Summary
Produksjonen av sunne laboratorie oppdratt flått er viktig å studier på kryss biologi, og kryss-patogen interaksjoner. Her viser vi en enkel protokoll for umoden tick fôring som er kostnadseffektivt og mindre stressende for mus.
Abstract
Ixodes scapularis , vektoren av Lyme sykdom, er en av de viktigste sykdomsvektorer i øst og Midtvesten. Denne arten er en tre vert tick som krever et blod måltid fra en vertebrate vert for hvert utviklingsstadium, og de voksne kvinnene krever et blod måltid for reproduksjon. Larval flått festes til verten i 3 - 5 dager for fôring og slipp av verten når den er fullstendig engorged. Denne avhengigheten av flere forskjellige verter og den lange vedleggstiden for engorgement kompliserer tikkeoppdrett i laboratorieinnstillingen. For å forstå kryssbiologi og kryss-patogen-interaksjoner er imidlertid produksjon av sunne, laboratorieoppdrett flått nødvendig. Her demonstrerer vi en enkel, kostnadseffektiv protokoll for umodne kryssfôring på mus. Vi endret de eksisterende protokollene for redusert stress på mus og økt fiksing av fôringssuksess og overlevelse ved bruk av engangsbur uten maskebunn for å unngå kontakt med flått with vann som er forurenset med mus urin og avføring.
Introduction
Ticks er obligatorisk hematofag ectoparasites av vertebrater og distribueres over hele verden. I USA er minst 11 arter av flått vektorer av patogener av folkehelsemessig betydning 1 . Ixodes scapularis er ansvarlig for overføring av flere patogener, som forårsaker av Lyme sykdom ( Borrelia burgdorferi ) relapsing feber ( B. miyamotoi), human granulocytisk anaplasmosis ( Anaplasma phagocytophilum ) og babesiosis (Babesia spp.). Til tross for viktigheten av I. scapularis som en sykdomsvektor, er det ikke alltid mulig å samle disse arachnider i overflod fra naturen til studier i laboratoriet. Derfor er produksjon av friske laboratorieoppdrett flått nødvendig for studier av fekbiologi og kryss-patogen-interaksjoner.
Livssyklusen til alle harde flått (familie Ixodidae), inkludert I. scapularis, består av egget og tre aktivaE stadier: larver, nymf og voksen. Hver aktiv fase fôrer på en vertebrat vert. De komplekse interaksjonene som foregår mellom flått og verter over flere dager med vedlegg og fôring er nesten umulig å replikere ved hjelp av kunstige matere, og er usannsynlig å gi nok antall matte flått til massestall 2 , 3 , 4 . Derfor brukes levende mus og kaniner hyppigst som verter for oppdrett av umodne (larver og nymfer), og modne stadier (voksne) av flått, henholdsvis. Kravet på flere verter for blodfôring under hvert utviklingsstadium kompliserer kryssoppdrett, og er tid og kostnadskrevende 5 , 6 , 7 . De fleste kryssopdriftsprotokoller krever at musene holdes i et hengslet kabinett 7 , 8 eller i sylindrisk ca.Ge av slike dimensjoner at dyret ikke kan bevege seg fritt og gifte seg selv 6 , 9 , 10 .
Disse sylindriske burene overføres senere til en skoboksbur med et nettgitter. Engorged, frittliggende flått blir deretter samlet fra vannet under. Imidlertid resulterer denne metoden i å utsette matte flått til vann forurenset med urin og avføring som kan øke soppvekst og kryssdødelighet 9 . I tillegg øker det muligheten for tippflukt fra vannet, samt forårsaker stress til mus. For å omgå disse problemene demonstrerer vi her larvkryssfôring på mus i engangsskobber av plastskoboks. Denne metoden tillater normal oppførsel av mus, øker engorged tick recovery, og reduserer tick mortality på grunn av forurensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen (Nummer-00682) som er skissert nedenfor, er godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) ved University of Nevada Reno, og følger retningslinjene fra University of Nevada, Renos dyreforskningsetikkkomité. Kort fortalt ble musene bedøvet med isofluran og en nesekegle ble brukt for å opprettholde kontinuerlige isoflurannivåer i 20 minutter. En veterinærsalve ble brukt for å forhindre tørking av øynene under anestesi. Tånpinne ble brukt til å fastslå anestesienivået og pustehastigheten ble målt gjennom hele prosedyren. Mus ble holdt i individuelle bur og overvåket til bevisstheten ble gjenvunnet. Mus ble brukt bare en gang for tannfôring og ble euthanisert etter kryssutvinning. Eutanasi ble utført av Laboratory of Animal Medicine staff personell. CO 2 og cervikal dislokasjon ble brukt for euthanizing dyr.
