Summary
ההפקה של קרציות מעבדה-שגדל בריאה חיונית מחקרים על ביולוגית קרציה, וסמן-הפתוגן אינטראקציות. כאן אנו מדגימים פרוטוקול פשוט עבור האכלה לתקתק בשלה כי היא חסכונית ופחות מלחיץ לעכברים.
Abstract
Scapularis קרצית, הווקטור של מחלת ליים, הוא אחד וקטורי המחלה החשובים ביותר במזרח ובמערב התיכון ארצות הברית. מין זה הוא קרציה שלושה מארח הדורש ארוחת דם שורה החולייתנים עבור כל שלב פיתוח, והנקבות המבוגרות דורשות ארוחת דם לצורך הרבייה. הזחל קרציות לצרף המארח שלהם במשך 3 - 5 ימים על האכלה להשיל המארח כאשר צבה מלא. תלות זו בכמה צבאות שונים וזמן המצורף הממושך עבור גודש המסבך לתקתק גידול בסביבת המעבדה. עם זאת, כדי להבין ביולוגיה לתקתק וקרציות-הפתוגן אינטראקציות, ההפקה של קרציות בריאה, שגדל-מעבדה חיונית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול פשוט, חסכוני עבור לתקתק בשלה האכלה על עכברים. שינינו את הפרוטוקולים הקיימים עבור מתח ירד על עכברים וגדילה לתקתק האכלת הצלחה והישרדות באמצעות כלובים פנויים ללא תחתית רשת כדי למנוע מגע של Wi קרציותמים מזוהמים עם שתן עכברים וצואה.
Introduction
קרציות הן לחייב ectoparasites hematophagous של בעלי חוליות, ומופצים ברחבי העולם. בארצות הברית, לפחות 11 מינים של קרציות הם וקטורים של פתוגנים חשיבות 1 בריאות הציבור. Scapularis קרצית אחראי להעברת מספר פתוגנים כגון סוכני סיבתי של מחלת ליים (burgdorferi Borrelia) ההתקפי חום (miyamotoi ב), anaplasmosis granulocytic האנושי (phagocytophilum Anaplasma), ו babesiosis (SPP babesia.). למרות החשיבות של I. scapularis כוקטור מחלה, איסוף arachnids אלה בשפע מן פרא ללימודים במעבדה הוא לא תמיד אפשרי. לכן, הפקת קרציות מעבדה-שגדל בריאה חיונית מחקרים על ביולוגית קרציה, וסמן-הפתוגן אינטראקציות.
מחזור החיים של כל קרציות קשה (משפחה Ixodidae), כולל scapularis I., מורכב Activ ביצה ושלושהבשלבי דואר: זחל, נימפה, מבוגר. כל שלב פעיל נזון שורת חוליות. את יחסי הגומלין המורכבים המתרחשים בין קרציות המארחים שלהם על פני כמה ימים של קובץ מצורף והאכלה הם כמעט בלתי אפשריים לשחזר באמצעות מתקני האכלה מלאכותיות, וכן צפויים לספק מספרים מספיקים של הפד קרציות עבור המוני גידול 2, 3, 4. לכן, עכברים וארנבים חיים משמשים לרוב כמארחים לגידול בשלה (זחלים ונימפות), וכן בשלבים בוגרים (מבוגרים) של קרציות, בהתאמה. הדרישה של מארחים מרובים עבור האכלת דם במהלך כל שלב התפתחותי מסבך גידול קרציה, ואת הזמן ועלות 5 אינטנסיבית, 6, 7. רוב פרוטוקולי גידול לתקתק דורשים שמירת עכברים בכלוב רצפת רשת תיל מושעה 7, 8 או CA גליליGE בקנה מידה כזה שהיה החיה לא יכולה לנוע בחופשיות וחתן עצמו 6, 9, 10.
