuyant tiques à jeun.
5. Stockage de la Fed Tiques
- Maintenir les tiques gorgées à 90% d'humidité, 20 ° C, et un 12:12 cycle lumière: obscurité dans un incubateur à humidité contrôlée et la température jusqu'à ce que la mue se produit. Cela peut prendre environ 12 à 18 semaines pour se produire.
- Alors que l'humidité élevée favorise la survie tick, il fait aussi les tiques sujettes à la prolifération fongique. Vérifiez la fed tiques au microscope au moins une fois par semaine pour le moule. Si elle est détectée, laver les survivants dans 70% d'éthanol pour 5Min., Rincer à l'eau, transférer dans un papier filtre pour sécher et transférer sur des flacons nouveaux et propres.
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Representative Results
Nous avons modifié les protocoles existants d'élevage de tiques 6 , 10 pour améliorer l'efficacité de l'alimentation et réduire le stress sur l'hôte de la souris. Les résultats démontrent que les cages de souris de style shoebox sont bien adaptées pour l'élevage de tiques. La literie blanche a donné un bon contraste pour une collecte facile des tiques alimentées. La plupart des tiques ont grimpé les murs des récipients après leur alimentation et ont été faciles à collecter. En outre, le couvercle serré des boîtes en plastique jetables (utilisé couramment pour le boîtier de souris à l'UNR) a empêché la chute de toupie de la boîte. En outre, nous n'avons pas rasé les souris pour l'infestation par tique ( figure 1 ). Ces changements dans les protocoles publiés ont abouti à des attaques importantes, à l'engorgement et à la survie.
Ce protocole est rentable car il ne nécessite aucune cage de souris spéciale en dehors de ces already en utilisation. Il est également moins de travail que nous ne devions pas recueillir les tiques engorgées chaque jour. Nous avons recueilli les tiques entre les jours 4 et 6 infestations de poste. La plupart des tiques détachés par jour 4 et quelques restants détachés par jour 5. Le jour 7 toutes les souris étaient exempts de tiques. Nous avons pu récupérer une moyenne de 67% (fourchette 52-92%) engorgés tiques larvaires (tableau 1). Toutes les souris étaient en bonne santé et ne montraient aucun signe d'inconfort.
Figure 1: Alimentation Ixodes scapularis Larves sur les souris. Les souris ont été infestées individuellement avec 50 tiques larvaires. Les tiques engorgées déposés la souris entre les jours 4 - 6. Les cages ont été vérifiées pour toutes les tiques restantes le jour 7 et mis au rebut par la suite. A: souris infestant avec des tiques à jeun larves. B: Une coche des larves de fixation à l'oreille d'une souris. C: Unetique des larves engorgé attaché à l'oreille d'une souris, trois jours infestation de poste. D: unfed et les larves de tiques entièrement engorgée.
Figure 2: Souris Cage pour Tick Set Infestation. Deux cages de souris jetables ont été maintenus à l'intérieur d'une cage gerbille. Environ 3 cm. l'eau a été ajouté à la cage gerbille pour faire un fossé. bande de tapis collant double face a été apposée sur les bords supérieurs de la cage gerbille pour éviter échapper à cocher.
| Des animaux (souris) | Nombre total de tiques larvaires récupéré | Pourcentage des tiques larvaires récupérés |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| dix | 33 | 66% |
| MOYENNE | 66,8% |
Tableau 1: Nombre de Engorged Ixodes scapularis Larves récupéré après laboratoire Infestation sur les hôtes anesthésié Souris. Chaque souris était infestée de 50 larves.
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Discussion
Étapes critiques dans le protocole
Il est important d'avoir plusieurs niveaux de mesures de sécurité lors de l'élevage des tiques pour éviter une fuite accidentelle. L'utilisation de ruban adhésif et d'un fossé d'eau est essentielle pour assurer la sécurité. Il est important de garder la souris anesthésiée sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps constante. Nous avons également constaté que le rasage de la souris ne fournit aucun bénéfice supplémentaire pour la fixation des tiques. Une souris individuelle peut être conservée dans la même cage pendant une semaine dans une "case à cocher" désignée qui limite le contact des tiques avec le personnel.
Modifications et dépannage
La production de tiques de haute qualité et élevées en laboratoire est nécessaire pour les études sur la biologie des tiques et les interactions tic-pathogène. Les protocoles d'alimentation antérieurs ont utilisé le plancher de fil suspendu 8 ou des cages cylindriques pour garder les souris immobiles 6 , 10 qui comportent des coûts supplémentaires ainsi que le stress pour l'animal. En outre, la cage en fil suspendu permet aux tiques engorgées de tomber à travers le fil dans l'eau contaminée par l'urine et les excréments de la souris, ce qui augmente le risque de croissance des moisissures.
Limites de la technique
Comme le montrent les données, nous avons récupéré en moyenne 65% (jusqu'à 92%) des tiques. Nous avons parfois trouvé des tiques dans les fossés d'eau à l'extérieur de la cage de la souris, mais aucun n'a échappé. Le ruban collant sur les parois extérieures du deuxième récipient a empêché les tiques de s'échapper.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Notre protocole d'utilisation des cages de souris jetables à base de boîtes à chaussures permet une gamme de mouvement libre et démontre que les souris n'ont pas besoin d'être retenues pour permettre l'alimentation de la tique. La plupart des tiques alimentées ont été facilement vues et collectées à partir des murs de la cage transparente et toutes les tiques restantes sont facilementdétectée entre literie à la fin du cycle d'alimentation. Ce protocole ne nécessite pas de cage de souris personnalisé, par conséquent, il est rentable.
La littérature suggère que moins de 50% des tiques attacher à la souris et non pas toutes les tiques annexés nourrissent à la fin. En moyenne, nous avons recueilli 60% ~ tiques larvaires engorgés. Nous n'avons trouvé aucune échappèrent tiques ou non alimentés fed. De temps en temps, nous avons trouvé un ou deux tiques larvaires congestionnés dans le fossé de l'eau, mais pas sur le ruban adhésif. Nos résultats suggèrent que toutes les tiques attachent à l'hôte et peuvent mourir sans se nourrir. tiques, unfed morts étaient difficiles à trouver dans la litière. De temps en temps, nous avons aussi trouvé des taches de sang sur la literie blanche qui suggère que soit la souris ont tué la tique engorgée après avoir déposé ou grattée. Nos données et de l'observation quotidienne des cages suggèrent que les tiques engorgé soit déplacer sur les parois de la cage et le haut de la cage ou se cacher sous la litière hors de portée de la souris. Par conséquent, la cage fermée n'ont pasImpact négatif sur la survie des tiques.
Les futures applications ou les directives après la maîtrise de cette technique
Notre protocole offre une alternative simplifiée pour l'élevage en masse des tiques sans ajouter de coût supplémentaire ni réduire la sécurité du personnel qui manipule les animaux. L'expérimentation future se concentrera sur l'amélioration des méthodes d'alimentation des adultes I. scapularis .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
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