MERK: Arbeid på flått krever bruk av komplett personlig beskyttende equipment. For telling av umodne midd, ha hvite laboratoriefrakker, lange nitril hansker for å dekke hylsen åpningen av frakk lukket med gummibånd, og lukket tå sko. For å infisere mus med flått, bruker et hår net, engangs kjeledress og langermet hansker over hylsene, og foten deksler. Bruk hvite eller lyse farget kjeledress å oppdage villfarne flått. Med jevne mellomrom sjekke hansker og ermer for flått.
1. Klar Rom for Animal Housing
- Utpeke et eget rom for å huse mus befengt med flått. Plasser en klebrig matte eller dobbeltsidig teppe tapen på utsiden og innsiden av døren for å hindre utilsiktet hake flukt.
2. Telle Ticks for Mouse Infestation
- Sett dobbeltsidig tape rundt toppkantene på en 7" x 5" x 14" plastbeholder og fylles med vann til ca. 2 cm.
- Plasser en annen liten boks eller petriskål i midten av beholderen og fylles med vann til 1 cm skape en &# 34; moat "rundt denne beholderen
- Oppbevar hetteglasset som inneholder larver eller nymfer inne i petriskålen.
- Bruk en fin pensel for å fjerne larver eller nymfer fra hetteglasset og telle under mikroskopet. Count 50 larver eller 25 nymfer i separate scintillasjonsflaskene. Dekk hetteglassene umiddelbart med nylonmaske eller organdydukskjerm og lukk med gummibånd.
3. Festende mus med umodne flått
- Bruk et hvitt eller lyst arbeidsbenk og hold dobbeltsidig tape rundt omkretsen av arbeidsområdet.
- Bedøv musen med isofluran. Kontroller narkosenivået ved tåspenning. Når du er bedøvet, overfør musen til en varmepute dekket med papirhåndklær og fest til en nesekegle for fortsatt isofluranforsyning.
- Påfør oljeoljebasert øyesalve for å unngå tørrhet. Legg merke til pustemønsteret for musen for å justere isoflurannivået (80 - 230 puste per minutt er normalt., Reduser isoflurannivået hvis brEathing rate er mindre enn 80 puste per minutt for å unngå å drepe dyret).
- Ta ett hetteglass med 50 larver eller 25 nymfer og legg flått under pelsen på hodet mellom ørene med en pensel ( figur 1 ). Hold musen under anestesi i 20 minutter etter plassering for å gi nok tid til ticks å feste.
- Flytt musen til en standard, plast-sko-boks-type engangs musekasse med statiske lokk og hvitt sengetøy. Gi leker, vann og mat ad libitum som per vanlig musepleie.
- Oppbevar musekassen i en større rotte- eller gerbilbue foret med dobbeltsidig klebrig tape rundt toppkanter. Fyll den ytre buret med 3 cm vann ( Figur 2 ).
4. Samle flått fra mus
- Umiddelbare flått løsner mellom dag 3 og 6 av fôring. Kontroller burene og vassgraven for fargede flått hver dag etter dag 3.
- Samle frittstående flått fra buret mellom dagene 4 og 6. Bruk en smertet børste eller myke tang for å plukke opp engorged flått og lagre i ren scintillasjonsglass avkortet med nylon nettduk sikret med gummibånd.
- Anesthetize og sjekk mus på dag 7 for eventuelle gjenværende festet flått.
- Kontroller sengetøy, mat trau, og drikkeflaske for engorged flått på dag 7. avlive mus etter den prosedyre som er beskrevet ovenfor. Autoklaver engangs bur, sengetøy, vann flaske, og mat trau for å unngå eventuelle rømmer uforede flått.
5. Lagring av Fed Flått
- Oppretthold engorged flått ved 90% fuktighet, 20 ° C, og en 12:12 lys: mørke syklus i en luftfuktighet og temperatur styres inkubator inntil hamskifte inntreffer. Dette kan ta omtrent 12 til 18 uker å skje.
- Mens høy fuktighet fremmer overlevelse hake, gjør det også flått som er utsatt for soppvekst. Sjekk matet flått under mikroskopet minst en gang i uken for mold. Hvis det oppdages, vask overlevende i 70% etanol for 5min., skylles i vann, overført til et filterpapir for å tørke, og overføring til nye, rene ampuller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har endret eksisterende tick-oppsamlingsprotokoller 6 , 10 for bedre fôringseffektivitet og redusert stress på musens vert. Resultatene viser at standardmuseet med buksestangsmuseet er godt egnet for tyrking. Det hvite sengetøy ga en god kontrast for enkel samling av matte flått. De fleste flåttene klatret opp veggene av beholderne etter fôring og var lett å samle. I tillegg forhindret det tettmonterte dekselet til de engangsplastikkene (rutinemessig brukt for mushus ved UNR) å hindre tippekast fra esken. I tillegg barberte vi ikke mus for kryssinfeksjon ( figur 1 ). Disse endringene i publiserte protokoller resulterte i signifikant festevedlegg, engorgement og overlevelse.