כלובי גלילי אלה מועברים לאחר מכן לכלוב קופסת נעליים עם רשת תיל. צבה, קרציות מנותקת אז נאספים המים מתחת. עם זאת, תוצאות בשיטה זו בחשיפת הפד קרציות למים מזוהמים עם שתן וצואה שיכולה להגדיל את צמיחת פטריות וקרציות תמותה 9. בנוסף, הוא מגביר את האפשרות של בריחת קרצייה מן השוקת כמו גם גורם ללחץ על עכברים. כדי לעקוף את הבעיות הללו, אנו כאן להפגין האכלה לתקתק זחל על עכברים בתוך כלובי הפנויה קופסא נעליים מסוג הפלסטיק. שיטה זו מאפשרת התנהגות נורמלית של עכברים, מגדילה צבה התאוששות קרציה, ומקטין תמותה לתקתק עקב זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול (מספר- 00,682) המפורטים להלן תאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת נבדה רינו והוא פועל בהתאם להנחיות של אוניברסיטת נבאדה, ועדת האתיקה במחקר בבעלי חיים של רינו. בקצרה, עכברים היו מורדמים עם isoflurane ו חרטומו שמש שמירה על רמות isoflurane רציפות במשך 20 דקות. משחת וטרינר שמשה כדי למנוע התייבשות של עיניים בהרדמה. טו קמצוץ שמש כדי לברר את רמת הרדמת קצב נשימה נמדד לאורך כל ההליך. עכברים הוחזקו בכלובים בודדים במעקב עד הכרתו הייתה חזרה. עכברים שימשו רק פעם אחת עבור האכלה התקתוק היו מורדמים התאוששות לתקתק פוסט. המתת החסד בוצע על ידי המעבדה של אנשי צוות רפואת Animal. CO 2 ו נקע בצוואר הרחם שימשו והרדמת חסד בבעלי חיים.
הערה: עבודה על קרציות דורש שימוש EQ מגן אישי שלםuipment. לספירת קרציות בשלה, לובשים חלוקי מעבדה לבן, כפפות ניטריל ארוכה כדי לכסות את הפתח בשרוול מעילו מעבדה כתרים עם גומיות, ונעליים-בוהן סגורה. עבור בזיהום עכברים עם קרציות, השתמשו ברשת שיער, סרבלים חד פעמיים, כפפות ארוך-שרוולים על השרוולים, וכיסויים רגל. השתמש לבן או בהיר סרבל בצבע לזהות קרציות סוררת. בדוק מעת לעת את כפפות ושרוולים קרציות.
חדר 1. הכנות לקראת שיכון Animal
- ציין בחדר נפרד כדי עכברי-עיר שורץ קרציות. שים סרט שטיח מחצלת או דו צדדית דביק מחוץ ובתוך הדלת כדי למנוע בריחה לתקתק בשוגג.
ספירת 2. קרציות עבור עכבר שריצה
- שים דבק דו-צדדי בכל רחבי הקצוות העליונים של 7" X 5" x 14" מיכל פלסטיק וממלאים במים עד כ 2 ס"מ.
- מניחים עוד קופסה קטנה או צלחת פטרי במרכז המיכל וממלאים במים עד 1 ס"מ יצירת &# 34; תעלת "מסביב למכולה זו
- חנות בקבוקון המכיל זחלים או נימפות בתוך צלחת פטרי.
- השתמש במברשת צבע בסדר להסיר זחלים או נימפות מן הבקבוקון לספור תחת המיקרוסקופ. ספירת 50 זחלים או 25 נימפות לתוך בקבוקי נצנוץ נפרדים. מכסים את צלוחיות מיד עם רשת ניילון או מסך בד האורגנדי קרוב עם להקות גומי.
3. התנגשות עכברים עם טיקים בוגרים
- השתמש ספסל עבודה לבן או בהיר צבע מקל סרט דו צדדי סביב היקף של אזור העבודה.
- להרדים את העכבר עם isoflurane. בדוק את רמת ההרדמה על ידי קמצוץ הבוהן. לאחר הרדים, להעביר את העכבר על כרית חימום מכוסה במגבות נייר לצרף חרוט האף עבור המשך אספקת isoflurane.
- החל משחת עיניים מבוססי ג'לי על מנת למנוע יובש. הערה דפוס נשימה של העכבר כדי להתאים את רמות isoflurane (80 - 230 נשימות לדקה הוא נורמלי., להקטין את רמת isoflurane אם breathing שיעור הוא פחות מ 80 נשימות לדקה, כדי למנוע הרג החיה).
- קח בקבוקון אחד של 50 זחלים או 25 נימפות ומקום קרציות מתחת לפרווה על הראש בין האוזניים עם מברשת צבע (איור 1). שמור עכבר בהרדמה עבור 20 דקות לאחר השמה לתת מספיק זמן עבור קרציות לצרף.
- הזז את העכבר כדי בכלוב עכבר פנוי-סוג קופסא נעליים רגיל, פלסטיק עם מכסים סטטי ומצעים לבנים. ספק צעצועים, מים, ו כרצונך מזון לפי טיפול עכבר רגיל.
- אחסן את כלוב העכבר בתוך כלוב חולדה או הגרביל גדול מרופד נייר דבק דו-צדדים סביב קצוות עליונים. מלאו את הכלוב החיצוני עם 3 ס"מ של מים (איור 2).