Denne protokollen er kostnadseffektiv fordi den ikke krever noen spesielle musebure utenfor disse alreadeney i bruk. Det er også mindre arbeidskrevende som vi ikke trenger å samle engorged flått hver dag. Vi samlet inn flått mellom dag 4 og 6 etter angrep. De fleste flått frittliggende etter dag fire og noen få gjenværende frittliggende etter dag 5. Dag 7 alle musene var fri for flått. Vi var i stand til å gjenopprette et gjennomsnitt på 67% (fra 52 til 92%) Oppsvulmet larve flått (tabell 1). Alle musene var sunn og viste ingen tegn til ubehag.
Figur 1: Mate Ixodes scapularis Larvene på mus. Mus ble individuelt infisert med 50 larver flått. De engorged flått droppet av musen mellom dager 4 - 6. Burene ble sjekket for eventuelle gjenværende flått på dag 7 og forkastet etterpå. A: å infisere mus med uforede larve flått. B: En larve flått fester seg til øret av en mus. C: EnEngorged larval tick festet til øret av en mus, 3 dager etter angrep. D: Unfed og fullt engorged tick larver.
Figur 2: Muskage Konfigurert for Tickfesting. To disponible musekasser ble holdt inne i en gerbilbur. Omtrent 3 cm. Vann ble tilsatt til gerbilburet for å lage en vollgrav. Dobbeltsidig klissete teppebånd ble festet rundt toppkanten av gerbilburet for å unngå kryssflukt.
| Dyr (mus) | Totalt antall larve flått gjenvunnet | Prosent av larver flått gjenvunnet |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | 38 | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 46 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| GJENNOMSNITT | 66,8% |
Tabell 1: Antall engorged Ixodes scapularis Larvae gjenvunnet etter laboratorieinfeksjon på bedøvede mus-verter. Hver mus ble infisert med 50 larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å ha flere nivåer av sikkerhetstiltak når oppdragelse flått å unngå utilsiktet flukt. Bruk av tape og en vannvollgrav er avgjørende for å ivareta sikkerheten. Det er viktig å holde en bedøvet mus på en varmepute for å holde kroppstemperaturen konstant. Vi fant også at å barbere musa ikke gir noen ekstra fordel for tick vedlegg. En person mus kan holdes i samme bur for en uke i et utpekt "tick rom" som ytterligere begrenser kontakt med flått med personell.
Modifikasjoner og feilsøking
Produksjon av høy kvalitet, laboratorie oppdratt flått er nødvendig for studier på kryss biologi og kryss-patogen interaksjoner. Tidligere foringsprotokoller brukt tråd opphengt gulvet 8 eller sylindriske beholdere for å holde musene immobile 6, 10 som medfører ekstra kostnader samt stress til dyret. I tillegg gjør det suspenderte ledningskammeret at engorged flåttene faller gjennom ledningen inn i vannet som er forurenset med urin og avføring av musen, og øker dermed risikoen for vekst i mugg.
Begrensninger av teknikken
Som vist i data, oppnådde vi i gjennomsnitt 65% (opptil 92%) flått. Vi fant noen ganger flått i vanngrav utenfor musekassen, men ingen rømte. Klisterbåndet på ytterveggene til den andre beholderen forhindret flåttene å rømme ut.
Betydningen av teknikken med respekt for eksisterende / alternative metoder
Vår protokoll om bruk av skohyllestil med engangsmusburder tillater fri bevegelsesfrihet og viser at mus ikke behøver å være opprettholdt for å tillate kryssfôring. De fleste matte flåttene ble lett sett og samlet inn fra de gjennomsiktige burvene og noen gjenværende flått er lettdetektert blant sengetøy ved enden av matesyklusen. Denne protokollen krever ingen tilpassede museburet, og dermed er det kostnadseffektivt.
Litteraturen antyder at mindre enn 50% av flått feste til mus og ikke alle tilknyttede flått mater til ferdigstillelse. På en gjennomsnittlig, samlet vi ~ 60% engorged larve flått. Vi fant ingen rømt sultne eller matet flått. Av og til har vi funnet én eller to engorged larve flått i vann vollgrav, men ingen på tape. Våre resultater tyder på at ikke alle flått fester seg til verten og kan dø uten fôring. Unfed, døde flått var vanskelig å finne i kullet. Av og til, fant vi også blodflekker på hvitt sengetøy som tyder på at enten mus har drept engorged kryss etter slippe av eller ripete av. Våre data og daglig observasjon av merder foreslår at engorged flått enten flytte opp på buret vegger og toppen av buret eller gjemme seg under senger vekk fra musen rekkevidde. Derfor trenger vedlagte bur ikke har enY negativ innvirkning på tick overlevelse.
Fremtidige applikasjoner eller veibeskrivelser etter å ha behersket denne teknikken
Vår protokoll gir et forenklet alternativ for masseoppdrett av flått uten å legge til ekstra kostnad eller redusere sikkerheten til personell som håndterer dyrene. Fremtidige eksperimenter vil fokusere på å forbedre metoder for fôring av voksne I. scapularis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