איסוף 4. קרציות מעכברים
- קרציות לא בוגר לנתק בין ימים 3 ו 6 של האכלה. בדוק את הכלובים ואת חפיר מים עבור קרציות תפוחות כל יום אחרי יום 3.
- אסוף קרציות מנותקת הכלוב בין הימים 4 ו 6. השתמש כאבלא מברשת או מלקחיים רכים להרים קרציות בלויים ולאחסן בקבוקי נצנוץ נקי כתרים עם רשת ניילון בד מאובטחת עם להקות גומי.
- להרדים ולבדוק העכבר ביום 7 עבור כל שאר המצורפת המצורפת.
- בדוק את מצעים, שוקת מזון, בקבוק מים עבור קרציות בלויים ביום 7. להרדים עכברים בעקבות הליך כמתואר לעיל. החיטוי כלובים חד פעמי, מצעים, בקבוק מים, שוקת מזון, כדי למנוע כל בריחות בלתי מנוסחת.
5. אחסון תיקי הפד
- לשמור על קרציות בלוחות בלחות של 90%, 20 ° C, ו 12:12 אור: מחזור כהה לחות טמפרטורה חממה מבוקרת עד ההמולה מתרחשת. התהליך עשוי להימשך בין 12 ל -18 שבועות.
- בעוד לחות גבוהה מקדמת הישרדות קשקשים, זה גם עושה את קרציות נוטה פטרייתיות יתר. בדוק את טדסים מוזן מתחת למיקרוסקופ לפחות פעם בשבוע עבור עובש. אם זוהה, לשטוף ניצולים באתנול 70% עבור 5דקות, לשטוף במים, להעביר נייר מסנן להתייבש, ולהעביר בקבוקונים חדשים, נקיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שינינו פרוטוקולים קיימים הגברת טיק 6 , 10 לשיפור יעילות האכלה ואת הלחץ מופחת על המארח העכבר. התוצאות מראות כי הסטנדרטים סטנדרטיים בסגנון נעל בסגנון העכבר מתאימים לגידול טיק. המצעים הלבנים סיפקו ניגוד טוב לאוסף קל של טדסים מוזנים. רוב קרציות טיפס על הקירות של המכולות לאחר האכלה והיה קל לאסוף. בנוסף, מכסה הדוק של קופסאות פלסטיק חד פעמי (המשמש באופן שגרתי עבור דיור עכברים ב אונר) מנע הבריחה סמן מהקופסה. בנוסף, אנחנו לא לגלח עכברים לתקרית טיק ( איור 1 ). שינויים אלה בפרוטוקולים שפורסמו הביאו לקשר משמעותי של התקרבות, גודש והישרדות.
פרוטוקול זה הוא חסכוני כפי שהוא אינו דורש כל כלובי עכברים מיוחדים מחוץ אלה already בשימוש. זה גם פחות עבודה אינטנסיבית כפי שאנו לא צריכים לאסוף קרציות תפוחות מדי יום. אספנו קרציות בין ימים 4 ו 6 מכת פוסט. רוב קרציות המנותקים ביום 4 וכמה נותרים מנותקים ביום 5. עד יום 7 כל העכברים היו ללא קרציות. הצלחנו לשחזר ממוצע של 67% (טווח 52 - 92%) צבה קרציות זחל (לוח 1). כל העכברים היו בריאים ולא מראה שום סימנים של אי נוחות.
איור 1: האכלת קרצית scapularis זחלים על עכברים. עכברים היו נגועים בנפרד עם 50 קרציות זחל. הקרציות צבה הורידו את העכבר בין הימים 4 - 6. הכלובים נבדקו לכל קרציות הנותרים ביום 7 ו מושלכים לאחר מכן. ת: בזיהום עכברים עם קרציות הזחל יאכילו אותם. B: קרצית הזחל מצרף אל האוזן של עכבר. C: Anתולעת הזחל תולעת המצורפת לאוזן של עכבר, 3 יום שלאחר התפשטות. D: זחלים טמאים לא מפותחים ומלוטשים במלואם.
איור 2: עכבר כלוב להגדיר עבור טיק infestation. שני כלובים עכבר חד פעמי נשמרו בתוך כלוב gerbil. כ -3 ס"מ. מים נוספו לכלוב הגרביל כדי ליצור תעלה. שני צדדי קלטת השטיח דביק היה מודבקת סביב הקצוות העליונים של הכלוב gerbil, כדי למנוע לברוח טיק.
| בעלי חיים (עכבר) | המספר הכולל של קרציות הזחל התאושש | אחוז קרציות הזחל התאושש |
| 1 | 34 | 68% |
| 2 | 32 | 64% |
| 3 | פשרות | 76% |
| 4 | 28 | 56% |
| 5 | 39 | 78% |
| 6 | 26 | 52% |
| 7 | 52 | 92% |
| 8 | 29 | 58% |
| 9 | 29 | 58% |
| 10 | 33 | 66% |
| מְמוּצָע | 66.8% |
טבלה 1: מספר הזרקורים משוחרר Ixodes scapularis משוחזר לאחר התפשטות מעבדה על מארחים עכבר הרדים. כל עכבר היה שורץ 50 זחלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
חשוב יש כמה רמות של אמצעי בטיחות כאשר גידול קרציות כדי למנוע בריחת בשוגג. שימוש סרט דביק וחפיר מים הם קריטיים כדי להבטיח בטיחות. חשוב לשמור על העכבר הרדים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה קבועה בגוף. גם מצאנו כי גילוח העכבר אינו מספק שום תועלת נוספת מצורף לתקתק. עכבר פרט יכול להישמר באותו הכלוב למשך שבוע ב "חדר לתקתק" מיועד אשר קשרו למגבלות נוספות של קרציות עם אנשים.
שינויים ופתרון בעיות
ייצור באיכות גבוהה, קרציות גודלו במעבדה הכרחי ללימודים על ביולוגיה לתקתק וקרציות-הפתוגן אינטראקציות. פרוטוקולי האכלה קודמים המשמש רצפת תיל מושעה 8 או כלובים גליליים לשמור על העכברים נייחים 6, 10 אשר נגרמו עלות נוספת, כמו גם הלחץ על בעלי חיים. בנוסף, בכלוב התיל המושעה מאפשר קרציות התפוחות לנפול דרך החוט למים מזוהמים עם שתן וצואה של העכבר ובכך להגדיל את הסיכון של התפתחות עובש.
מגבלות של הטכניקה
כפי שניתן לראות נתונים, התאוששנו בהצלחה על 65% בממוצע (עד 92%) של קרציות. מצאנו קרציות לעתים חפיר מים מחוץ לכלוב העכבר אבל אף נמלט. הקלטת הדביקה על הקירות החיצוניים של מכל השני מנעה את קרציות לברוח.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
הפרוטוקול של שימוש כלובי עכברים פנויים בסגנון קופסא נעליים שלנו מאפשר טווח ללא תנועה ומדגים כי עכברים לא צריכים להיות מאופקים להתיר האכלה לתקתק. רוב קרציות הפד נראו בקלות שנאספו קירות הכלוב השקופים וכל קרציות נותרים הם בקלותזוהה בין מצעים בסוף מחזור האכלה. פרוטוקול זה אינו דורש כל כלוב העכבר מותאם אישית, ולכן, הוא חסכוני.
בספרות עולה כי פחות מ 50% של קרציות לצרף את העכבר ולא כל המצורפת קרציות להאכיל להשלמת. בממוצע, אספנו ~ 60% זיקוק תולעים הזחל. לא מצאנו כל tcks נמלט או מזין נמלט. מדי פעם מצאנו אחד או שניים קרציות זחל מפושט בחפיר מים אבל אף אחד על סרט דביק. התוצאות שלנו מצביעות על כך שלא כל הקיצורים נצמדים למארח ויכולים למות ללא האכלה. ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: ללא שם: מדי פעם, מצאנו גם כתמי דם על מצעים לבנים, אשר עולה כי העכבר גם הרגו את התווית בלויים לאחר נשירה או גירד. הנתונים שלנו ואת התצפית היומית של כלובים מצביעים על כך טיקסים בלויים או להתקדם על קירות הכלוב ואת החלק העליון של הכלוב או להסתיר מתחת למיטה הרחק להגיע של העכבר. לכן, כלוב סגור איןהשפעה שלילית y על הישרדות לתקתק.
יישומים עתידיים או כיווני אחרי מאסטרינג טכניקה זו
הפרוטוקול שלנו מספק אלטרנטיבה פשוטה לגידול המוני של קרציות מבלי להוסיף עלות נוספת או צמצום בטיחות של אנשי טיפול בחיות. ניסויים עתידיים יתמקדו בשיפור שיטות האכלה scapularis I. הבוגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puralube vet ointment | Amazon | Available from any Pet store or online store | |
| Disposable mouse cage | Innovive, San Diego, CA | MV 2 | Set of bottom and lid |
| White Alpha dri bedding | Lab Supply, Fort Worth, TX | ALPHA-Dri™ |
References
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
